9.4. Выделение плазмидной ДНК.: Аналитические количества плазмидной ДНК выделяли двумя способами:

Методика выделения плазмидной ДНК

9.4. Выделение плазмидной ДНК.: Аналитические количества плазмидной ДНК выделяли двумя способами:

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Московский государственный университет тонких химических технологийимени М. В. Ломоносова

Кафедра химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А.Преображенского

Отчет по лабораторной практике

Выполнил: студент гр. БТ-32

А.С. Серегин

Руководитель: доц Н.В. Гроза

Москва 2015

Оглавление

Введение

Методика выделения плазмидной ДНК

Методика внедрения плазмидной ДНК в клетки E. Coli

Сбор белка из раствора

Электрофарез в полиамидакрильном геле

Аффинная хроматография

Введение

В данном семестре мы изучали технику выделение и очистки белка PASS. На основе полученного опыта и знаний я составил отчёт, который включает в себя описание методов, применяемых на практике.

Информация, известная о PASS:

Расчетная молекулярная масса 12,8 кДа

Расчетная изоэлектрическая точка 4,68.

Вся информация, касающаяся пасса, сводится к информации о протеализине.

Приготовления:

1) Добавить и взболтать RNaseA к ресуспендирующему раствору.

2) Добавить этанол (96-100%) к промывочному раствору

#K0502#K0503
Промывочный раствор20 мл100 мл
Этанол 96%35 мл170мл
Всего55 мл270 мл

3) Проверить лизат и нейтрализующий раствор на содержание солей перед использованием.

4) Растворить можно путём нагревания до 37ОС и последующем охлаждении до 25ОС, при этом нельзя взбалтывать интенсивно

5) Работать только в перчатках.

Рост бактериальных культур:

1) Отобрать одиночную колонию из свежевыращенной посевной тарелки вместе с 1-5 мл LB (питательная среда с антибиотиком), пробу инкубировать в течении 12-16 часов при температуре 37ОС при вращении 200-250 об м/мин, использовать колбы с объёмом в 4 раза больше объёма пробы

2) Осадить бактериальную культуру с помощью центрифугирования 8000 об/мин в течении 2 мин при комнатной температуре и затем отделить жидкость

Весь процесс выделения плазмид проходит при комнатной температуре.

Все дальнейшие центрифугирования проходят при 10000 – 14000 об/мин

Для высококопийной плазмиды использовать 1-5 мл E. Coli в среде

Для низкокопийной плазмиды использовать 10 мл E. Coli в среде.

Методика:

1) Растворить клетки в 250 мкл ресуспендирующего раствора и перенести их в микроцентрифугаторы. Полностью растворить их пипеткой.

2) Добавить 250 мкл лизата и осторожно переворачивать пока суспензия не станет однородной. Срок хранения – 5 мин.

3) Быстро добавить 350 мкл нейтрализующего раствора и аккуратно попереварачивать до появления белых седиментов.

4) Центрифугировать 5 мин, осадить клетки и хромосомную ДНК

5) Перенести супернатант в GeneTET вращательную колонку и пипеткой перемешать. Не переносить белый седимент.

6) Центрифугировать 1 мин, слить жидкость и поместить колонку обратно в тару. Жидкость перемешивать нельзя.

7) Добавить 500 мкл промывающего раствора в GeneTET колонку, центрифугировать 30-60 сек. Слить жидкость, а остаток в тару.

8) Повторить п. 7

9) Слить жидкость и центрифугировать 1 мин, чтобы удалить остаток промывки

10) Перенести GeneTET колонку в новую 1,5 мл тару для центрифугирования. Добавить 50 мкл элиоатного буфера в центр GeneTET колонки через её мембрану, чтобы элюировать плазмидную ДНК. Нельзя касаться пипеткой мембрану. Затем центрифугировать в это таре 2 мин при комнатной температуре. Для увеличения выхода на 10-20% можно снять остаток ДНК с помощью повторного добавления элюата.

11) Извлечь из колонки очищенные плазмидные ДНК, хранить при -20ОС.

Методика внедрения плазмидной ДНК в клетки E. Coli

После 3го раунда ПЦР амплификат пересадить в 9/10 объёма изопропанола и 1/10 объёма ацетата калия на 30 мин. Центрифугировать в течении 15 мин при 11000 об/мин.

После рестрикции порезанную плазмиду выделить из геля.

