2.9 Исследования на энтерококки: 2.9.1 В колбу с 450 мл стерильного физиологического раствора помещают

Методика бактериологического исследования кормов на энтерококки /

2.9 Исследования на энтерококки: 2.9.1 В колбу с 450 мл стерильного физиологического раствора помещают

МЕТОДИКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

КОРМОВ НА ЭНТЕРОКОККИ

УТВЕРЖДАЮЗаместитель начальникаГлавного управления ветеринарии_________________ Л.П. Маланин21 марта 1986 год

Методика бактериологическогоисследования кормов на энтерококки разработана Всесоюзнымнаучно-исследовательским институтом ветеринарной санитарии и Центральнойветеринарной лабораторией Главветупра Госагропрома СССР

1. Общие положения

1.1. Бактериологическое исследование кормов на обнаружениеэнтерококков проводят для уточнения этиологии желудочно-кишечных заболеванийсельскохозяйственных животных и птицы (молодняка).

1.2. Метод основан на двухэтапном посеве на ингибирующиесреды, подавляющие рост грамотрицательных и частично грамположительных микробов.

1.3. Пробы корма отбираются согласно общепринятым методам.

2. Проведение исследований

2.1. В колбу с 450 мл стерильного физиологического растворапомещают 50 г корма (разведение 1:10), тщательно встряхивают нашуттель-аппарате 30 минут. Из полученной взвеси готовят последовательныеразведения 1:100, 1:1000, 1:10000. Из каждого разведения вносят по 1 мл впробирки с щелочно-полимиксиновой средой (приложение 1). Посевы инкубируют в термостате при 37° в течение16 – 24 часов.

2.2. Из пробирок с измененным цветом среды в зеленый илижелтый делают посев на плотную молочно-ингибиторную среду МИС (приложение 1) в бактериологических чашках.Посевы инкубируют в термостате при 37° в течение 24 – 48 часов.

2.3. Через 24 – 48 часов изучают рост колоний на среде МИС,идентифицируя разные виды и варианты энтерококков: Str.

faecalis и еговарианты образуют на молочно-ингибиторной среде круглые, выпуклые, с ровнымикраями, черные, с металлическим блеском колонии. Str. faecalis var.

liquefaciens имеет способность кроме того образовывать вокруг колоний зонупросветления с ободком помутнения по ее периферии. Str. faecium на средеМИС растет в виде мелких, сероватых, иногда почти бесцветных колоний.

2.4. У выделенных культур со среды МИС определяютморфологические и культурально-биохимичеcкие свойства согласно (таблица 1) основных дифференциальных признаковэнтерококков и сходных с ними микроорганизмов.

2.5. Патогенные свойства энтерококков определяютбиологической пробой на белах мышах.

Для этого заражают внутрибрюшинно трехмышей массой 18 – 20 г в дозе 0,5 см3 суспензией суточной культурысо скошенного МПА, с концентрацией бактерий, соответствующей 5 ЕД пооптическому стандарту мутности.

Для смыва культур с МПА и получения суспензиинеобходимой концентрации используют физиологический раствор. Патогенныекультуры обычно вызывают гибель одной или более мышей в первые 3-е суток послезаражения. Наблюдение за подопытными животными ведут в течение 5 суток.

3. Ветеринарно-санитарная оценка кормов

3.1. Корма, в которых обнаружены патогенные энтерококки,запрещается использовать без термической обработки. Их подвергают проварке притемпературе не ниже 100° в течение 1 часа в соответствии с действующимиПравилами бактериологического исследования кормов.

Приложение 1

Рецепты питательных сред

1. Щелочно-полимиксиновая среда

Раздельно готовят:

среду А: МПБ – 280 мл, хлорид натрия – 4,0 г, глюкоза – 8,0г, дрожжевой экстракт – 16 мл.

раствор Б: натрий углекислый (Na2CO3) – 4,4, дистиллированная вода – 50 мл.

