2.8 Исследования на пастереллы: 2.8.1 Навеску корма 25г помещают в колбу с бульоном Хоттингера или

Методические указания по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц /

2.8 Исследования на пастереллы: 2.8.1 Навеску корма 25г помещают в колбу с бульоном Хоттингера или

Методические указания по лабораторной диагностике
пастереллезов животных и птиц

(утв. Главным управлением ветеринарии от 20 августа 1992 г. № 22-7/82)

1. Общие положения

1.1. Пастереллезы – различные по локализации и характеру течения инфекционные болезни сельскохозяйственных, домашних и диких животных, птиц и человека, вызываемые бактериями рода Pasteriolla который включает в себя шесть видов: P.multocida, P.haemolytica, P.ureae, P.pneumotropica, P.aerogenes, P.gallinarum.

1.2. Ведущее этиологическое значение в инфекционной патологии животных и птиц принадлежит двум видам: P.muluocide, P.haemolytice.

P.muluocida является возбудителем геморрагической септицемии животных, холеры птиц, а также легочных пастереллезов, осложняющих респираторные инфекции вирусной и микоплазменной этиологии.

P.haemoytica вызывает у крупного рогатого скота и овец всех возрастов пневмонии, а также септицемию новорожденных ягнят.

Кроме перечисленных заболеваний эти два вида могут выделяться у коров и свиноматок при абортах, у овец и коров – при маститах, у телят и ягнят – при артритах и других локальных патологических процессах.

1.3. Краткие сведения о других видах пастерелл.

P.pneumotropica является возбудителем энзоотического заболевания мышей, кроликов и других лабораторных грызунов, которое проявляется поражением органов дыхания и образованием абсцессов.

P.ureae часто выделяют от человека при хроническом атрофическом насморке.

P.gallinarum встречается как комменсал верхних дыхательных путей птиц и иногда крупного и мелкого рогатого скота; имеет низкую вирулентность и чаще ассоциирует с хроническими респираторными инфекциями птиц.

P.aerogenes является постоянным обитателем кишечного тракта свиней.

1.4. Диагноз на пастереллезы устанавливают на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторного исследования.

1.5. Лабораторная диагностика пастереллезов включает микроскопию мазков и отпечатков, выделение культур пастерелл и их идентификацию и при необходимости постановку биопроб.

1.6. Для исследования в лабораторию направляют 2 – 3 трупа мелких животных, от крупных животных – сердце с перевязанными сосудами, части селезенки, печени, почек, экссудат из грудной полости и трубчатую кость. При поражении легких берут также их кусочки (5×5 см) на границе нормального и измененного участков, миндалины, бронхиальные, средостенные и заглоточные лимфатические узлы.

Патологический материал берут от павших (не позднее 3 – 5 ч после гибели) или убитых животных, не подвергавшихся лечению антибактериальными препаратами.

Для диагностики пастереллеза у птиц в лабораторию направляют, кроме свежих трупов, 5 – 6 живых птиц с явными признаками болезни. Больную птицу убивают в лаборатории и делают высевы из костного мозга, сердца, печени и селезенки.

1.7. Взятие и доставку материала осуществляют в соответствии с действующими Правилами взятия патологического материала, крови, кормов, и пересылки их для лабораторного исследования.

2. Выделение и идентификация культур

2.1. посевы из патологического материала, перечисленного в п. 1.6, делают в МПБ и на МПА или бульон и агар Хоттингера рН 7,2 – 7,4 с добавлением 10 % нормальной сыворотки крови лошади (см. приложение пп. 1 – 4) или 5 – 10 % аминопептида-2.

2.1.1. Посев в пробирки с жидкими и твердыми питательными средами проводят пастеровской пипеткой. Пробирки с посевами инкубируют при 37 – 38° в течение 20 – 48 часов.

2.1.2.

Одновременно с посевами из каждого органа делают мазки-отпечатки, фиксируют 10 – 15 мин смесью равных объемов этилового спирта и эфира, окрашивают по Леффлеру или Романовскому-Гимза и микроскопируют.

В мазках из патологического материала пастереллы выглядят овоиды или короткие палочки с закругленными концами и заметной биполярностью, вокруг которых может быть видна прозрачная капсула.

2.2. В жидких питательных средах рост пастерелл сопровождается сначала слабым помутнением, затем через 24 – 36 часов возможно просветление среды и выпадение на дно пробирки осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички.

На сывороточном агаре или агаре с аминопептидом-2 пастереллы растут в виде прозрачных, средней (диаметром до 3 мм), округлых с ровными краями колоний слизистой консистенции, серого цвета.

На простых питательных средах без добавления сыворотки крови пастереллы растут не всегда удовлетворительно.

У выделенных культур изучают культуральные, тинкториальные и морфологические свойства. В мазках из культур при окраске по Граму пастереллы имеют вид грамотрицательных овоидов или коккобактерий, расположенных одиночно и попарно.

Идентификацию выделенных культур проводят по ферментативным свойствам и подвижности.

2.3.1. Суточную агаровую культуру высеевают в среды Гисса с глюкозой, маннитам, сахарозой, маннозой, в ПМА, молоко, желатин, на кровяной сывороточной МПА или агар Хоттингера (см. приложение п. 5), в МПБ с 1 % нитрата калия, в среду с мочевиной (см. приложение п. 6).

2.3.2. Для определения редукции нитратов исследуемые культуры засевают в МПБ с 1 % нитрата калия и выращиванием в течение 48 – 72 ч.