Для получения препарата Pln-клетки Bl21 с плазмидой hPln-6Hisкультивировать в автоиндуцирующей (BoostBroth) среде с помощью лактозного оперона.

Состав BoostBroth (на 1 литр):

HNa2PO4 – 7,098 г

KH2PO4 – 6,805 г

(NH4)2SO4 – 3,304 г

MgCl2 – 0,19 г

MgCl2*6H2O – 4,07 г

Глицерол – 5,000 мл

Пентон – 10 г

Дрожжи – 2 г

Глюкоза 0,5 г

Лактоза – 2 г

Глюкоза и лактоза стирилизуются отдельно через мембрану.

Остальное в автоклаве при отсутствии осадка

BoostBroth – среда для экспресси генов в клетках E. Coli с Т7 – регулируемой системой экспрессии без слежения за оптической плотностью системы и без добавления индуктора. Биомасса бактериальных масс в 3-18 раз болше по сравнению и LB-IPTG

ОП600нм=7-15 за 15-20 часов

Культивировать BoostBroth при 37ОС и 250 об/мин в течении 16-20 часов

Переносить в среду единичную колонию со свежей амплификацией.

Рестрикция амплификата:

IIIIII
Pass_6His/S7мкл2 мкл2 мкл
XBa1 мкл1 мкл
XHo1 мкл1 мкл
Буфер2 мкл1 мкл1 мкл
МФ9 мкл6 мкл6 мкл
Всего20 мкл10 мкл10 мкл

Сбор белка из раствора

1) Осаждение белка из раствора с помощью ТХУ

2) Очистка от ТХУ ацетоном(повторяется 3-4 раза):

– разбавление раствора ацетоном

– центрифугирование

– слив супернатанта

3) выпарка ацетона

4) добавление 10 мкл красителя

5) термостатирование

6) электрофарез

Электрофарез в полиамидакрильном геле:

1) Дезинфексия стёкл для фареза спиртом, затеем фильтровальной бумагой и закрепление их на заливочном столике

2) Приготовление геля:

Используется 2 типа геля: нижний ( разделяющий, отличается повышенной концентрацией) и верхний (концентрирующий).

Раствор для полиакриламидного геля (ПААГ):

А* – 0,5 М трис-HCl 0,4% SDS, pH 6,8

A – 1,5 M трис-HCl, 0,4% SDS, pH8,8

B – 29,2% акриламид, 0,8% бисакриламид

С – 10% персульфат аммония

D – 50% глицерин

Е – 0,5 М ЭДТА-Na2? pH=7,0

F – 100% TEMED

Нижний гель:

А – 1,5 мл

В – 2,49мл

Е – 24 мкл

H2O – 1,42 мл

Затем

С – 40 мкл

F – 15 мкл

Верхний гель:

А* – 0,625 мл

В – 0,375 мл

Е – 16,5 мкл

H2O – 1,4535 мл

Затем

С – 20 мкл

D – 10 мкл

После добавления C и D гели сразу взболтать и залить в стёкла. Сначала залить 3 мл нижнего геля и дождаться его затвердения, затем залить 1 мл верхнего геля и вставить в него гребёнку для образования кармашков.

Затем залить буфер.

Состав (на 500 мл буфера):

– 7,2 г Gly

– 1,5 г трис-ОН

– 0,5 г SDS

– H2O до 500 мл

В каждую пробу добавить растворитель и краску по 3 мкл.

Состав краски:

MeOH 50 мл

H2O 50 мл

AcOH 10 мл

Coomasine 0,25 г

Состав растворителя для проб:

D – 200 мкл

Е – 20 мкл

А* – 0,5 мл

Меркаптоэтанол – 100 мкл

SDS – 40 мг

H2O – 1,280 мл

Бромфеноловый синий на кончике шпателя

В кармашки в геле залить по 8 мкл проб (пропипетированных с растворителем и краской) и маркер.

Затем залить 2 л буфера в основную камеру установки.

Электрофарез проводится при силе тока 25 мА и напряжении 200 В

Затем осадить белок в геле раствором ТХУ в течении 15 мин, после чего добавить краску и очистить раствором (7% AcOH и 5% EtOH)

Определить массу белка путём сравнения с маркером.

Аффинная хроматография

Аффинная хроматография – (от лат.

affinis – родственный) (биоспецифическая хроматография, хроматография по сродству), метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом ковалентно связанным с инертным носителем. В качестве лигандов используют соединения, взаимодействие которых с разделяемыми веществами основано на биологической функции последних.