раствор В: калий двузамещенный фосфорнокислый (K2НРO4) – 2,0,дистиллированная вода – 50 мл.

Среду А, растворы Б и В стерилизуют при 5 атм. 12 – 15минут.

После стерилизации их смешивают и добавляют 1,6 мл 1,6%-ного щелочного раствора бромтимолблау (1,6 г бромтимолблау растворяют в 33 мл0,4 %-ного раствора едкого натра и объем доводят до 100 мл дистиллированной водой)и 200000 ЕД полимиксина.

Среду разливают по 5 мл в пробирки. Хранят в холодильнике 7- 10 дней.

2. Молочно-ингибиторная среда (МИС)

К 850 мл стерильного 2 %-ного МПА (при температуре не более55°) добавляют 150 мл стерильного снятого молока, 12,5 мл 0,01 %-ного водногораствора кристаллического фиолетового (ингибитор), 10 мл 2 %-ного водногораствора теллурата калия, смешивают и разливают в чашки Петри.

3. Дрожжевой экстракт

250 г прессованных пекарских (свежих) дрожжей растворяют в500 мл дистиллированной воды и автоклавируют текучим паром 30 минут.

Послеостывания помещают в холодильник для отстаивания (на 4 – 5 суток), затемнадосадочную жидкость сливают в стеклянную посуду.

К этой жидкости добавляют1,25 мл 0,01 %-ного водного раствора кристаллического фиолетового из расчета на100 мл и стерилизуют текучим паром 20 – 30 минут. Хранят в холодильнике 1месяц.

Таблица 1

Дифференциальныепризнаки энтерококков и сходных с ними микроорганизмов

Виды и вариантыРедукция теллурита калияФерментацияАссимиляция цитратовГидролиз желатинаКровяной агар
сорбитаманнитаарабинозы
Str. faecalis+±++
Str. faecalis var. liquefaciens+±+++
Str. faecalis var. xymogenes+±++±+
Str. faecium++
Str. durans±
Str. bovis+±
Str. equinus

СОДЕРЖАНИЕ

Источник: https://meganorm.ru/Data2/1/4293733/4293733540.htm

Методические рекомендации по выделению и идентификации энтерококков (утв. Министерством здравоохранения СССР 04.12.1981 N 2500-81) | ГАРАНТ

2.9 Исследования на энтерококки: 2.9.1 В колбу с 450 мл стерильного физиологического раствора помещают

Методические рекомендации по выделению и идентификации энтерококков
(утв. Министерством здравоохранения СССР 4 декабря 1981 г. N 2500-81)

Роль энтерококков в инфекционной патологии человека в последние годы значительно возросла. Они являются возбудителями нагноительных раневых инфекций, заболеваний среднего уха, полости рта, миндалин, дыхательных путей, легких, желчного пузыря, желчных путей и мочеполовых органов. Вызывают энтериты, колиты, гастроэнтероколиты и инфекционно-токсический энтерит у детей.

У детей раннего возраста поддерживают кишечные расстройства, создают условия, приводящие к развитию диспепсии, участвуют в воспалительном процессе червеобразного отростка, брюшины и параректальной клетчатки. Вызывают септические состояния, септический шок, бактериальный эндокардит, внутриутробную инфекцию плода и менингит у новорожденных.

Обнаруживаются в монокультуре в содержимом осумкованных гнойных очагов, имеют значение как возбудители пищевых токсикоинфекций. Устойчивые к антибиотикам, вирулентные штаммы, циркулируя в хирургических, урологических и гинекологических отделениях больниц, обусловливают госпитальную инфекцию.

В развитии заболевания часто участвуют в ассоциации с кишечной палочкой, протеем, стафилококками, псевдомонадами, анаэробами и другими представителями нормальной микрофлоры человека.

Выделение и, тем более, количественный учет энтерококков, участвующих в смешанных инфекциях, вызывают определенные затруднения. На обычных питательных средах, широко используемых в практических лабораториях, энтерококки могут быть не выявлены из-за их сравнительно медленного роста и резко выраженной антагонистической активности ассоциантов.