Затем в пробирку добавляют 1 см3 2 %-ного водного раствора крахмала, 1 см3 1 %-ного раствора йодистого калия и 1 – 2 капли 5 %-ного водного раствора серной кислоты и взбалтывают.

При положительной реакции среда приобретает окраску от темно-синего до коричневого цвета; при отрицательной – цвет среды желтый или слабо синий.

2.3.3. Индол выявляют с помощью индикаторных бумажек или по методу Легаль-Вейла. Индикаторные бумажки готовят из полосок фильтровальной бумаги длиной 10 – 12 см, пропитывая их горячей щавелевой кислотой, высушивают в термостате и хранят в банке с притертой пробкой.

С целью выявления индола в пробирку с МПБ после засева культуры под ватную пробку помещают полоску индикаторной бумажки с таким расчетом, чтобы нижний ее конец не касался среды, и инкубируют при 37 °С 24 – 72 ч. При выделении индола нижняя часть бумажки приобретает розовую окраску.

Метод Легаль-Вейла. В пробирку с суточной бульонной культурой пастерелл вносят 4 – 5 капель 5 %-ного водного раствора нитропруссида натрия, перемешивают и добавляют вначале такой же объем 40 %-ного водного раствора N2OH, а спустя 1 – 2 мин 4 – 5 капель ледяной уксусной кислоты. При наличие индола бульонная культура приобретает сине-зеленую окраску.

2.3.4. Для определения уреазы в пробирку, содержащую среду с мочевиной, закапывают 2 – 3 капли 24-часовой изучаемой бульонной культуры. Посевы культивируют 20 – 24 ч. при 37 °С. При наличии фермента уреазы происходит покраснение среды.

2.3.5. Все виды пастерелл неподвижны, не свертывают молоко, не разжижают желатин, редуцируют нитраты, ферментируют с образованием кислоты без выделения глаза глюкозу, маннозу, сахарозу.

P.agrogenes в отличие от других видов ферментирует углеводы с выделением газа.

На кровяном сывороточном МПА или агаре Хоттингера P.haemolytica образует колонии с отчетливой зоной гемолиза, которая лучше просматривается после снятия колонии со среды. Остальные виды пастерелл гемолиза не вызывает.

2.3.6. Основные дифференцирующие признаки видов рода пастерелла представлены в таблице.

ПризнакиP.multocidaP.pneumotropicaP.haemolyticaP.ureaeP.aerogenesP.gallinarum
Гемолиз на кровяном агаре+
Образование индола++
Наличие уреазы+++
Ферментация маннита+++

Условные обозначения:

«+» – результат положительный

«-» – результат отрицательный

2.4. Дифференциация серовариантов Р.

2.4.1. Изучаемую 18-часовую бульонную культуру бактериологической петлей высевают на чашку Петри со свежеприготовленным 1,5 %-ным агаром Хоттингера. Посев проводят, не отрывая петли от поверхности агара, параллельными штрихами на расстоянии 7 – 10 мм один от другого.

Затем бактериологической петлей одним штрихом по диаметру чашки, перпендикулярно нанесенным штрихам, высевают суточную бульонную культуру Staphylococcus aureus (культура должна обладать хорошей гемолитической активностью, что определяют высевом ее на кровяной сывороточный МПА).

Чашки с посевами инкубируют при 37 °С и через 18 – 24 час учитывают результаты.

Штаммы, образующие вблизи (до 5 мм) от линии роста стафилококка более мелкие колонии, чем на удалении от этой линии, относятся к сероварианту А. Кроме того колонии P.multocida сероварианта А, растущие вблизи стафилококка, при просмотре в проходящем свете имеют окраску в отличие от остальных флуоресцирующих колоний. Размер колоний серовариантов В и Д в данном тесте не изменяются.

2.4.2. Исследуемую бульонную культуру (5 – 6 см3) центрифугируют при 3000 об/мин.

Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспензируют в оставшейся в пробирке надосадочной жидкости до получения гомогенной суспензии. К полученной суспензии приливают 0,5 см3 водного свежеприготовленного раствора акрифлавина 1:1000 и тщательно перемешивают.

Штаммы, относящиеся к сероварианту Д, в течении 10 – 15 мин после добавления раствора акрифлавина образуют крупнохлопчатый неразбивающийся при встряхивании флоккулят. Кроме штаммов P.multocida сероварианта Д, флоккулят могут образовывать диссоциированные культуры других серовариантов, но в этом случае флоккулят мелкохлопчатый и легко разбивается при встряхивании.

Сероварианты Ф и В дают отрицательную реакцию флоккуляции.

2.4.3. Штаммы P.multocida, не обладающие указанными выше свойствами, относятся к сероварианту В.

3. Биологическое исследование

3.1. Биологическое исследование проводят для определения патогенности выделенной культуры пастерелл и при необходимости с целью обнаружения возбудителя в патологическом материале.

3.2. Патогенность культур определяют на белых мышах массой 16 – 18 °С этой целью двум белым мышам вводят подкожно по 0,2 см3 18 – 24 – часовой бульонной культуры.

Вирулентные штаммы P. multocida, относящиеся в основном к сероварианту В и являющиеся возбудителями геморрагической септицемии, вызывают гибель зараженных белых мышей в течении 24 – 72 час; слабовирулентные штаммы серовариантов А и Д, участвующие в развитии пневмоний – через более продолжительный срок (до 7 сут.).

P.haemolytica может вызвать гибель белых мышей только при внутрибрюшинном заражении. Остальные виды пастерелл, как правило, для лабораторных животных непатогенны.

