Биореакторы для клеток животных и растений: Для глубинного культивирования клеток в суспензии в промышленных

Раздел

Биореакторы для клеток животных и растений: Для глубинного культивирования клеток в суспензии в промышленных

главы: Разделы учебника: Реклама

Суспензионные культуры – отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.

Суспензионные культуры широко используются в качестве модельных систем для изучения путей вторичного метаболизма, индукции ферментов и экспрессии генов, деградации чужеродных соединений, цитологических исследований и др.

Признаком “хорошей” линии служит способность клеток к перестройке метаболизма и и высокая скорость размножения в конкретных условиях культивирования.

Морфологические характеристики такой линии:

  • высокая степень дезагрегации (5-10 клеток в группе);
  • морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма);
  • отсутствие трахеидоподобных элементов.

Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на качалке, имеющей скорость перемешивания 100 – 120 об/мин.

При первом переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и крупные агрегаты, фильтруя через 1 – 2 слоя марли, нейлоновые сита, шприц с соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной культуры необходимо 2 – 3 г свежей массы каллусной культуры на 60 – 100 мл жидкой питательной среды.

Однако для каждой линии культуры клеток существует минимальный объем инокулята, при меньшем размере которого культура не растет.

Рост суспензионных культур клеток можно оценивать по одному или нескольким следующим параметрам:

1. Объем осажденных клеток (ООК). Переносят небольшой объем суспензионной культуры в мерную пробирку объемом 15 мл, лучше всего коническую. Центрифугируют 5 минут при 200 g. ООК – величина, которую составляет объем осадка от объема суспензии, обычно в %.

2. Число клеток. Подсчитывается в камере Фукса-Розенталя.

3. Сырая и сухая масса. Суспензия клеток фильтруется через смоченный и взвешенный фильтр, вложенный в воронку Бюхнера под слабым вакуумом.

Клетки промывают дистиллированной водой, оттягивают воду под вакуумом и взвешивают снова вместе с фильтром.

Сухая масса – определяется аналогично, но взвешивается сухой фильтр, а клетки сушат вместе с фильтром в термостате при 60оС до постоянной массы.

4. белка. Для определения белка клетки собирают на фильтре из стекловолокна, дважды промывают кипящим раствором 70% этанола, сушат ацетоном, гидролизуют 1М NaOH при температуре 85оС полтора часа. Затем фильтруют и определяют белок по Лоури.

5. Проводимость среды. Определяют с помощью кондуктометра. Как правило, она обратно пропорциональна свежей массе клеток.

6. Жизнеспособность клеток. Оценивают, изучая движение цитоплазмы под микроскопом, а также с помощью прижизненных красителей (флюоресцеиндиацетат, соли тетразолия, синий Эванса). Перед использованием подбирают рН инкубационного буфера, концентрацию красителя, время инкубации, строят калибровочные кривые для смеси живых и убитых клеток.

По полученным данным строят ростовые кривые, которые имеют S-образную форму и состоят из нескольких участков: 1- латентная, или лаг-фаза, где видимый рост не наблюдается ни по одному из критериев; 2 – экспоненциальная, рост с ускорением; 3 – линейная, где скорость роста постоянна; 4 – фаза замедленного роста; 5 – стационарная фаза; 6 – фаза деградации клеток (рис. 11).

Реальная ростовая кривая может несколько отличаться от модельной. На форму ростовых кривых влияют и генетическая характеристика популяции (вид растения), и количество инокулята, и условия выращивания (состав среды, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания).

Необходимо отметить, что ростовые кривые для разных критериев не идентичны. Дисбаланс между скоростями клеточного размножения (число клеток), синтеза структурных элементов клетки (сухая масса) и увеличения объема и содержания вакуолей (сырая масса) отражает специфику онтогенеза высшего растения.

Для глубинного культивирования растительных клеток применимы способы, разработанные в микробиологии. Различают два вида систем культивирования: открытую и закрытую.

Для закрытой системы характерен периодический режим выращивания. Клеточная масса (инокулят) помещается в определенный объем среды. Система закрыта по всем параметрам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объеме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращивания.

Открытые (проточные) культуры характеризуются поступлением свежей питательной среды, при котором отбирается не только старая питательная среда, но и часть урожая клеточной массы.

Наиболее изучено и распространено закрытое глубинное культивирование. Для аэрации и перешивания используют различную аппаратуру: роллеры, качалки, магнитные мешалки и т.д.

