ЭФРИН (Ephrin): Относится к группе хемоцитокинов, опосредующих миграцию клеток или

Характеристика отдельных групп цитокинов

ЭФРИН (Ephrin): Относится к группе хемоцитокинов, опосредующих миграцию клеток или

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЦИТОКИНЫ (Cytokines)

Полипептиды, продуцируемые многими типами клеток, активированными лимфоцитами, макрофагами, а также клетками эндотелия, эпителия и соединительной ткани. Модулируют функцию огромного большинства клеток организма, включая клетки нервной системы. Основная активность цитокинов связана с участием в клеточном иммунном ответе и процессах острого и хронического воспаления.

Классификация цитокинов. Монокины – цитокины, которые продуцируются мононуклеарными фагоцитами; аналогичные пептиды, синтезируемые в лимфоцитах – лимфокины. Кроме того, макрофаги и моноциты продуцируют Фактор, стимулирующий рост колоний (Colony Stimulating Factor 1, CSF-1).

Интерлейкины – полипептиды, составляющие большое семейство цитокинов, продуцируемые клетками гематопоэза. Хемокины – подсемейство цитокинов, которые стимулируют активность и хемотаксическую подвижность лейкоцитов, и непосредственно причастны к развитию воспалительного ответа.

Цитокины регулируют следующие функции, связанные с активностью лимфоцитов:

· Рост, дифференцировка клеток (интерлейкины IL-2, IL-4; а также IL-1, TGF-beta).

· Регуляция естественного иммунитета (TGF-alpha; IL-1beta; интерфероны 1-го типа IFN- alpha, IFN-beta; IL-6).

· Стимуляция провоспалительной активности макрофагов, как следствие иммунной реакции (IFN-gamma; TGF-alpha, TGF-beta; IL-5, IL-10, IL-12).

· Регуляция хемотаксической активности лимфоцитов (большинство хемокинов).

· Стимуляция гематопоэза за счет влияния на рост и дифференцировку клеток (различные клетки группы SCFs; IL-3, IL-7; Фактор стволовых клеток /SCF/).

· Регуляция активности нейрональных клеток (астроцитов, олигодендритов, глии) в период развития, организации нейротрансмиссии, участие в травматических и нейродегенеративных заболеваниях мозга.

Далее приведена характеристика отдельных групп цитокинов.

1. ХЕМОКИНЫ (Chemokines)

нервный клетка мозг рост

Структура. Рецепторы.

Структурно хемокины включают четыре класса соединений (C, CC, CXC, CX3C) с МВ 8-14 кДа, различающиеся по последовательности аминокислотных остатков и включения цистеиновых остатков, “оформляющих” функциональную структуру молекулы. К цитокинам причисляют некоторые факторы роста (TGF), отличающиеся по химической структуре, но взаимодействующие с рецепторами общего с цитокинами типа.

Хемокины реагируют с семью трансмембранными рецепторами, пространственная структура которых однотипна, активируя гетеродимерные G-белки. Для большинства хемокинов трансдукторный сигнал включает торможение цАМФ и увеличение содержания внутриклеточного Са++.

Далее активируется цепь сигнальных процессов (митоген- активированные протеинкиназы MAPK's, фосфоинозитид 3-киназа, GTP-связывающие белки и др.

), которые составляют необходимую цепь процессов, приводящих к реорганизации цитоскелета и миграции клеток (Thelen, 2001).

Регуляция функций мозга в норме и при патологии.

Влияние на нервные клетки. Все типы клеток нервной системы (астроциты, олигодендроциты, микроглия и нейроны) включают рецепторы цитокинов. Их экспрессия регулируется медиаторами воспаления, типа TGF-beta1 или интерферона.

Хемокины CX3CL1 (Fractalkine) и CXCL12 (Stromal-derived-factor 1alpha) экспрессируются, соответственно, в нейронах и астроцитах. Хемокины играют существенную роль в развитии нервной ткани: экспрессия рецепторов связана с миграцией нейрональных прогениторов.

Экспрессия хемокина CCL2 в нейронах и рецептора CXCR3 в астроцитах выявлена в фетальном мозге человека (Meng et al. 1999). Нокаут хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCL12 приводил к морфологической деструкции нейронов, выявлявшейся вскоре после рождения животных (Ma et al. 1998).

Показано, что рилизинг глутамата из астроцитов регулируется хемокинами; CXCL12 не только стимулирует транспорт Са++ в культуре гранулярных клеток, но также влияет на спонтанную синаптическую активность клеток Пуркинье в срезах мозжечка (Bezzi et al. 2001; Limatola et al. 2000).