Для выделения нашего белка из смеси мы использовали его модифицированную структуру, добавив в неё: гистидиновых остатков. Гистидин имеет высокое сродство к никелю, который мы использовали как лиганд. В качестве инертного носителя мы использовали амилазную смолу.

Методика выделения белка из раствора для растворимого белка:

1) Засыпать амилазную смолу в колонну и промыть её пятью объёмами буфера

При этом перегонять буфер не быстрее чем 25 мл/час

2) Поместить экстракт (белок) в колонку

3) Залить 12 объёмов колонки буфером для перегонки буфером для прогонки и перегонять со скоростью не более 10 мл/час для колонки 2,5 см

4) Добавить буфер с мальтозой, собрать 20 фракций по 0,2 объёма колонки

Белок обычно выходит с 5той фракции и различим при длине волны 280 нм.

5) Слить остаток и промыть колонку:

– 3 объёма воды

– 3 объёма SDS

– 1 объём воды

– 3 объёма колоночного буфера

Все действия хроматографии проводятся при температуре 40С

Смолу рекомендуется хранить в 20% этиловом спирте.

Состав колоночного буфера:

20 мМоль Трис-HCl

200 мМоль NaCl

1 мМоль ETDA

Опционально добавляется:

1 м Моль азида натрия

10 мМоль меркаптоэтанола

Или 1 мМоль DTT

Концентрация мальтозы: 10 мМоль

Затем мы определяем содержимое наших проб, для этого используем методикуэлектрофареза в полиамидакрильном геле.

Вывод: на основе данных методик можно получать, проводить выделение и очистку различных белков в лабораторных условиях.

Размещено на Allbest.ru

  • Аминокислоты, входящие в состав пептидов и белков. Моноаминодикарбоновые кислоты и их амиды. Энантиомерия аминокислот, образование солей. Мезомерия и строение пептидной связи. Методы выделения и анализа белков. Электрофорез в полиакриламидном геле.презентация [351,2 K], добавлен 16.12.2013

Источник: https://revolution.allbest.ru/chemistry/00619796_0.html

Амплификация и выделение низкокопийных плазмид

9.4. Выделение плазмидной ДНК.: Аналитические количества плазмидной ДНК выделяли двумя способами:

21

Некоторыесведения о работе с векторными ДНК.

Плазмиды

Генетическаясистема бактерий состоит из ядерных ивнеядерных структур. Аналог ядрапрокариотов значительно отличается отядра эукариотических клеток. Онпредставлен нуклеоидом , лишеннымоболочки и включающем в себя почти всюДНК бактерии. Бактериальная хромосомасостоит из одной двунитевой молекулыДНК кольцевой формы .

Молекула ДНКпостроена из двух полинуклеотидныхцепочек. Нуклеотидные цепи антипараллельны:на каждом конце линейной молекулы ДНКрасположены 5' -конец одной цепи и 3'-конец другой цепи. Наследственнаяинформация у бактерий хранится в формепоследовательности нуклеотидов ДНК,которая определяет последовательностьаминокислотных остатков в молекулебелка.

Каждому белку соответствует свойген, т.е., дискретный участок на ДНК,отличающийся числом и специфичностьюпоследовательности нуклеотидов.Бактериальная хромосома содержит до4000 отдельных генов. Размеры бактериальнойхромосомы у различных представителейцарства Procaryotae варьируют от 3 х 108до 2,5 х 10 9 Д.

Бактериальная клетка гаплоидна,а удвоение хромосомы всегда сопровождаетсяее делением.

Генетическаяинформация в бактериях может содержатьсяво внеядерных (внехромосомных) молекулахДНК, представленных плазмидами,транспозонами и инсерционными(вставочными) последовательностями.Они не являются жизненно необходимыми,так как не кодируют информацию о синтезеферментов, участвующих в метаболизмебактериальной клетки.

Размеры плазмиднеобычайно широко варьируют-от 2 тыс.до неск. сотен тысяч пароснований;нек-рые из них содержат 1-3гена,другие достигают 10-20% размера бактериальнойхромосомы.Этодвунитевые молекулы ДНК размером до 108Д, несущие до 50 генов. Количество плазмидв бактериальной клетке может быть от 1до 200 и несколько более.

Выделяютплазмиды, находящиеся в виде отдельнойзамкнутой молекулы ДНК и встроенные вхромосому бактерии ( интегрированныеплазмиды ).

Некоторыеплазмиды, называемые. эписомами,обладают способностью существовать вдвух состояниях – автономном иинтегрированном.