3.3. Патогенность культур, выделенных от птиц, проверяют на белых мышах или цыплятах. Суточную бульонную культуру вводят двум белым мышам внутрибрюшинно по 0,2 см3 или двум цыплятам 90 – 120 – дневного возраста внутримышечно по 1,0 см3.

3.4. Для обнаружения возбудителя пастереллеза в патологическом материале суспензий из органов (см. п. 1.6) заражают двух белых мышей подкожно в дозе 0,2 см3. При этом надо учитывать, что не все виды пастерелл, играющие роль в патологии сельскохозяйственных животных, вызывают гибель зараженных белых мышей.

3.5. Культуру считают патогенной, а биопробу положительной при гибели через 24 – 72 ч хотя бы одного из зараженных животных и выделении от него культуры пастерелл.

3.6. Срок наблюдения за зараженными животными – 7 сут.

4. Диагноз считают установленным в случае:

– выделение из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя пастереллеза, и установления ее патогенности на лабораторных животных;

– гибели хотя бы одного лабораторного животного из двух зараженных исходным материалом и выделения из его органов культуры со свойствами, характерными для возбудителя пастереллеза, если даже в посевах из исходного материала культуры возбудителя не выделено.

С утверждением настоящих методических указаний утрачивают силу Наставления по лабораторной диагностике пастереллеза птиц, рекомендованные Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 20.05.75 г.

Приложение

К Методическим указаниям по Лабораторной диагностике

Пастереллезов животных и птиц.

Рецепты приготовления питательных сред

1. Сывороточный мясо-пептонный бульон.

В качестве основы используют мясо-пептонный бульон рН 7,2 – 7,4, к которому, соблюдая правила асептики, добавляют 10 % стерильной без консерванта сыворотки крови лошади.

2. Сывороточный мясо-пептонный агар.

В качестве основы используют 2,0 – 2,5 %-ный мясо-пептонный агар, рН 7,2 – 7,4 расплавленный и охлажденный до 45 – 50 °С, к которому, соблюдая правила асептики, 10 % стерильной сыворотки крови лошади без консерванта. Смесь тщательно перемешивают, следя за тем, чтобы не образовывалась пена, и разливают в чашки Петри.

3. Сывороточный бульон Хоттингера.

Для приготовления бульона основой перевар Хоттингера разводят дистиллированной водой до содержания в нем 180 – 200 мг % аминного азота, добавляют 0,5 % хлорида натрия, 0,1 % двузамещенного фосфата калия (K2НРО4), устанавливают рН 7,2 – 7,4 и кипятят 15 – 20 мин.

Приготовленный таким образом бульон фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при 120 °С в течение 20 – 30 мин. Перед употреблением к бульону Хоттингера добавляют 10 % неинактивированной стерильной сыворотки крови лошади.

4. Сывороточный агар Хоттингера.

К бульону Хоттингера добавляют 2,0 – 2,5 % мелконарезанного агар-агара, после его набухания ставят на огонь и кипятят до полного растворения агара, постоянно помешивая во избежания пригорания.

По окончании кипячения следует восстановить объем среды добавлением горячей дистиллированной воды. После установления нужного рН агар кипятят дают отстоятся в теплом месте, чего фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Осадок на фильтр не выливают. Разливают во флаконы и стерилизуют 30 мин при 1 атм.

Перед употреблением к расплавленному и охлажденному до 40 – 45 °С агару добавляют 10 % стерильной сыворотки крови лошади и разливают в чашки Петри.

5. Кровяные сывороточные МПА и агар Хоттингера.

Разливают определенное количество МПА и агара Хоттингера, охлаждают до 45 °С и прибавляют 5 % стерильной сыворотки крови лошади. После тщательного перемешивания добавляют 5 – 7 % дефибринированной стерильно взятой крови барана. Готовую среду разливают в чашки Петри и дают ей застыть. Слой питательной среды должен быть равномерно окрашен в красный цвет.

6. Среда с мочевиной.

В 100 см3 дистиллированной воды растворяют: 1 г пептона, 5 гр хлорида натрия, 1 гр глюкозы, 2 гр однозамещенного фосфорнокислого калия (KНРО), 20 гр мочевины, добавляют 6 см3 0,2 %-ного водного раствора фенолового красного и устанавливают рН 6,8 – 6,9. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин.

К 900 см3 дистиллированной воды добавляют 15 гр агар-агара и стерилизуют при 120 °С 30 мин. Охлаждают до 40 – 45 °С и смешивают со 100 см3 раствора упомянутого выше. Разливают в стерильные пробирки и скашивают. Цвет готовой среды желтовато-зеленый.

7. Среда для определения редукции нитратов.

В 1000 мл свежеприготовленного МПБ растворяют 2 гр нитрата калия (KNО3), разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 1 атм. (120 °С) 15 мин. Готовая среда имеет желтоватый цвет.

Заместитель начальника Главного управления ветеринарииВ.М. Авилов

СОДЕРЖАНИЕ

Источник: https://files.stroyinf.ru/Data2/1/4293736/4293736604.htm

Правила бактериологического исследования кормов (утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 10 июня 1975 г.) | ГАРАНТ

2.8 Исследования на пастереллы: 2.8.1 Навеску корма 25г помещают в колбу с бульоном Хоттингера или

2. Методы бактериологического исследования

2.1. Определение общего количества микробных клеток.