В сравнении с огромным множеством разновидностей хемокинов, выявляемых на периферии, в клетках мозга описано небольшое число хемокинов, играющих, однако, значительную роль в процессах нейродегенерации. Глиальные хемокины выполняют функцию посредников инфильтрационных процессов при воспалении ЦНС.

Эксперименты на культуре глиальных клеток показали, что среди хемокинов выявляются факторы как стимулирующие, так и тормозящие воспалительные реакции. Ряд хемокинов (CCL2, CCL3, CXCL10, CCL21), будучи связанными с нейродегенерацией, экспрессируется в самих нейронах.

Однако индукция их активности относится к первым 6-12 часам развития повреждения, тогда как хемокины глии выявляются лишь на 1-3 сутки процесса (Wang et al.1998; Schreiber et al. 2000; Che et al. 2001).

Экспрессия хемокинов и их рецепторов в структурах нервной ткани документирована при болезни Альцгеймера, рассеянном склерозе, менингитах, HIV-1-ассоциированной деменции, травме головного мозга, контузии спинного мозга.

В этих заболеваниях участвуют IL-8, MCP (Monocyte Chemoattractant protein), IP-10 (Interferon-inducible Protein), MIG (Monokine induced by Interferon-Gamma), MIP (Macrophage Inflammatory Protein) (см. обзор Biber et al. 2002).

2. ИНТЕРЛЕЙКИНЫ (Interleukins)

Большая группа регуляторных белков, продуцируемых преимущественно Т-клетками иммунной системы и обладающих полимодальной активностью. Основная функция интерлейкинов состоит в модуляции активности лимфоидных, миелоидных и других клеток, способствовании росту и дифференцировке активированных лимфоцитов, тучных клеток, эозинофилов и др.

Структура. Общая характеристика. Идентифицировано около 20 подгрупп интерлейкинов с МВ в диапазоне 8-25 кДа, составленных как моноцепь аминокислотной последовательности (> 100 единиц). Интерлейкины IL-5 и IL-12 имеют, однако, молекулярную массу порядка 45 и 75 кДа, соответственно, и структурированы как гетеродимеры.

Строение рецепторов большинства интерлейкинов совпадает со структурой лиганда; это сходство распространяется на других представителей кластерной группы: LIF, CNTF, Онкостатин М.

В частности, рецептор IL-6 включает две цепи полипептидов – низкоаффинную альфа-структуру с МВ 80 кДа, содержащую трансмембранный гликопротеин, и бета-цепь (gp130), включающую трансмембранный гликопротеин с МВ 130 кДа, который связывает гетеродимер IL-6 в высокоаффинный трансдукторный комплекс.

Функции интерлейкинов, как факторов локальной межклеточной регуляции, представляются достаточно широкими.

IL-6 (“цитокин повреждения”) продуцируется не только моноцитами, Т-клетками и макрофагами, но также фибробластами и эндотелиальными клетками; IL-15 выделен из культуры эпителия почек.

Интерлейкины как факторы про- или антивоспалительного механизма вовлечены в большой круг патологических процессов.

Отмечается участие IL-1 в патологии ревматоидного артрита; IL-10, -12, -18 как антиангиогенных факторов (и, наоборот, IL-1, -6, -8, -15, как проангиогенных факторов), вовлеченных в патогенез атеросклероза. Отмечена увеличенная продукция IL-1 при вирусном гепатите С, где фактор ингибирует репликацию РНК этого вируса. Ряд публикаций посвящен участию интерлейкинов в легочных заболеваниях (бронхиальная астма, острый респираторный синдром, гипероксия).

У детей с острым респираторным синдромом отмечена повышенная концентрация IL-1 beta (но не IL-6 и TNF-alpha) в крови, ассоциируемая с селективной активацией каспазного пути апоптоза (Ng et al. 2004).

Наряду с NGF, интерлейкины IL-4 и IL-13 вовлечены в патогенез аллергической астмы; предполагается, что блокада их активности может способствовать терапии (Corry, Kheradmand, 2002; Freund, Frossard, 2004).

Увеличенная концентрация IL-6, IL-8 и IL-10 в крови пациентов рака груди коррелирует с клиническми показателями заболевания и может служить прогностическим признаком при регулярном мониторинге (Kozlowski et al. 2003).

Регуляция функций мозга в норме и при патологии.