В автономном состоянииэписомане является частью бактериальнойхромосомыи реплицируется (самовоспроизводится)независимо, хотя и синхронно с ней. Винтегрирированном состоянии онареплицируется в составехромосомы.

Способность обратимо включаться всоставхромосомычасто сопряжена с наличием вэписомахмигрирующихгенетических элементов.

Плазмидывыполняют регуляторные и кодирующиефункции. Первые направлены на компенсациюметаболических дефектов, вторые вносятв бактерию информацию о новых признаках.

Как составляющая часть генетическогоматериала бактерии плазмиды играютважную роль в ее жизнедеятельности,детерминируя такие характеристики, какспособность продуцировать экзотоксины,ферменты или бактериоцины, устойчивостьк лекарственным препаратам и т.д.

Удвоение ДНК некоторых плазмидиндуцирует деление бактерий, т.е.увеличивает их «плодовитость». Такиеплазмиды обозначают как F -плазмиды илиF -факторы (от англ. fertility – плодовитость).Интегрированные F -плазмиды называютHfr -плазмиды или Hfr -факторы (от англ.

highfrequency of recombinations – высокая частотарекомбинаций). Hfr -факторы осуществляютперенос части генетической информацииданной хромосомы в другую клетку.

Плазмиды,детерминирующие устойчивость клекарственным препаратам, называютсяR -плазмидами или R -факторами (от англ.resistance – устойчивость). R -плазмиды содержатгены, детерминирующие синтез ферментов,которые разрушают антибактериальныепрепараты.

В результате бактериальнаяклетка становится устойчивой к действиюцелой группы лекарственных веществ.Многие R -плазмиды являются трансмиссивнымии, распространяясь в популяции бактерий,переносят резистентность к воздействиюантибактериальных препаратов.

Плазмидыпатогенности контролируют вирулентныесвойства микроорганизмов, детерминируясинтез факторов патогенности. Так,например, Ent -плазмида определяет синтезэнтеротоксина.

Развитие инфекционногопроцесса, вызванного возбудителямичумы,сибирской язвы, кишечного иерсиниоза,клещевого иксодового боррелиозасвязано с функционированием плазмидпатогенности.

Обусловленнаяплазмидами устойчивость бактерий кантибиотикамоснована на разных механизмах, но чащевсего-на инактивации последних ферментами(напр., b-лактамазы), кодируемых плазмидами,или на избират. изменении проницаемостиклеточной оболочки.

Средиплазмид, обеспечивающих устойчивостьбактерий к антибиотикам,основную массу составляют так называемыефакторы множественной резистентности,несущие сразу несколько соответствующихдетерминант. С помощью трансмиссибельныхплазмид детерминанты резистентностилегко могут распространяться междувидами, способными к конъюгации.

Натакие плазмиды генырезистентности могут передаваться спомощью транспозонов. Кроме детерминантлекарственной резистентности из числафункцией, элементов плазмид хорошоизучены генынек-рых бактериальных токсинов,например энтеротоксинов, вырабатываемыхвозбудителями кишечных инфекций,носителямитак называемых Тох-плазмид (факторовпатогенности энтеробактерий).

Показанаспособность Тох-плазмид передаватьсямежду бактериями в организмеживотных и человека. На этих плазмидахмогут находиться также детерминантырезистентности к антибиотикам.В этой связи активно развивается новоенаправление в практической бактериологии- поиск и создание веществ, избирательноподавляющих репликациюплазмид или экспрессию их генов.

Пример таких веществ – клавулановаякислота и ее производные – ингибиторыb-лактамазы.

Конъюгативныеплазмиды переносятся от бактерии кбактерии внутри вида или междупредставителями близкородственныхвидов в процессе конъюгации. Чаще всегоконъюгативными плазмидами являются F- или R -плазмиды. Подобные плазмидыотносительно крупные (25-150 млн Д) и частовыявляются у грамотрицательных палочек.

Большие плазмиды обычно присутствуютв количестве 1-2 копий на клетку и ихрепликация тесно связана с репликациейбактериальной хромосомы.Неконъюгативныеплазмиды обычно имеют небольшие размерыи характерны для грамположительныхкокков, но встречаются также у некоторыхграмотрицательных микроорганизмов(например, у Haemophilus influenzae , Neisseria gonorrhoeae).

Мелкие плазмиды могут присутствоватьв больших количествах (более 30 на клетку),так как только наличие такого количестваобеспечивает их распределение в потомствево время клеточного деления.