2.1.1. В стерильную пробирку помещают 1 г корма, взятого из среднего образца (взятие корма для навески одноразовое), добавляют 9 мл физиологического раствора и тщательно встряхивают (получают разведение 1 10). Из полученной взвеси готовят последующие разведения (1 100, 1 1000, 1 10 000, 1 100 000, 1 1 000 000). После оседания взвешенных частиц из верхнего слоя жидкости делают посевы.

Для количественного учета микробного обсеменения в стерильные бактериологические чашки вносят по 1 мл каждого разведения и заливают 10-15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44-45°С мясо пептонного агара. Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 37°С.

После 24-48-часового термостатирования проводят подсчет выросших колоний только в чашках, где содержатся не более 300 колоний. Результаты, полученные при подсчете котонин, умножают на разведения, суммируют и определяют количество микробов в 1 г корма.

Например, в одной чашке оказалось 200 колоний, в другой – 21 и в третьей – 1. В эти чашки посев проводили из пробирок с разведениями соответственно – 1 10 000, 1 100 000, 1 1000 000. Следовательно, 1 г корма содержит

млн микробных клеток.

Определение общей бактериальной обсемененности мясо костной муки можно проводить экспрессным методом с применением peзазурина.

Для этого в стерильную пробирку помещают 1 г мясо костной муки, взятой из среднего образца, добавляют 10 мл МПБ и встряхивают, а в другую пробирку для контроля вносят только 10 мл МПБ и помещают их в термостат при 40°С на 2 часа. После этого в пробирки добавляют по 1 мл 0,01%-ного раствора резазурина и вновь выдерживают в термостате в течение двух часов.

Результаты реакции учитывают в этот период через каждые 30 минут. По восстановлению резазурина (изменение окраски от синего до розового цвета) определяют общую микробную обсемененность мясо-костной муки.

Если в пробирке с мясо-костной мукой наступает розовое окрашивание позднее 2 часов, эго соответствует бактериальной обсемененности до 500 тыс. микробных клеток в 1 г продукта, а при окрашивании содержимого пробирки в розовый цвет до 2 часов – более 500 тыс.

Контролем служит пробирка с 10 мл МПБ и 1 мл 0,01%-ного раствора резазурина, выдержанная в термостате при том же температурном режиме и экспозиции и без изменения цвета содержимого.

2.2.1. Метод последовательного обогащения.

Навеску исследуемого материала 50-200 г (50 г от 10 и менее, 100 г от 10 до 100 и 200 г от 101 и выше упаковочных единиц) измельчают в стерильной фарфоровой ступке и вносят в колбу, содержащую среду предварительного обогащения (пептонная вода, МПБ с содержанием 5% маннита) при соотношении материала и среды 1:5.

Содержимое колбы тщательно перемешивают и ставят в термостат при температуре 37°С.

Через 16-18 часов производят посевы на бактериологические чашки с твердыми дифференциально диагностическими средами висмут сульфит агар, средой Плоскирева или Левина (по две чашки) и на две (по выбору) основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду, среды Киллиана, Мюллера, Кауфмана) в соотношении 1:5. Лучшими являются селенитовый бульон и магниевая среда.

После 16-18 часового выдерживания в термостате при 37°С из обогатительных сред бактериологической петлей производят вторично посевы на чашки с твердыми дифференциально диагностическими средами, которые помещают в термостат при 37°С Засеянные чашки просматривают через 16, 24, 48 часов.

На висмут сульфит агаре S typhi и S paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром, S choleraesuis – в виде зеленых колоний Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, цвет участка среды под колонией черный.

На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде прозрачных или нежно-розовых котонип, на среде Левина – в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.

В случае обнаружения колоний, подозритетьных на сальмонеллы, 3-5 из них засевают на комбинированную среду Рассела или на двухсахарный (лактоза, глюкоза) агар, а лучше на трехсахарный (лактоза, глюкоза, сахароза) “скошенный столбик” с мочевиной.

Высев колонии из чашек также делают на короткий пестрый ряд, включающий скошенный агар и среды Гисса с лактозой, глюкозой и сахарозой, а также на бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода (в этих целях под пробку пробирки с бульоном вкладывают специальные индикаторные бумажки). Для определения подвижности культуры производят посев уколом в полужидкий агар (0,3-0,5%).

На среду Рассела и “скошенный столбик” посевы летают сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. При разложении лактозы косая поверхность окрашивается в синий цвет (при индикаторе ВР).

При разложении одной глюкозы окрашивается только столбик среды и происходит разрыв агара со скоплением в нем пузырьков газа.

При разложении мочевины в “скошенном столбике” окраска среды меняется на оранжевую при индикаторе ВР и на коричнево-фиолетовую при индикаторе тимоловый синий в сочетании с индикатором Андраде. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°С 16-18 часов.

Культуры, ферментирующие лактозу, глюкозу и сахарозу с образованием газа и расщепляющие мочевину, отбрасывают. Культуры, не ферментирующие лактозу и сахарозу и не расщепляющие мочевину, подлежат дальнейшему исследованию. Изучают морфологию культуры в мазке, окрашенном по Граму, и подвижность (в висячей или раздавленной капле или в полужидком агаре).

Культуры грамотрицательных подвижных палочек, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, подвергаются серологическому исследованию в реакции агглютинации на предметном стекле с набором агглютинирующих сывороток.

Для реакции агглютинации используют культуры, выращенные на среде Рассела или на двухсахарном или трехсахарном агарах. При этом для реакции агглютинации с О-сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н-сыворотками – из самой нижней частти (конденсационном воды), где микробы наиболее подвижны.

Исследование культуры начинают реакцией агглютинации с поливалентной адсорбированной О-сывороткой основных серологических групп А, В, С, D, Е.