Центральное введение IL-1beta (15 нг) значительно улучшало показатели поведенческой и когнитивной активности крыс. Эффект интерлейкина сопряжен с изменениями уровня глюкокортикоидов в крови (Song et al. 2003).

Эксперименты на нокаутных животных (дефицит рецептора IL-1rKO) подтверждают регуляторное участие IL-1 в процессах памяти, связанной со структурами гиппокампа.

Эти данные ассоциируются с генетическими нарушениями когнитивных функций у людей при мутациях рецептора IL-1 и нарушениями пострецепторных сигнальных процессов в нейронах (Avital et al. 2003).

Интерлейкины, наряду с другими цитокинами, участвуют в организации функциональной гипоталамо-гипофизарной сети. Общий воспалительный процесс, вызываемый i.p.

введением липополисахарида, вызывает активацию в гипоталамусе и гипофизе провоспалительных факторов (TNF-alpha, IL-1beta, IL-6).

Эти изменения связываются с активацией системы АКТГ/кортикостерон в центральных структурах при генерализованном воспалении (Kariagina et al. 2004).

При ишемическом инсульте установлено увеличение IL-18 в сыворотке крови. У 23 пациентов наряду с признаками неврологического дефицита выявлялось повышение содержания фактора в первые сутки заболевания; контроль уровня IL-18 может быть использован для предиктивной оценки инсульта в клинике (Zaremba, Losy, 2003).

В клинике острой мозговой травмы (48 пациентов) отмечалось увеличение уровня IL-1 в крови, соответствующее степени и характеру поражения (Tasci et al. 2003).

В эксперименте на крысах с травмой мозга содержание IL-6 увеличивалось в первые часы, достигая максимума к концу первых суток нанесения повреждения; инфузия норадреналина, позитивно влиявшая на церебральную перфузию, стимулировала увеличение системного уровня IL-6 (Stover et al. 2003).

Постулируется роль IL-1 в качестве медиатора острых нейродегенеративных процессов и апоптоза клеток мозга, включая болезни Паркинсона, Альцгеймера и эпилепсию. В здоровом мозге экспрессия IL-1 невелика, однако она резко возрастает в ответ на локальную ишемию или системный инсульт мозга. Очевидно, IL-1 может рассматриваться в качестве одной из мишеней терапии (Allan, Pinteaux, 2003).

Описана роль IL-6 как репаративного фактора при повреждениях ЦНС; этот цитокин, активный в широком диапазоне тканей, является агонистом эффектов VEGF (Swartz et al. 2000).

См. также обзор: Робинсон, Труфакин (1999).

3. ФАКТОР, СТИМУЛИРУЮЩИЙ РОСТ КОЛОНИЙ (Colony Stimulating Factor-1, CSF-1)

Относится к числу гематопоэтических цитокинов (Hematopoietic Cytokines), выполняющих функцию про- или антифакторов регуляции гематопоэза. Некоторые из представителей этой группы имеют узкую специфичность; другие, напротив, благодаря широкому спектру, перекрывают функции друг друга.

В эту группу входят в общем перечне члены семейства “Colony Stimulating Factor's (CSF), более подробно поименованные как Granulocyte CSF, Macrophage CSF, Granulocyte-Macrophage CSF, Colony Stimulating Factor-I.

Наименование «Фактор, стимулирующий рост колоний» происходит от впервые открытого агента, стимулировавшего рост дифференцированных миелоидных клеток костного мозга, происходящих из общего предшественника. Относящиеся к CSFs гликопротеины включают также интерлейкин-3 (multi-CSF), интерлейкин-5, эритропоэтин (EPO), тромбопоэтин (TPO).

Структурно эти цитокины относятся к классу “4-?-helical bundle” полипептидов, куда входят также Stem Cell Factor (SCF) и Leukemia Inhibitory Factor (LIF), также обладающие гематопоэтической активностью.

CSFs, как полимодальные регуляторы, участвуют в центральном контроле половой функции (регуляция активности гормонов гипоталамуса) (Cohen et al. 2002); повышенный уровень CSF-1 в сыворотке крови является предвестником преэклампсии (Hayashi et al. 2003); промотируют развитие метастазов рака груди (Sapi, 2004).

Отмечена региональная экспрессия мРНК CSF-1 и его рецептора в мозге. Активация фактора в клетках Пуркинье имеет отношение к постнатальному развитию мозга (Murase, Hayashi, 2002).

Ишемия коры мозга приводит к экспрессии рецептора CSF-1R; установлена корреляция между снижением числа апоптирующих клеток в культуре и протективной активностью CSF-1 (Wang et al. 1999).