При наличиив бактерии одновременно конъюгативныхи неконъюгативных плазмид донор можетпередавать и неконъюгативные плазмидыза счет связывания генетическогоматериала последних с факторами,обеспечивающими их перенос в процессеконъюгации.

ВЫДЕЛЕНИЕПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИЙ

Длявыделения плазмидной ДНК пользуютсямногими методами. Все они включают триосновных этапа: рост бактерий иамплификацию плазмиды; сбор бактерийи их лизис; очистку плазмидной ДНК.

Амплификацияв богатой среде

Амплификациюплазмид производят при выращиваниибактерии-хозяина в богатой среде вприсутствии хлорамфеникола. Ночнуюкультуру (10 мл LB c добавлением антибиотика)пересевают в свежую среду LB (0.2 мл н.к. в25 мл LB c антибиотиком) и инкубируют покакультура не достигнет позднейлогарифмической фазы (D600=0,6).

Переносяткультуру в свежую среду LB с антибиотиком(500 мл), инкубируют 2,5 часа (при этом титрудваивается), добавляют антибиотик доконцентрации 170 мкг/мл и инкубируют еще12-16 ч.

Лизисклеток

Разрушениябактерий для последующего выделениябиологически активной ДНК можно добитьсяразными способами.

-Механические. При этом происходятмногочисленные разрывы ДНК.

-У многих бактерий наступает лизис последобавления анионного детергента

додецилсульфата(или лаурилсульфата). В частности, такможно разрушить

бактериикишечной группы, пневмококки и гемофильныебактерии.

Додецилсульфатне только разрушает клетки, но иденатурирует некоторые белки. Однакозатем он должен быть полностью удалениз лизата (что и достигается припоследующих обработках), так как егопримесь в трансформирующей ДНК мешаетсамому процессу трансформации.

Некоторыеграмположительные бактерии нельзяразрушить только

додецилсульфатомили другими поверхностно-активнымивеществами. Вначале нужно удалитьклеточную стенку и затем применить тотили иной детергент. Для разрушенияклеточной стенки чаще всего применяютлизоцим.

При концентрациях, которыечаще всего применяются для разрушениябактериальных клеток (50-500 мкг/мл), функциилизоцима сводятся к разрушению клеточнойстенки, в результате чего образуютсяхрупкие протопласты, легко разрушаемыедетергентами.

При больших концентрацияхлизоцим может, видимо, влиять на связьДНК с цитоплазматической мембраной идаже связываться с ДНК, осаждая ее. Кромелизоцима, для той же цели употребляютпроназу. Проназа способствует болееполному гидролизу белка и поэтому лучшейпоследующей депротеинизации ДНК.

Приразрушении бактерий в лизате в числепрочих ферментов появляются

дезоксирибонуклеазы.Они, если действие их чем-либо неблокировано, могут тут же разрушитьДНК. Обычно от них защищаются, добавляявещества, которые связывают ионы магния,требующиеся для работы большинстваДНКаз.

Вещества,связывающие ионы магния (ЭДТА, цитрат),которые добавляют при лизисе клетокдля инактивации дезоксирибонуклеаз ипредохранения выделяющейся ДНК, подавляютпоглощение ДНК компетентными клетками.

Додецилсульфат и дезоксихолат такжеподавляют трансформацию. Лизоцим ипроназа, остающиеся в лизате, сами могутлизировать компетентные клетки.

В рядеслучаев от нежелательных примесей,мешающих трансформации, можно избавитьсяза счет его разведения.

Длядепротеинизации лизата при выделенииДНК используют обработку

фенолом,который осаждает додецилсульфат иинактивирует все белки, в том числе идезоксирибонуклеазы.

Существуютразличные методики лизиса. Лизискипячением и лизис щелочью), отличаютсявысокой эффективностью и в случае малыхплазмид (не более 10 kb) дают выход 2-3 мг/л.Лизис под действием SDSсравнительноболее мягкий,иим следует пользоваться в случае большихплазмид (≥10 kb).

ОчисткаДНК

Вэтих методах очистки так или иначеиспользуют два основных различия междухромосомальной ДНК бактерийиплазмидной ДНК:

1)хромосомыбактерийпоразмеру много больше ДНК плазмид,обычноиспользуемых в качестве векторов;

2)основнаямасса ДНК бактерий выделяется из клетокв виде фрагментированных линейныхмолекул,тогдакак большинство плазмидной ДНКэкстрагируется в виде ковалентнозамкнутых кольцевых молекул.