На предметное стекло наносят каплю сыворотки и культуры, тщательно смешивают и в течение 2 минут наблюдают склеивание (агглютинацию) частиц. Культуры, дающие положительную реакцию агглютинации с поливалентной сывороткой, также проверяют с монорецепторными агглютинирующими сыворотками.

Сначала с помощью монорецепэторных О-сывороток устанавливают принадлежность культур к той или иной серологической группе.

Установив серологическую группу, к которой отнесена данная культура, последнюю проверяют монорецепторными Н-сыворотками сначала первой фазы, а потом второй, определяя таким образом серологический тип бактерии в соответствии со схемой Кауфмана – Уайта.

2.3 Метод двойного центрифугирования.

2.3.1. Первый день исследования. К 100 г исследуемого корма, помещенного в стерильную колбу, добавляют 500 мл физиологическою раствора, энергично взбалтывают в течение 5 минут и ставят в термотат при температуре 37°С.

Через 6-8 часов колбу вынимают из термостата, встряхивают, затем содержимое отстаивают в течение 5-10 минут.

Набирают 20-25 мл надосадочной жидкости, вносят в 4 центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 20 минут при 4000 об/мин.

Надосадочную жидкость из центрифужных пробирок сливают и к осадку добавляют среды обогащения Киллиана, Мюллера, жидкую среду Плоскирева (но не менее двух). После тщательного перемешивания осадка со средой пробирки помещают в термостат при температуре 37°С на 5-6 часов для подращивания микрофлоры осадка. После этого пробирки вновь центрифугируют при тех же режимах.

Из центрифужных пробирок производят посевы на плотные дифференциально-диагностические среды висмут сульфит агар и среду Плоскирева, для чего из каждой пробирки материал отбирают пастеровскими пипетками и вносят на 2-3 чашки по 1-3 капли и равномерно распределяют его шпателем по всей поверхности среды. Засеянные чашки помещают в термостат.

К оставшемуся в центрифужных пробирках осадку добавляют ту же обогатительную среду, которая была удалена после центрифугирования, и продолжают инкубацию до следующего дня. Колбы с кормом после отбора необходимого количества материала оставляют в термостате также до следующего дня.

2.3.2. Второй день исследования. Из верхнего слоя обогатительных сред центрифужных пробирок (без встряхивания) и колб после 18-24-часового выдерживания в термостате при 37°С производят посевы на плотные среды. Затем просматривают посевы, произведенные в первый день исследования.

С выросшими на плотных средах колониями, подозрительными на сальмонеллы, ставят реакцию агглютинации на предметных стеклах с поливалентной сальмонеллезной О-сывороткой.

Культуры, давшие положительную реакцию агглютинации, проверяют с монорецептерными О-сыворотками и устанавливают принадлежность культур к той или иной серологической группе.

Определение биохимических свойств культур проводят ускоренным методом, для чего применяют пастеровские пипетки, в которые насасывают каплю взвеси исследуемой культуры, а затем небольшое количество тех или иных углеводов. Результаты учитывают по ферментации углеводов после выдерживания пипеток в термостате при 37°С в течение 2-3 часов.

2.3.3. Третий день исследования. Производят просмотр чашек с твердыми средами, засеянными во второй день исследования, и проверяют биохимические и серологические свойства выделенных культур для определения серологического типа бактерий в соответствии со схемой Кауфмана – Уайта.

2.4. Люминесцентный метод обнаружения сальмонелл.

2.4.1. Из средней пробы берут 100 г корма, разводят стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:5 и выдерживают в термостате 6-8 часов при температуре 37°С.

Из полученной смеси готовят 2 мазка на обезжиренных стеклах нанесением суспензии бактериологической петлей на площадь 1 , обозначенную восковым карандашом на обратной стороне.

Мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в термостате, фиксируют этиловым спиртом 15 минут и ополаскивают дистиллированной водой в течение 5-10 секунд.

2.4.2. На высушенные мазки, помещенные на мостик бактериологических чашек с влажным тампоном (для предотвращения высыхания сыворотки), наносят 1-2 капли рабочего разведения люминесцирующей поливалентной сальмонеллезной сыворотки.

При необходимости определения групповой принадлежности сальмонелл применяют групповые люминесцирующие сальмонеллезные сыворотки. Мазки выдерживают во влажной камере в течение 30 минут при комнатной температуре или 15 минут в термостате при 37°С.

Затем мазки дважды по 10 минут промывают 0,15 М раствором хлористого натрия, ополаскивают дистиллированной водой и вновь высушивают.

2.4.3. Окрашенные мазки заключают в смесь, состоящую из 9 частей глицерина и 1 части 0,15 М раствора хлористого натрия, накрывают покровным стеклом, на которое наносят каплю нефлюоресцирующего иммерсионного масла или диметилфталата, и просматривают под люминесцентным микроскопом.

2.4.4. Положительным результатом считается обнаружение сальмонелл, у которых отмечается сияющая или яркая флюоресценция зеленого цвета периферии клеток с четко контрастируемой зоной по центру.

В качестве контроля берут сальмонеллезную культуру, наносят ее на предметное стекло и к ней добавляют люминесцирующую сыворотку.

2.5. Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки.

2.5.1.

50 г корма помещают в колбу, содержащую 500 мл стерильного физиологического раствора, встряхивают на шуттель-аппарате в течение 30 минут и из полученной взвеси стерильными пипетками готовят разведения 1:100, 1:1000, 1:10 000, 1:100 000, 1:1 000 000. По 1 мл каждого разведения вносят в пробирки (по выбору) со средами Эйкмана, Кесслера или Кода. Посевы помещают в термостат при температуре 43°С для первых двух сред и при 37° С – для последней.