Очень большое значение для роста и биосинтеза клеток in vitro имеют технические характеристики систем культивирования.

При масштабировании от небольших по объему культур в колбах до больших многолитровых ферментеров меняются многие параметры культивирования, в частности аэрация и перемешиваемость.

Для культивирования суспензий в производственных масштабах применяется аппаратура, разработанная для микробиологической промышленности, однако исследования последних лет показали, что растительные клетки в силу своих специфических особенностей требуют особых сосудов для культивирования.

Клетки растений в десятки, сотни раз крупнее клеток бактерий и грибов, кроме того, их размеры меняются в процессе онтогенеза. Если в начале экспоненциальной фазы роста они мелкие и плотные, то в стационарной фазе роста они сильно увеличиваются в размерах и вакуолизируются.

Чем крупнее становится клетка, тем больше возрастает опасность ее механического повреждения в процессе перемешивания. В то же время клетки растений, крупные и тяжелые, требуют эффективного перемешивания.

Оседание их приводит к появлению «мертвых» зон в сосудах, в которых происходит быстрое накопление и старение клеток.

Для культуры клеток женьшеня отрицательное влияние механического стресса при выращивании в ферментере с турбинными мешалками сказывалось на жизнеспособности клеток уже при скоростях мешалок свыше 100—350 об/мин, это отрицательно влияло на синтез ими антрахинонов. Устойчивость штамма к механическому стрессу является важным требованием к культуре и трудной задачей для исследователей.

Мягкое перемешивание и аэрацию обеспечивает пневматический способ перемешивания потоком сжатого стерильного воздуха, подаваемого в ферментер с восходящим током воздуха.

К сожалению, и этот способ имеет свой недостаток, потому что в культуральной среде возникает избыток воздуха, приводящий к кислородному голоданию. От концентрации кислорода в среде зависят рост и вторичный метаболизм клеток.

В микробиологических системах изучена взаимозависимость роста биомассы, выхода искомого продукта и снабжения кислородом. Для растений таких данных нет.

На рост клеток, кроме кислорода, могут влиять и другие газы. Например, углекислый газ может существенно влиять на длину лаг-фазы. Высокая степень аэрации может оказывать негативное действие на рост и синтез продуктов вторичного метаболизма, поскольку удаляются углекислый газ и летучие соединения.

Клетки растений in vitro по сравнению с микроорганизмами имеют низкую интенсивность дыхания, что тоже должно учитываться при конструировании сосуда для культивирования. Сравнивали рост и образование метаболитов клетками в ферментерах разных типов.

Клетки моринды лимонолистной, культивируемые в ферментерах с продувкой воздуха, содержали антрахинона на 30% больше, чем в перемешиваемых колбах, и в два раза больше, чем в ферментерах других систем. Выход биомассы клеток не менялся в зависимости от типа биореактора.

Клетки барвинка розового (Catharantus roseus) также синтезировали больше индольных алкалоидов при культивировании в ферментере с продувкой воздуха, чем в биореакторах с механическим перемешиванием.

Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений — высокая плотность, необходимая для роста. Поэтому другим осложнением при культивировании клеток растений является увеличение вязкости, со провождающее рост биомассы. Это ведет к адгезии.

Адгезия (прилипание) клеток друг к другу, на поверхностях культурального сосуда и погруженных в него мешалок и датчиков вызывает затруднения. В верхней части сосуда постепенно может образовываться пена, состоящая из выделяемых клетками белков и полисахаридов. В процессе культивирования клетки слипаются и часть из них скапливается в этой пене, образуя «корку», или «безе».

С увеличением биомассы клеток увеличивается и эта «корка», снижая интенсивность перемешивания, что в конце концов может привести культуру к гибели.

Клетки растений обладают меньшей физиологической и метаболической активностью по сравнению с микроорганизмами. Время генерации (интервал времени между двумя последовательными клеточными делениями) растительной клетки в 60—100 раз превосходит время генерации микробной клетки. Пул пролиферирующих клеток не превышает 50—60%, многие клетки быстро прекращают деление и переходят в фазу покоя.

Все эти обстоятельства определяют продолжительный рост популяции клеток при накопительном, или периодическом, выращивании. Поддержание стерильности длительное время также является одной из технических проблем, особенно при непрерывном культивировании.

Периодическое, или накопительное, культивирование — это самый простой способ выращивания клеток, являющийся пока традиционным. Суспензионные культуры используют для промышленного получения вторичных метаболитов.