Возбудителями энтерококковой инфекции в основном являются представители вида Str. faecalis. Подвижные энтерококки имеют значение при заболевании кишечника у детей и бактериальном эндокардите, роль Str. faecium в инфекционной патологии человека незначительна. При лабораторном исследовании это обстоятельство вынуждает определять выделенный штамм энтерококка до вида, подвида и биоварианта.

В практических бактериологических лабораториях обязательные исследования по выделению и идентификации энтерококков не проводятся, и они, как возбудители заболеваний, не регистрируются. Методических рекомендаций, предназначенных для этой цели, нет.

В лабораторной практике в настоящее время назрела необходимость в обязательном исследовании на энтерококки всех гнойно-септических процессов и проведение бактериологического контроля за циркуляцией возбудителя больничной инфекции.

Для этой цели рекомендованы простые селективные плотные питательные среды, доступные любой бактериологической лаборатории, представлена краткая схема видовой идентификации энтерококков, включающая минимальное количество питательных сред, для каждого конкретного случая указан способ забора материала на исследование и показана последовательность лабораторной диагностики заболеваний.

Данные методические рекомендации могут быть использованы в практической работе врачами-бактериологами централизованных бактериологических лабораторий, бактериологических лабораторий санэпидстанций, лечебно-профилактических учреждений и НИИ, занимающихся этой проблемой.

1. Необходимое оборудование и реактивы

1.1. Аппаратура

Автоклав электрический, обеспечивающий различные режимы стерилизации, ТУ 5-375-4166-73.

Термостат электрический. ТУ 64-1-1-80-72 или любой другой модели.

Шкаф сушильный электрический (от 40 до 200°С). ТУ-64-1-1411-76.

Дистиллятор электрический. ТУ 64-1-721-72.

Центрифуга низкоскоростная ЦЛК-1 или любая другая модель отечественного производства.

Весы технические. ТУ 64-1-1065-73.

рН-метр с точностью определения не менее единицы рН.

1.2. Лабораторная посуда, материалы

Флаконы или колбы конические емкостью 100, 250, 500 мл.

Бутыли емкостью 5000 мл.

Пробирки по ГОСТ 7774-55.

Чашки Петри.

Стаканы лабораторные. ТУ 25-11-944-79.

Пипетки градуированные. ГОСТ 20292-74.

Шпатели деревянные или металлические. ТУ 64-1-84-72.

Ватные тампоны на металлических или деревянных палочках, вставленных в пробирки. ГОСТ 10515-75.

1.3. Реактивы

Вода дистиллированная. ГОСТ 6709-72.

Агар питательный сухой. ТУ 42-14-33-75.

Автолизат дрожжевой для приготовления питательных сред. ТУ-6-09-3979-75.

Глюкоза безводная. ГОСТ 6038-51.

Натрий лимоннокислый. ГОСТ 22280-76.

Натрий хлористый. ГОСТ 4233-77.

Натрий углекислый (карбонат натрия ). ГОСТ 4333-76.

Натрий двууглекислый. ГОСТ 2156-76.

Налидиксовая кислота (неграм, невиграмон-хиноин).

Калий теллуристокислый. ТУ 6-09-2050-77.

Кали едкое (гидроксид калия, КОН). ГОСТ 4203-65.

Источник: https://base.garant.ru/71315526/

Санитарно-бактериологические методы исследования в аптеках

2.9 Исследования на энтерококки: 2.9.1 В колбу с 450 мл стерильного физиологического раствора помещают

В аптеках работниками государственного санитарно-эпидемиологического надзора согласно инструкции, утвержденной приказом Министерства здравоохранения, не менее двух раз в квартал осуществляется бактериологический контроль, объектами которого служат:

1) вода дистиллированная;

2) инъекционные растворы до стерилизации;

3) инъекционные растворы после стерилизации;

4) глазные мази после стерилизации;

5) глазные капли, приготовленные в асептических условиях на стерильной основе;

6) сухие лекарственные вещества, используемые для приготовления инъекционных растворов;

7) нестерильные лекарственные формы;

8) аптечная посуда, пробки, прокладки, прочие материалы;

9) инвентарь, оборудование, руки, санитарная одежда персонала;

10) воздух аптечных помещений.