Через 24 часа учитывают рост: на среде Эйкмана – по помутнению среды и образованию газа, на средах Кесслера и Кода – по изменению цвета сред. Титр кишечной палочки устанавливают по наибольшему разведению, в котором еще наблюдался ее рост.

Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев на плотные дифференциально-диагностические среды Эндо, Левина в бактериологических чашках, разделенных на секторы для каждого разведения.

Типичные колонии Е. coli характеризуются круглой формой, гладкой, выпуклой или слегка приподнятой в центре поверхностью, ровными краями, розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском или без него на среде Эндо или черного цвета на среде Левина.

2.5.2. Выросшие изолированные колонии S-формы (не менее 4) пересевают на МПБ, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 16-24 часов.

После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды, заражения мышей; вторую – для приготовления автоклавированного антигена, если кипяченый антиген не будет агглютинироваться поливалентными (комплексными) коли-сыворотками.

У выделенных культур определяют морфологические и культурально-биохимические свойства с целью проведения их родовой дифференциации, как указано в приложении 1.

Морфологию бактерий изучают в мазках, окрашенных по Граму, подвижность определяют по характеру роста в 0,3%-ном полужидком МПА.

2.5.3. Для определения культурально-биохимических свойств бактерий используют набор питательных сред, куда входят среды с углеводами и индикатором Андраде (лактоза, глюкоза, сахароза, маннит, дульцит, адонит, инозит), среда Кларка, цитратно-аммонийная среда, МПЖ, среда с мочевиной, МПБ или бульон Хоттингера и агар с глюкозой и сернокислым железом.

2.5.4. Патогенные свойства кишечной палочки определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах.

С этой целью внутрибрюшинно заражают трех мышей массой 14-16 г смывом с суточных агаровых культур, в дозе 500 млн микробных тел. Концентрацию бактерий устанавливают по бактерийному стандарту.

Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей в первые четверо суток после заражения.

2.5.5. Одновременно с определением морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств бактерий проводят серологическую типизацию культур кишечной палочки по О-антигену с целью установления энзоотических типов.

Для приготовления антигена каждую предназначенную для типизации суточную агаровую культуру (пробирка со скошенным агаром) смывают стерильным физиологическим раствором, доводят суспензию бактерий до концентрации 5-6 млрд/мл и кипятят в водяной бане в течение 1 часа. Уровень воды должен быть выше уровня культуры в пробирках.

На чистое обезжиренное стекло наносят пастеровской пипеткой по капле каждой комплексной О-сыворотки, разведенной физиологическим раствором 1:5, и по капле исследуемого антигена. Затем хорошо перемешивают стеклянной палочкой или петлей. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 3 минут при покачивании стекла.

В том случае когда антиген агглютинируется всеми комплексными сыворотками, его проверяют с физиологическим раствором для исключения самоагглютинации. Самоагглютинирующие антигены для серотипизации непригодны.

Антигены, давшие четко выраженную агглютинацию на стекле с комплексной коли-сывороткой, исследуют в капельной реакции агглютинации (РА) с отдельными разведенными 1:10 типоспецифическими сыворотками, входящими в состав комплексной сыворотки.

2.5.6. Если антиген из исследуемой культуры агглютинируется в капельной РА с одной или двумя-тремя моносыворотками, то его проверяют с этими же сыворотками в пробирочной РА, так как реакция на стекле имеет лишь ориентировочное значение.

Для постановки пробирочной РА типоспецифические О-сыворотки, агглютинирующие антиген из исследуемой культуры в РА на стекле, разводят физиологическим раствором, начиная с 1:100 до предельного титра сыворотки, указанного на этикетке, и во все пробирки добавляют по 2 капли антигена (концентрация 5-6 млрд бактериальных тел но бактерийному стандарту), приготовленного из убитой нагреванием агарной культуры обнаруженных бактерии.

Одновременно ставят контроли 1 Антиген + физиологический раствор (для исключения самоагглютинации) и 2 Сыворотка, разведенная 1:100, без антигена (для исключения явления флоккуляции).

Штатив с пробирками встряхивают и ставят в термостат при 37°С на 12-16 часов, затем выдерживают при комнатной температуре 18-24 часа. Реакцию учитывают с помощью лупы или агглютиноскопа.

Принадлежность к О-группе определяют по наивысшему разведению типоспецифической агпютннирующей сыворотки, вызывающей агглютинацию антигена исследуемой культуры, которое должно быть не ниже половины предельного титра типоспецифической сыворотки.

Сыворотка и антиген в контроле не должны образовывать хлопьев.

2.5.7 Если все комплексные О-коли-сыворотки в капельной реакции не агглютинируют антиген из убитой нагреванием культуры, то готовят из этого штамма суспензию бактерий и автоклавируют ее при давлении пара 1 атмосфера (120°С) в течение 2 часов дня разрушения термостабильного А-антигена Автоклавнрованный антиген исследуют с сыворотками 08, 09, 0101, как указано в п. 2.5.5.

2.6. Исследования на анаэробы.

2.6.1. 50 г корма растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором и засевают в несколько пробирок со средой Китта – Тароцци, молоком и по две чашки со средами Вильсона – Блера и кровяным агаром по Цейслеру.

Для уничтожения вегетативных форм по одной пробирке с жидкими средами прогрезают при температуре 80°С в течение 20 минут. Посевы помещают в термостат при температуре 37°С.

Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной поглотитель кислорода.

2.6.2. Результаты посевов регистрируют в первый же день. Почернение среды Вильсона – Блера в течение 1-3 часов после посева, свертывание молока с образованием ноздревато-губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6 часов, а также быстрое начало роста на среде Китта – Тароцци (через 4-5 часов) при обильном газообразовании является характерным для клостридиум перфрингенс.

Рост ктостридиум ботулинум, наблюдаемый обычно на 2-3-й день, характеризуется помутнением среды Китта – Тароцци, образованием осадка и запахом прогорелого масла.

При обнаружении роста на среде Китта – Тароцци производят микроскопическое исследование и выделение чистой культуры посевом на 2-3 чашки с кровяным агаром по Цейслеру, которые выдерживают в анаэробных условиях при температуре 37°С в течение 24-48 часов, после чего просматривают рост в чашках и отбирают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам, указанным в приложении 2.

Биологическую пробу проводят на морских свинках или белых мышах путем внутрибрюшинного заражения бульонной культурой. При положительном результате подопытные животные гибнут через 12-48 часов.

2.6.3. Для идентификации отдельных возбудителей или типов одного вида ставят опыт нейтрализации токсина специфической сывороткой.

Для этого минимальную смертельную дозу культуры в смеси с 0,2-0,5 мл соответствующей типоспецифической сыворотки выдерживают в термостате 45 минут и вводят мышам внутрибрюшинно.

Для контроля испытуемую культуру или фильтрат вводят мышам без сыворотки. Вид и тип микроба определяют по выживаемости мышей, получивших соответствующую сыворотку.

2.6.4. При исследовании кормов на ботулизм (наличие токсинов) в качестве подопытных животных используют белых мышей. При этом могут быть применены два способа.

а) нейтрализация токсина противоботулиновой сывороткой (антитоксином). Корм предварительно растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором (1:4) и настаивают в течение 1-2 часов при комнатной температуре.

Настой центрифугируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К 0,5 мл фильтрата добавляют 0,2 мл поливалентной противоботулиновой сыворотки.

Cмесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, затем одному животному вводят подкожно 0,5 мл фильтрата, другому – смесь фильтрата с сывороткой в той же дозе.

Аналогичное исследование может быть проведено с 6-7 суточной культурой, выращенной на печеночном бульоне. В этом случае пастеровской пипеткой отсасывают верхний слой культуры, который фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Далее поступают, как указано выше,

б) разрушение токсина кипячением фильтрата. Фильтрат готовят, как указано в подпункте “а” п. 2.6.4. Одну половину фильтрата кипятят в течение 30 минут. Затем одному животному внутрибрюшинно вводят 0,5-1,0 мл некипяченого фильтрата, другому – в этой же дозе прокипяченного.

2.6.5. Положительным результатом биологической пробы по первому и второму способам считают гибель мышей, наступившею как от фильтрата, не обработанного противоботулиновой сывороткой, так и от фильтрата, не подвергнутого кипячению.

Источник: https://base.garant.ru/70582510/

Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса

2.8 Исследования на пастереллы: 2.8.1 Навеску корма 25г помещают в колбу с бульоном Хоттингера или

Для приготовления плотной среды Хоттингера с триптоном, глюкозой и дрожжевым экстрактом в 1 дмЗ бульона Хоттингера вносят 0,5 г дрожжевого экстракта или 2,5 смЗ раствора дрожжевого экстракта, 5 г глюкозы, 5 г триптона, 15-20 г агара, устанавливают рН среды (7,1+0,1) и стерилизуют ее при температуре (121±1)°С в течение 20 мин. Перед употреблением в расплавленную стерильную среду асептически вносят 0,6 г аскорбиновой кислоты.

Приготовление среды Крумведе-Олькеницкого в модификации Ко-валъчука

В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют I г гипосульфита, 0,6 г соли Мора, 10 г мочевины, 15 г лактозы х.ч., 3,5 г сахарозы и 2 г глюкозы. Устанавливают рН среды до 7,4 – 7,6. Добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором ВР.

Все размешивают, кипятят в водяной бане в течение 40 мин. Разливают в пробирки по 5 – 6 см3. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют 20 мин при давлении 5104 Па.

После стерилизации среду скашивают так, чтобы в пробирке остался столбик высотой не менее 3 см.

Приготовление среды ХБ (хинозол-бромкрезол-пурпурной)

Для приготовления бромкрезол-пурпура 0,8 г порошка заливают 50 см3 этилового ректификованного спирта. Через день раствор готов к употреблению.

Для приготовления хинозола 0,1 г порошка растворяют в 100 см3 стерильной дистиллированной воды.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Глубинный метод посева в плотные среды.

Жидкий продукт или разведение навески вносят параллельно в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры (45±1)°С питательной средой. Высота слоя питательной среды должна быть 4—5 мм.

Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки н не загрязняла крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.

Поверхностный метод посева на плотные среды.

Среду налипают в чашку Петри и после застывания подсушивают. При подсушивании для удаления влаги с поверхности среды чашки открывают, переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 30 мин при 48—50°С или в ламинарном боксе 1—2 ч. или в других условиях, обеспечивающих испарение конденсационной влаги и исключающих микробное загрязнение.

На подсушенную среду наносят жидкий продукт или разведение навески и немедленно равномерно растирают по поверхности шпателем — изогнутой стеклянной палочкой.

Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.

Метод посева в жидкие среды.