Поэтомубольшинство методов очистки включаютосаждения,прикоторых из препарата удаляютсяпреимущественно длинные цепи ДНКбактерий,случайнозахваченные обломки лизированныхклеток.Методикиэти основаны также на использованиисвойств кольцевой замкнутой ДНК.

Каждаяиз комплементарных цепей плазмиднойДНК представляет собой ковалентнозамкнутое кольцо,поэтомуцепи нельзя отделить друг от друга (неразорвав одну из них)втех условиях,прикоторых происходит разрыв большинстваводородных связей в ДНК,напримерпри нагревании

илипри выдерживании в умеренно щелочныхрастворах (дорН 12,5).Приохлаждении или возвращении к нейтральномурН замкнутые кольцевые молекулы вновьпринимают нативную конформацию, тогдакак ДНК бактерийостаетсяденатурированной.

ПлазмиднаяДНК ведет себя отлично от ДНК бактерийтакжеи при равновесном центрифугировании вградиенте хлористого цезия, содержащихкакой-нибудь интеркалирующий красительв насыщающей концентрации, напримербромистыйэтидий или дийодистый пропидий.

Ковалентно замкнутые кольцевые ДНКсвязывают меньше такого красителя, чемлинейная ДНК, и поэтому в градиентаххлористого цезия, содержащих интеркалирующийагент, оказываются в зонах с болеевысокой плотностью. Эту методикуиспользуют, если необходима высокаястепень очистки плазмидной ДНК.

Однакопо мере развития методов работы срекомбинантной ДНК для многих целейоказалось уже необязательным проводитьочистку больших количеств плазмиднойДНК до такой степени, чтобы препаратбыл гомогенным.

Например, расщеплениерестриктирующими эндонуклеазами,лигирование, трансформацию и дажесеквенирование ДНК можно проводитьтеперь, используя относительномалоочищенные препараты плазмиднойДНК, полученные из небольших объемовкультуры (около 10 мл).

Плазмидную ДНКвыделяют из больших объемов культурылишь в тех случаях, когда нужны значительныеее препараты (например, в опытах погибридизации для отбора специфическихмРНК или когда нужно пометить 5`-концыфрагментов ДНК с помощью полинуклеотидкиназы).

Описанныениже методики можно успешно использоватьдля выделения разнообразных плазмидиз различных штаммов бактерий. Вообщеговоря, чем меньше плазмида, тем лучшедостигаемые результаты.

С увеличениеммолекулярной массы плазмиды ее свойствастановятся все ближе к свойствам ДНКхозяина. Выделение плазмид, размеркоторых превышает 25 kb, сильно затрудняетсяи выход оказывается невысоким.

Однаковсе плазмиды, обычно используемые приклонировании, относительно невелики иприведенные ниже методы дают хорошиерезультаты.

Выделениепрепаративных количеств плазмиднойДНК щелочным методом из клеток бактерий

1.Наращиваем культуру в 150 мл среды LB+Ampпри 37оС(20-24 часа).

2.Осаждаем клетки (4000 об/мин, 15 мин).

3.Ресуспендируем клетки в 2.4 мл раствораI, содержащего 2 мг/мл лизоцима

(лизоцимне работает, если рН

Источник: https://studfile.net/preview/4597145/

Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК

9.4. Выделение плазмидной ДНК.: Аналитические количества плазмидной ДНК выделяли двумя способами:

Для выделения плазмид разработано несколько методов. Они различаются по чистоте конечного продукта, скорости выделения и возможности их использования для выделения плазмид из большого («maxiprep») и промежуточного («midiprep») объемов бактериальной культуры или для одновременного выделения плазмидной ДНК из большого числа культур малого объема («miniprep»).

Почти всегда для выделения плазмид используют культуры, растущие в содержащей соответствующий антибиотик жидкой среде и полученные наращиванием одной снятой с агара бактериальной колонии.

Если плазмидные векторы (например, pUC) реплицируются в клетке с образованием большого числа копий, то соответствующие плазмиды можно получить в больших количествах из культур, выращенных в стандартной LB-среде до достижения поздней логарифмической фазы (примерно 18 ч).

Однако если используемый вектор реплицируется не столь бесконтрольно (как, например, плазмида pBR322), его приходится селективно амплифицировать инкубацией бактериальной культуры в течение нескольких часов в среде с хлорамфениколом (170 мкг/мл).