Вещества, продуцируемые растительными клетками используются в медицине, парфюмерной промышленности, растениеводстве и других отраслях промышленности.

К ним относятся: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, пигменты, антиканцерогены (птотецин, харрингтонин), пептиды (ингибиторы фитовирусов).

В настоящее время в разных странах около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения экономически важных веществ, среди них — женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, беладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, мак снотворный и др.

Получение вторичных метаболитов имеет свои особенности. Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной фазе.

Некоторые алкалоиды активно синтезируются в фазе максимальной митотической активности (экспоненциальный рост), что является исключением. Знание таких закономерностей позволяет регулировать процессы получения ценных веществ.

Механизмы и условия, блокирующие активный рост клеток и клеточную пролиферацию, одновременно активируют ферменты вторичного метаболизма. Неспецифические стрессовые условия, воздействующие на клетки в конце экспоненциальной фазы, могут стимулировать переход к синтезу вторичных метаболитов и увеличивать их выход.

Необходимо учитывать, что вопрос взаимодействия первичного и вторичного метаболизма, рассмотренный нами в упрощенном виде, намного сложнее.

Читать дальше ► особенности культивирования одиночных клеток

Источник: http://www.biotechnolog.ru/pcell/pcell1_5.htm

Биореакторы для культур клеток

Биореакторы для клеток животных и растений: Для глубинного культивирования клеток в суспензии в промышленных

01.12.2015

Биореакторы для культур клеток

Клетки животных во многом отличаются от прокариотических и грибных клеток: они медленнее растут, у них большая чувствительность к ранению и пузырькам воздуха. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореакторов, в особенности системы перемешивания и аэрации, которые при работе не должны создавать стрессовых условий для культуры.

Перемешивание должно быть гомогенным, чтобы избежать градиентов температуры и рН, повышенных концентраций субстрата и продуктов. При этом необходимо учитывать чувствительность клеток к ранению.

Обычно перемешивание осуществляется большими лопастными мешалками при низких скоростях.

Пневматическое (воздушное) перемешивание в эрлифтных реакторах или гидравлическое перемешивание с помощью внешних насосов в реакторах с взвешенной твердой фазой ( fluidized bed reactors) также решает проблемы, связанные с культивированием.

Для предотвращения пенообразования и повреждения клеток пузырьками воздуха можно уменьшить объем подаваемой газовой смеси, использовать поверхностную продувку или безпузырьковую аэрацию через мембраны.

При сокращении объема подаваемого газа необходимо увеличить в нем концентрацию кислорода. Оптимальное снабжение кислородом, азотом, воздухом и углекислым газом создается с помощью систем перемешивания газов.

Выращивание животных клеток можно осуществлять в стационарной ( batch), стационарной с подпиткой ( fed- batch) или непрерывной ( continuous) культуре с задержанием биомассы или без. При стационарном культивировании клетки растут без добавления субстрата после посева культуры.

Однако, недостаток субстрата или образование токсичных продуктов метаболизма может снизить продуктивность. Чтобы избежать этих проблем применяют стационарное культивирование с подпиткой, при котором субстрат или другие необходимые вещества добавляют порциями или непрерывно.

При непрерывном культивировании продукты метаболизма, ингибирующие рост – лактат, аммоний, удаляют, добавляя компенсирующий объем свежей среды, чтобы избежать недостатка субстрата для роста.

Из-за низкой продуктивности, связанной с медленным ростом, для клеток животных предпочтителен непрерывный процесс культивирования с задержанием клеток (перфузионная система). Это приводит к большей плотности культуры клеток и большему контакту с ними среды, что увеличивает продуктивность.

Для задержания биомассы и предотвращения ее выноса с удаляемыми объемами культуральной жидкости используют различные системы фильтрации, например, роторные или вращающиеся фильтры.

Многие клетки млекопитающих растут только будучи прикрепленными к поверхности. Такие опорнозависимые клетки иммобилизуют на микроносителях, таких как стекло, целлюлоза, коллаген, желатин или пластик.

Если носитель пористый, клетки могут расти внутри него, при этом они защищены от раневого стресса, что позволяет использовать более высокие скорости перемешивания и продувки в процессе культивирования.

Компания Bioengineering предлагает большой ассортимент реакторов для обеспечения наилучших условий культивирования различных типов клеток.