Определение микрофлоры в лекарственных формах

Определение микрофлоры в лекарственных формах состоит из следующих этапов:

6. определение общего микробного числа (микробная обсемененность);

7. определение бактерий группы кишечной палочки;

8. определение дрожжевых и плесневых грибов;

9. определение условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (по специальным показателям).

Общее микробное число (ОМЧ) – количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г (мл) препарата, определяют по числу выросших колоний.

Определение микробной обсемененности

растительного лекарственного сырья

В асептических условиях (в стерильной чашке Петри, обоженными ножницами и пинцетом) из листа или верхнего слоя корневища вырезают кусочек площадью 1 см2, который помещают в пробирку с 10 мл стерильного физиологического раствора и взбалтывают в течение 5 мин.

Из полученного смыва готовят четыре десятикратных разведения (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000), для посева используют два последних разведения в связи с большой обсемененностью растительного сырья. В стерильную чашку Петри вносят 1 мл смыва, после чего в нее наливают 15 мл расплавленного и остуженного до 450С МПА, перемешивают и после застывания агара посевы инкубируют при 370С 24-48 ч.

Производят подсчет выросших колоний на поверхности и в глубине агара. Полученное число колоний следует умножать на степень разведения.

Бактериологическое исследование стерильных лекарственных средств

Инъекционные растворы, глазные капли, лекарственные средства для новорожденных, а также другие лекарственные препараты, стерилизуемые в процессе их изготовления, засевают неразведенными в тиогликолевую среду для определения микробной обсемененности и среду Сабуро для выявления дрожжевых и плесневых грибов. Посевы на тиогликолевой среде выдерживают 14 сут при 370С, на среде Сабуро 14 сут при 240С. Учет результатов посевов проводят по отсутствию видимых изменений в посевах.

Определение микробной обсемененности готовых лекарств

Жидкие лекарственные формы разводят стерильным физиологическим раствором 1:10 (или 1:100) и засевают в объеме 0,5 мл на МПА в чашке Петри.

1 г порошка или таблеток помещают в пробирку с 10 мл физиологического раствора и после растворения производят посев на МПА.

Мягкие лекарственные формы (мази, пасты) в количестве 1 г взвешивают в асептических условиях, переносят в пробирки с 10 мл стерильного 1,4% раствора натрия гидрокарбоната для диспергирования, которое производят вращательным движением пробирки между ладонями в течение 2-4 мин. 0,5 мл полученного раствора засевают на МПА в чашках Петри.

Чашки с посевами помещают в термостат на 48 ч, затем подсчитывают число бактериальных колоний и определяют количество бактерий в 1 мл или 1 г образца.

Определение общего количества грибов

Определение общего количества грибов проводят на твердой среде Сабуро, на которую засевают 0,5 мл цельного или разведенного 1:10 препарата. Посевы инкубируют при 240С в течение 5 сут, затем подсчитывают число выросших колоний и определяют количество грибов в 1 мл или 1 г препарата.

Качественное определение условно-патогенных

и патогенных микроорганизмов

1. Определение бактерий семейства Enterobacteriaceae (роды Escherichia, Salmonella, Shigella).

Посев лекарственных средств производят на среду Эндо и висмут-сульфитный агар. Идентификацию энтеробактерий осуществляют следующим образом: если в образце обнаружены грамотрицательные неспоровые палочки, дающие отрицательную реакцию на цитохромоксидазу, ферментирующие глюкозу и восстанавливающие нитраты в нитриты, исследуемый препарат содержит бактерии семейства Enterobacteriaceae

2. Определение патогенных стафилококков.