В колбу или пробирки с питательной средой вносят навеску продукта или разведеные навески.

При определении наиболее вероятного числа (НВЧ) микроорганизмов из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений до такой степени, чтобы можно было определить предполагаемое НВЧ микроорганизмов.

Самое низкое разведение и высеваемые объемы его инокулума выбирают в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов н чувствительности метода следующим образом:

По 1 смЗ из разведения 10-1 и высших разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 1,0 г продукта;

по 10 смЗ из разведения 10-1 или 1 смЗ неразведенного продукта и по 1 смЗ из разведения 10-1 и более высокого разведения, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 10,0 г продукта;

по 10 и 1 смЗ неразведенного продукта и ряда его разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превыщающее 3 клетки в 100 смЗ продукта.

Все разведения и неразведенный продукт высевают параллельно в три пробирки с питательной средой. Инокулум объемом 1 смЗ высевают в 10 смЗ среды нормальной концентрации, инокулумы объемом 10 смЗ в 10 смЗ среды двойной концентрации.

Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

В стерильную колбу помещают 50 г корма, взятого из среднего образца (взятие корма для навески одноразовое), добавляют 450 мл физиологического раствора (получают разведение 1:10), тщательно встряхивают. Из полученной взвеси готовят последовательные десятикратные разведения (1:100, 1:1000, 1:10000 и т.д.). После оседания взвешенных частиц из верхнего слоя жидкости делают посевы

Для количественного учета микробного обсеменения в стерильные бактериологические чашки вносят по 1 мл каждого разведения и заливают 10-15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44-45°С мясопептонного агара. Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре.

После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 30°С. После 72 часового, термостатирования проводят, подсчет выросших колоний только в чашках, где содержатся не более 300 и не менее 3 колоний. Результаты, полученные при подсчете колоний, умножают на разведения, вычисляют среднее арифметическое.

Полученная цифра принимается за общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г корма.

Исследования на сальмонеллы.

Метод последовательного обогащения.

Навеску исследуемого материала 25г помещают в колбу, содержащую 225 мл забуференной пептонной воды (среда предварительного обогащения).

Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37°. Через 6-18 часов производят пересев на основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду или другую аналогичную среду по выбору) в соотношении 1:5.

После 16 – 18 час. инкубирования в термостате при 37° из обогатительных сред бактериологической петлей производят посевы на бактериологические чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфитный агар, среда Эндо или другие аналогичные среды по выбору), которые помещают в термостат при 37°.

Засеянные чашки просматривают через 24 – 48 часов.

На висмут-сульфит агаре S. typhi, Sparatyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром; S. choleraesuis – в виде зеленых колоний. Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с ртутным блеском, окруженные светлым ореолом, участок среды под колонией прокрашен в темно-коричневый цвет.

В случае обнаружения колоний, подозрительных на сальмонеллы, 3-5 из них засевают на МПА (для постановки РА), на бульон Хоттингера (для определения индола и сероводорода), в полужидкий (0,3 – 0,5%) агар (посев уколом для определения подвижности) и трехсахарный агар с мочевиной Крумвиде – Олькеницкого (сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом и глубину столбика). Посевы выдерживают в термостате при температуре 37° 16-18 часов. При росте бактерий из рода Salmonella цвет скошенной поверхности среды Крумвиде – Олькеницкого -розовый, столбик – желто-бурый, газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, при наличии сероводорода столбик чернеет.

При разложении лактозы косая поверхность окрашивается в желтый цвет. При разложении одной глюкозы окрашивается только столбик среды и происходит разрыв агара со скоплением в нем пузырьков газа. При разложении мочевины на “скошенном столбике” окраска среды меняется на малиновую.

Культуры, представляющие грамотрицательные, подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, подвергаются серологическому исследованию в реакции агглютинации на предметном стекле с набором агглютинирующих сывороток в соответствии с Наставлением к набору. Для реакции агглютинации используют суточные культуры, выращенные на МПА. При этом для реакции агглютинации с О – сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н – сыворотками – из самой нижней части (конденсационной воды), где микробы наиболее подвижны.

Определение присутствия бактерий группы кишечной палочки

Метод основан на способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять маннит, образовывать на средах “ХБ” и Хейфеца кислые продукты, изменяющие цвет индикаторов, входящих в состав этих сред.

По 1 смЗ каждого разведения вносят (по выбору) в пробирки, содержащие по 5 смЗ среды: Эйкмана, Кесслер, Булира, Хейфеца, “ХБ” или КОДА. Посевы помещают в термостат при температуре 43°С для первых пяти сред и 37°С для последней.

Через 24 ч учитывают рост на среде Эйкмана, Булира по помутнению среды и образованию газа, на средах Кесслер, Хей а также на бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода). Для определения подвижности культуры производят посев уколом в полужидкий агар (0,3 -0,5%). Титр кишечной палочки устанавливают по наибольшему разведению, в. котором еще наблюдался рост.

Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев в количестве 0,1-0,2 смЗ на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина) и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч.

Типичные колонии Е. coli характеризуются круглой формой, выпуклой или слегка приподнятой в центре поверхностью, ровными краями, розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском или без него на среде Эндо и фиолетового или черного – на среде Левина.

Выросшие изолированные колонии (не менее 4) пересевают на мясо – пептонный бульон, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды, заражения мышей, вторую – для приготовления кипяченого антигена.

Источник: https://mirznanii.com/a/11947-4/veterinarno-sanitarnaya-ekspertiza-myasa-4

Medic-studio
Добавить комментарий