Хлорамфеникол ингибирует синтез белков клетки-хозяина и тем самым нарушает репликацию бактериальной хромосомы.

При этом репликация плазмид продолжается еще в течение нескольких часов, что позволяет значительно увеличить выход плазмидной ДНК по сравнению с неамплифицированными культурами.

Основные методы очистки плазмидной ДНК

Большинство методов вьщеления плазмид основаны на том, что последние имеют ковалентно замкнутую кольцевую форму (ССС) и гораздо меньшие размеры, чем бактериальная хромосома.

Бактериальные клетки собирают центрифугированием и лидируют, обычно с помощью ЭДТА и лизоцима, разрушающего клеточную стенку. Можно также использовать органические растворители, нагревание, неионные детергенты.

Фрагменты клеток и бактериальной хромосомы после лизиса удаляют центрифугированием.

Чаще всего при работе с культурами любого объема — как малого, так и большого — используется предложенный в работе щелочной метод вьщеления.

В присутствии щелочи основная масса загрязняющих плазмидную ДНК фрагментов хромосомной ДНК, белков и РНК выпадает в осадок, так что получаемые препараты плазмидной ДНК оказываются достаточно чистыми для обработки рестриктирующими эндонуклеазами и последующего клонирования.

Для дальнейшей очистки выделенной плазмидной ДНК можно провести центрифугирование в равновесном градиенте плотности в присутствии красителя.

В основе щелочного метода лежит то, что в щелочных условиях (при рН ~ 12) происходит денатурация только линейных молекул ДНК (т. е. разделение цепей двухцепочечной ДНК клетки-хозяина), плазмидные же ССС-молекулы не денатурируют.

При нейтрализации клеточного экстракта в присутствии солей высокой концентрации денатурированная хромосомная ДНК выпадает в осадок, поскольку реассоциация длинных линейных одноцепочечных молекул ДНК происходит в этих условиях одновременно во множестве участков с образованием нерастворимых комплексов.

Клеточная РНК и белки тоже осаждаются вследствие того, что при осаждении используется детергент ДСН. В протоколе описан в деталях вариант этого метода для вьщеления небольших количеств плазмидной ДНК из Е. coli K12, а в протоколе — метод получения больших количеств более чистой плазмидной ДНК, включающий центрифугирование в равновесном градиенте плотности в присутствии красителя.

– Читать далее “Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры”

Оглавление темы “Выделение ДНК и РНК. Плазмиды”:
1. Одновременное выделение ДНК и РНК. Техника одновременного выделения ДНК и РНК
2. Очистка poly(A)+-PHK. Выделение poly(A)+-PHK
3. Анализ РНК и ДНК. Электрофорез в агарозном геле
4. Электрофорез РНК в формальдегидном геле. Количественный анализ нуклеиновых кислот
5. Определение концентрации ДНК/РНК в УФ-свете. Бактериальные плазмиды
6. Получение компетентных клеток Escherichia coli. Трансформация Escherichia coli плазмидами
7. Выделение и очистка плазмидной ДНК. Щелочной метод очистки плазмидной ДНК
8. Очистка плазмидной ДНК при центрифугировании. Выделение плазмидной ДНК из бактериальной культуры
9. Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК
10. Мечение нуклеиновых кислот. Разновидности мечения нуклеиновых кислот

Источник: https://medicalplanet.su/genetica/330.html

Выделение плазмидной ДНК из больших объемов бактериальных культур. Техника выделения плазмидной ДНК

9.4. Выделение плазмидной ДНК.: Аналитические количества плазмидной ДНК выделяли двумя способами:

1. Инокулируют 30 мл среды LB (содержащей соответствующий антибиотик) 1/100 ее объема (300 мкл) ночной культуры, полученной из одной бактериальной колонии, содержащей интересующую плазмиду.

Выращивают бактериальную культуру при 37 С со встряхиванием (200 об/мин) до поздней логарифмической фазы (для достижения ОД600 ~ 0,6 необходимо 2-3 ч).

2. Инокулируют 500 мл нагретой до 37 С и содержащей соответствующий антибиотик среды LB, налитой в колбу на 2 л, 25 мл культуры, полученной на первом этапе. Инкубируют при 37 С при интенсивном встряхивании (200 об/мин) в течение 2,5 ч. ОД600 по окончании инкубации должно составлять ~ 1,0.