Клеточный ферментер – биореактор 

Клеточный ферментер (биореактор) представляет собой резервуар с мешалкой, сконструированный для культивирования клеток животных. Он доступен в пилотном и производственном масштабе (общим объемом до 2000 л). Для минимизации стресса при ранении перемешивание осуществляется лопастной мешалкой морского типа.

Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой, а также непрерывным благодаря наличию тензодатчиков. Реактор используется для культивирования взвеси клеток или клеток, иммобилизованных на микроносителях. Для задержания биомассы при непрерывном культивировании можно использовать роторные или спиральные фильтры (см. ниже).

Встроенное устройство пробоотбора обеспечивает стерильный отбор контагиозных клеток (например, для производства вирусов).

Для того, чтобы не травмировать клетки в процессе продувки можно установить различные системы аэрации, например, пульверизаторы (барбатеры), систему поверхностной аэрации или использовать безпузырьковую продувку через силиконовые трубочки.

Эрлифтный ферментер

В этих ферментерах перемешивание осуществляется потоком воздуха, а не лопастью мешалки, обеспечивая эффективный массоперенос и низкие силы рассечения.

Для контроля за циркуляцией жидкости можно установить вытяжную трубу, направляющую поток пузырьков по центру. Распределение газа может осуществляться с помощью перфорированных, пористых или гидрофобных трубок.

Если клетки могут повредиться пузырьками газа, можно установить систему безпузырьковой аэрации через силиконовые трубочки.

Биореакторы доступны как лабораторные, так и промышленные. Последние имеют широкую верхнюю часть, действующую как сепаратор газов.

Компания Bioengineering предлагает также visual safety airlift fermenter с рабочим объемом в 20 л, с легко снимаемой стерилизуемой фольгой вместо стеклянной или стальной оболочки. Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой или непрерывным. Эрлифтные ферментеры подходят для культивирования суспензий клеток, включая клетки насекомых.

 

Биореактор с взвешенной твердой фазой ( Fluidized bed reactor )

Биореакторы, которые поддерживают носители с иммобилизованными клетками в состоянии суспензии, называются реакторами с взвешенной твердой фазой ( fluidized bed reators).

Обычно в этих реакторах присутствует три фазы – твердая, жидкая и газообразная. Для непрерывного культивирования с задержанием биомассы используется специально разработанная система сепарации. Она состоит из различных камер и обеспечивает полное задержание частиц при перфузионных процессах.

Перемешивание достигается с помощью продувки. Это обеспечивает низкий раневой стресс и равномерный массоперенос. Для чувствительных клеток имеется система безпузырьковой аэрации через силиконовые мембраны (Forschungszentrum J?lich (a), Informationsblatt).

Общий объем реактора составляет 7 л, он поставляется как со стеклянным, так и со стальным цилиндром. В этих реакторах была достигнута высокая плотность клеток CHO, BHK и гибридомы (Forschungszentrum J?lich (b), Informationsblatt).

Биореакторы с взвешенной твердой фазой рекомендуются для клеток на микроносителях (т.е. нуждающихся в опорной поверхности), для клеток, чувствительных к раневому стрессу, для заключенных в капсулу клеток и для продуцирования продуктов секреции в долговременной культуре клеток.

Для защиты чувствительных клеток в ферментерах с взвешенной твердой фазой можно использовать систему безпузырьковой продувки через силиконовые трубочки (со стенками, армированными стекловолокном), которая предотвращает возникновение градиента кислорода в потоке.

Автоклавируемый ферментер с взвешенной твердой фазой (Autoclavable fluidized bed reactor)

Для лабораторных целей удобен автоклавируемый ферментер с взвешенной твердой фазой ( AWS). Он оборудован магнитным циркуляционным насосом непрерывного действия. Температура контролируется посредством циркуляционного термостата. Ферментер AWS закреплен на раме и может автоклавироваться со всеми аксессуарами.

 

Биореактор с фиксированной твердой фазой (Fixed bed reactor)

Как альтернативу для культивирования клеток, нуждающихся в фиксации для роста, можно использовать биореактор с фиксированной твердой фазой, в котором клетки и их носители захватываются в закрепленную подложку. Эта система не нуждается в сепарационных приемах для удаления жидкой фазы. Раневой стресс и повреждение клеток пузырьками газа минимальны.

В процессе культивирования через фиксированную подложку циркулирует насыщенная кислородом среда.

Поэтому при аксиальном потоке длина подложки является критическим параметром, поскольку обеспечение культуры кислородом и питательными веществами может быть недостаточным.