Определение патогенных стафилококков производят посевом препарата на желточно-солевой агар. На этой среде патогенные стафилококки вызывают лицитовителлазную реакцию, проявляющуюся в образовании вокруг колоний зоны помутнения с радужным венчиком по периферии. Выделенную чистую культуру исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы.

3. Выявление Pseudomonas aeruginosa.

Осуществляют на среде с глицерином. Синегнойная палочка на этой среде образует зеленоватые флуоресцирующие колонии, выделяющие в среду сине-зеленый пигмент.

4. Выявление протея.

Производят посевом на МПА по Шукевичу.

Наличие условно-патогенных и патогенных микроорганизмов в лекарственных препаратах недопустимо.

В соответствии с требованиями Государственной фармакопеи XI издания приняты следующие критерии оценки микробной обсемененности лекарственных средств (табл. 7)

Таблица 7

Нормативы предельно допустимого содержания

непатогенных микроорганизмов в лекарственных формах

Лекарственные средства микроорганизмов в 1 г/мл
Инъекционные растворы перед стерилизацией, не позднее 1,5 ч после приготовления Не более 30
Инъекционные растворы после стерилизации Стерильны
Глазные капли, средства для новорожденных Стерильны
Дистиллированная вода для приготовления стерильных растворов Не более 15
Препараты для местного применения (на кожу, слизистую носа, гинекологические) Не более 100, в том числе не более 10 грибов
Пероральные препараты Не более 1000, в том числе не более 100 грибов

Определение на пирогенность

Пирогенность (повышение температуры тела) обусловлена наличием в стерильных лекарственных препаратах убитых бактерий и продуктов их распада (липополисахаридов).

Стерильные инъекционные растворы должны быть апирогенны.

Определение на пирогенность проводят на здоровых кроликах обоего пола, не альбиносах, весом 2,5-3,0 кг, содержащихся на полноценном рационе. Испытуемую дистиллированную воду или лекарственные средства вводят трем кроликам в ушную вену в количествах и растворителях, предусмотренных соответствующими инструкциями.

Воду для инъекций и раствор лекарственного средства считают непирогенными если сумма повышений температуры у 3 кроликов меньше или равна 1,40С. Если сумма превышает 2,20С, то испытуемые растворы считают пирогенными.

В случаях, когда сумма повышений температуры у 3 кроликов находится в пределах от 1,5 до 2,20С, испытание проводят на 5 кроликах.

В этом случае воду для инъекций или раствор лекарственного средства считают непирогенными, если сумма повышений температуры у всех 8 кроликов не превышает 3,70С.

Бактериологическое исследование в аптеках

С целью проверки качества мытья посуды, санитарного состояния аптек, соблюдения правил личной гигиены персоналом проводят санитарно-бактериологическое исследование аптечной посуды, оборудования, рабочих столов, полотенец, санитарной одежды и рук аптечных работников.

Для определения микробной загрязненности используют метод смывов с поверхности исследуемых объектов стерильным физиологическим раствором.

Приготовление смывов. Для исследования используют 3 флакона. В один из флаконов наливают 10 мл стерильного физиологического раствора, ополаскивают внутреннюю поверхность сосуда, переливают во второй и третий флаконы, последовательно ополаскивая их.

Пробки (корковые, полиэтиленовые, резиновые) в количестве 5 штук стерильным пинцетом помещают в широкогорлую стерильную колбу, закрытую ватно-марлевой пробкой, заливают 10 мл стерильного физиологического раствора и тщательно прополаскивают.

Воронки, пробирки, пипетки ополаскивают 10 мл стерильного физиологического раствора.

Смыв со стола производят с поверхности 100 см2, для чего используют специальные трафареты из проволоки или жести, стерилизуемые прокаливанием перед взятием смывов.