• Дополнительный этап: для выделения низкокопийных плазмид (типа pBR322) к культуре добавляют 2,5 мл хлорамфеникола (34 мг/мл в этаноле) до конечной концентрации в культуре 170 мкг/мл.

3. Растят культуру еще 12—16 ч (обычно в течение ночи) при 37 °С при интенсивном встряхивании (200 об/мин).

4. Собирают бактериальные клетки центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин (ротор Sorvall GSA или его аналог). Сливают супернатант, центрифужные стаканы переворачивают и дают супернатанту полностью стечь.

5. Ресуспендируют при встряхивании осадок бактериальных клеток в 10 мл содержащего лизоцим (2 мг/мл) буфера I и инкубируют их 10 мин во льду.

6. Добавляют 20 мл раствора II, закрывают центрифужный стакан и тщательно перемешивают его содержимое, несколько раз перевернув стакан. Инкубируют 5 мин во льду.

7. Добавляют 20 мл холодного раствора III, закрывают центрифужный стакан и тщательно перемешивают его содержимое встряхиванием. Инкубируют во льду от 10 до 20 мин. За это время должен образоваться рыхлый белый осадок, содержащий хромосомную ДНК, РНК и белково-мембранные комплексы.

8. Бактериальный лизат центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин при 4°С (ротор GS3 или его аналог).

9. Супернатант фильтруют через марлю в центрифужный стакан на 250 мл, добавляют 0,6 объема изопропанола, хорошо перемешивают и для образования осадка нуклеиновых кислот помещают на -20 С на 20 мин.

10. Осадок нуклеиновых кислот собирают центрифугированием при 10 000 g в течение 10 мин при 4 С (ротор Sorvall GS3 или его аналог).

11. Осторожно сливают супернатант, переворачивают пробирку и дают полностью стечь супернатанту (примерно 30 мин при комнатной температуре).

12. Растворяют осадок нуклеиновых кислот в 8,8 мл ТЭ.

13. К 8,8 мл ресуспендированного осадка добавляют сухой CsCI из расчета 1 г на 1 мл раствора ДНК, аккуратно перемешивают до растворения CsCl, добавляют 0,4 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл в воде),

14. С помощью пастеровской пипетки или одноразового шприца переносят красный прозрачный раствор в быстрозаплавляемую пробирку Beckman (или аналогичную) и заполняют ее доверху легким минеральным маслом.

Заплавляют пробирку согласно указаниям фирмы-изготовителя и центрифугируют при 100 000 g в течение 40 ч при 20 С (например, в роторе Beckman 50Ti).

Можно использовать угловые и вертикальные роторы других фирм (например, Beckman 70Ti; в этом случае центрифугирование проводят при 250 000 g в течение 16 ч). Пробирки должны быть уравновешены с точностью до 0,02 г.

15. Чтобы отобрать плазмидную ДНК, прокалывают верхнюю часть пробирки с помощью иглы для подкожных инъекций № 19, чтобы в пробирку вошел воздух.

Затем вводят иглу № 21, надетую на шприц на 2 мл (скошенной стороной вверх), в нижнюю окрашенную в красный цвет зону, отбирают плазмидную ДНК и переносят ее в стерильную пробирку.

Если количество плазмидной ДНК невелико, то для ее визуализации пробирку освещают длинноволновым УФ-светом.

16. Бромистый этидий экстрагируют с помощью насыщенного водой изобутилового спирта. Для этого к раствору плазмидной ДНК добавляют равный объем насыщенного изобутилового спирта, перемешивают и отбирают верхний слой. Операцию повторяют до тех пор, пока изобутиловый спирт не перестанет окрашиваться.

17. Для удаления из раствора ДНК CsCl добавляют равное количество воды и переосаждают ДНК двумя объемами этанола при 4 С в течение 15 мин.

Плазмидную ДНК собирают центрифугированием при 10 000 g в течение 15 мин при 4 °С (ротор Sorvall SS34 или его аналог); осадок ДНК растворяют примерно в 1 мл ТЭ.

Определяют ОД260 конечного раствора ДНК и рассчитывают его концентрацию. Разливают раствор ДНК на аликвоты и хранят при —20 °С.

– Состав этих растворов приведен в протоколе. – Состав этих растворов приведен в протоколе. – Буфер ТЭ: 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/9_1161_videlenie-plazmidnoy-dnk-iz-bolshih-ob-emov-bakterialnih-kultur-tehnika-videleniya-plazmidnoy-dnk.html

Medic-studio
Добавить комментарий