В больших реакторах эту проблему можно решить с помощью радиально распространяющегося потока. Среда, обогащенная продуктами метаболизма, удаляется непрерывно или периодически.

Компания Bioengineering предлагает вставные корзины с подложками для маленьких лабораторных ферментеров ( KLF) и лабораторных ферментеров ( NLF, 19 л). Среда через подложки распространяется радиально.

Возможно увеличение объема подложки до 40-75 л (500-1000 л реакторы). В таких реакторах выращивают нуждающиеся в имобилизации и чувствительные к ранению клетки.

Система подходит и для долговременного выращивания культур клеток с продуктами метаболизма.

Мембранный ферментер

Мембранный ферментер состоит из внутренней и внешней камер, которые разделены диализной мембраной. Мембрана обеспечивает безпузырьковую продувку и задержание биомассы при непрерывном культивировании.

С помощью мембранной технологии токсические (низкомолекулярные) метаболиты удаляются, а (высокомолекулярные) соединения удерживаются во внутренней камере (P?rtner et al. 1992). Перемешивание в каждой из камер осуществляется мешалкой. Среда и воздух поставляются во внешнюю камеру.

Внешняя камера имеет общий объем 7.1 л, а внутренняя – 2.4 л. Биореактор был сконструирован для непрерывного культивирования, но может быть также использован в стационарных и стационарных с подпиткой процессах.

Взвешенные клетки, а также клетки, нуждающиеся в закреплении на микроносителях, также могут выращиваться в этом биореакторе (Bohmann et al., 1992; Bohmann et al., 1993).

 

Системы фильтрации

Системы фильтрации используются при непрерывном культивировании клеток животных с задержанием биомассы. Компания Bioengineering предлагает два различных типа фильтров.

Роторный фильтр

Роторный фильтр основан на технологии просеивания при вращении. Он может быть вставлен непосредственно в сосуд биореактора или использоваться как внешняя проточная система. В первом случае преимущество состоит в компактности системы.

Второй вариант более гибкий, поскольку в процессе культивирования фильтр может быть демонтирован, промыт, простерилизован и подключен заново.

Превосходное задержание биомассы (80% и более) без ее повреждения достигается даже при крупномасштабном культивировании, которое характеризуется долговременностью и высокими скоростями потока (S?meghy).

 

Спиральный фильтр

Спиральный фильтр основан на принципе мембранной фильтрации. Он был специально разработан для больших объемов прокачиваемой среды при минимальной затрате энергии (Winzeler 1990).

Спиральный фильтр соединяется с биореактором с помощью проточной системы и может стерилизоваться как на месте, так и в автоклаве.

Он особенно удобен для задержания клеток, а также для свободного от клеток пробоотбора, поскольку силы травмирования очень малы.

Список литературы

A. Bohmann, R. P?rtner, H. M?rkl The membrane dialysis bioreactor – a reactor concept for continuous cultivation of animal cells. In: DECHEMA Biotechnology and Bioengineering, Vol, 41, 1993, 

1092-272

A. Bohmann, R. P?rtner, J. Schmiedling, V. Kasche, H. M?rkl 
The membrane dialysis bioreactor with integrated radial-flow fixed bed-a new approach for continuous cultivation of animal cells. In: Cytotechnology, 9, 1992, 51-57

Forschungszentrum J?lich GmbH (ed.) a  Reaktorintegrierte blasenfreie Begasung von Wirbelschichtreaktoren. 

Informationsblatt des Forschungszentrums J?lich GmbH, J?lich o.J.

Forschungszentrum J?lich GmbH (ed.) b  Integrated bioprocess engineering for antibody production. Informationsblatt des 

Forschungszentrums J?lich GmbH, J?lich o. J.

R. P?rtner, A. Bohmann, J. Schmiedling, V. Kasche, H. M?rkl  Metabolic parameters and stability of suspended and immobilized hybridoma cells. 

In: DECHEMA Biotechnology conferences 5, Frankfurt a. M., 1992, 309-312

Z. S?meghy 
Improved cell retention system the rotating sieve technique. (A copy of the manuscript is available at Bioengineering AG)

H. B. Winzeler 
Spiral stack membrane module. High performance low energy input membrane separation unit. In: Chimia 44, 1990, 288-291

Источник: https://bio-rus.ru/stati/bioreaktoryi-dlya-kultur-kletok.html

Medic-studio
Добавить комментарий