Смыв осуществляется стерильным ватным тампоном, помещенным в пробирку с 2 мл стерильного физиологического раствора (тампон не должен касаться поверхности раствора).

Непосредственно перед взятием смыва тампон смачивают физиологическим раствором, тщательно протирают поверхность стола ограниченную трафаретом, помещают в пробирку, в которую добавляют 8 мл стерильного физиологического раствора и тщательно тампон прополаскивают.

Смывы с рук берут влажным тампоном (тампон находится в пробирке с 2 мл стерильного физиологического раствора), протирая ладони, подногтевые, межпальцевые пространства обеих рук. Тампон помещают в пробирку, добавляют 8 мл стерильного физиологического раствора и тщательно его прополаскивают.

Смывы исследуют на общее бактериальное загрязнение (ОМЧ), на наличие кишечной палочки и золотистого стафилококка; обнаружение которых свидетельствует о грубых нарушениях санитарного режима в аптеках.

Определение микробного числа. 1 мл смыва вносят в стерильную чашку Петри, заливают 12-15 мл расплавленного и остуженного до 450С МПА, тщательно перемешивают содержимое чашки и после застывания агара ее помещают в термостат на 24-48 час. Подсчитывают количество выросших колоний, умножают на 10 и определяют общую микробную обсемененность объекта.

Определение бактерий кишечной палочки как показателя фекального загрязнения. Остаток смывной жидкости (около 8 мл) засевают в пробирку, содержащую 1 мл концентрированной среды Эйкмана.

Посев инкубируют при 430С 24 ч.

При наличии газообразования в среде производят высев на дифференциально-диагностическую среду Эндо в случае появления типичных темно-красных колоний производят микроскопию и ставят оксидазную пробу.

Критерии оценки микробной обсемененности аптечной посуды, рабочих столов, рук персонала.

1. При исследовании микробной загрязненности посуды, оборудования, рук аптечных работников количество мезофильных аэробов и факультативных анаэробов не должно превышать 150 в 10 мл смывной жидкости.

2. При бактериологическом исследовании в аптеках наличие бактерий группы кишечной палочки и золотистых стафилококков не допускается.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха аптечных помещений. Включает определение общего микробного числа воздуха и санитарно-показательных микробов.

Исследование проводят аспирационным методом с помощью аппарата Кротова, ПАБ и др. Скорость прокачивания воздуха должна быть не менее 25 л/мин.

Количество пропущенного воздуха 100 л для определения общего количества бактерий и 250 л для выявления золотистого стафилококка, дрожжевых и плесневых грибов.

Для получения роста сапрофитных бактерий используют МПА, грибов – сусло-агар или среду Сабуро, золотистого стафилококка – желточно-солевой агар. После инкубации в термостате проводят подсчет количества выросших колоний и делают перерасчет на 1 м3 воздуха (табл. 9).

Таблица 8

Наименование помещений Условия работы Количество микробов в 1 м3 воздуха
общее золотистого стафилококка плесневых и дрожжевых грибов
Асептический блок, стерилизационная до работы после работы до 500 до 1000 не должно быть не должно быть не должно быть не должно быть
Ассистентская, расфасовочная, дефектарная, материальная до работы после работы не должно быть не должно быть не должно быть не должно быть
Моечная во время работы не должно быть до 12
Зал обслуживания во время работы до 1000 до 20

Повышенное микробное загрязнение воздуха аптеки, аптечного оборудования, посуды и тары, рук персонала, растительного сырья, свидетельствующее о нарушениях санитарного режима и правил личной гигиены работников, является причиной микробной обсемененности готовых лекарств (табл. 8).

Поэтому необходимо принятие срочных мер по наведению санитарного порядка: тщательная мойка посуды, влажная уборка помещения с дезинфицирующими веществами, обеззараживание воздуха бактерицидными лампами, мытье рук персонала в соответствии с инструкцией, работа в чистых халатах и колпаках.



Источник: https://infopedia.su/9x1349d.html

Medic-studio
Добавить комментарий