Антиапоптическая роль CSF-1 связана с торможением каспазы-3 после экзайтотоксического повреждения клеток гиппокампа (Vincent, Robinson et al. 2002).

При фокальном повреждении мозга выявлена ранняя активация CSF-1 (но не Granulocyte-Macrophage CSF или интерлейкина-3) в микроглии, способствовавшая пролиферации или миграции клеток (Takeuchi et al. 2001; Hao et al. 2002).

При активации микроглии в зоне отложения А-бета-амилоидного пептида в мозге мышей отмечена экспрессия рецепторов CSF-1 (Mitrasinovic et al. 2001; Vincent, Selwood et al. 2002). Эти данные ассоциируются с возможным участием CSF-1 в механизме нейротоксичности при патологии Альцгеймера в качестве протективного агента (Hamilton et al. 2002).

Патология рассеянного склероза ассоциируется со сниженной активностью CSF-1 и его рецептора (Werner et al. 2002).

4. ЭФРИН (Ephrin)

Относится к группе хемоцитокинов, опосредующих миграцию клеток или способствующих их развитию; в первую очередь, представляет интерес влияние на ангиогенез и нервные клетки. Наименование происходит от линии клеток Erytropoiten-Producing

Hepatocellular Carcinoma, где был идентифицирован первый представитель, рецептор Eph A1. Термин EPHRIN относится к лиганду, взаимодействующему с Eph-тирозинкиназным рецептором (Eph-Receptor interacting protein).

Эфрин А является гликозилфосфатидилинозитол- сопряженной молекулой, передающей трансдукторный сигнал к экспрессированным клеткам. Эфрин В – трансмембранный гликопротеин, передающий сигнал к рецепторам обеих групп.

Все эфрины имеют экстраклеточную локализацию и содержат в своей структуре 125 аминокислотных остатков с 4 цистеинами. Эфрин также имеет цитоплазматический домен, включающий 80 остатков. Средний МВ эфринов около 50 кДа. Рецепторы эфринов также подразделяются на две группы с последующими девиациями.

Установлена наивысшая аффинность для взаимодействия Ephrin-А1 с рецепторами EphА1, -А2, -А3, -А4 и Eph-В1; для лиганда Ephrin-В3 – с рецепторами EphА4 и EphВ1. Лиганды Ephrin-В2 и Ephrin-В3 с рецепторами EphА1,-А2 и -А3 не связываются вообще.

Экспрессия эфринов имеет отношение к развитию отдельных нейронов и нейрональной сети. Ephrin-А3 и рецептор Eph А5 экспрессируются в «мшистых волокнах» зрелого мозга. Эксперименты с крысами, подвергнутыми киндлингу (нейрональной «раскачке») и другим эпилептогенным стимулам, показали участие эфринов в регуляции нейрональной пластичности (Xu et al.

2003; Grundwald et al. 2004). Эфрины группы В участвуют в развитии дендритного ствола аксона (Irie, Yamaguchi, 2004). Взаимодействие Ephrin-А2 с EphA's рецепторами способствует регенерации зрительного нерва (Rodger et al. 2004). По-видимому, сигнал, передаваемый Jak/Stat белками от EphА4 включает регуляцию синтеза ацетилхолинэстеразы в мышце (Lai et al.

2004).

Имеются данные об участии эфринов в онкогенезе: сверхэкспрессия рецептора EphА2 сопряжена с интенсивной васкуляризацией при колоректальном раке (Kataoka et al. 2004).

Размещено на Allbest.ur

Источник: https://revolution.allbest.ru/biology/00584253_0.html

Фибробласты определяют направление миграции Шванновских клеток при восстановлении поврежденных нервных волокон посредством ephrin-B/EphB2 сигнального пути

ЭФРИН (Ephrin): Относится к группе хемоцитокинов, опосредующих миграцию клеток или

В отличие от центральной нервной системы, периферические нервные волокна способны полностью восстанавливаться после повреждения. Как известно, Шванновские клетки, отвечающие за формирование миелиновой оболочки нервного волокна, играют центральную роль в регенерации периферических нервов.

Повреждение нерва вызывает критические изменения в дифференцировочном статусе зрелых Шванновских клеток, возвращая им свойства клеток-предшественниц [1].

В результате «дедифференцированные» Шванновские клетки активно пролиферируют, удаляют (вместе с макрофагами) остатки погибших клеток и формируют тубулярные структуры, называемые пучками Бюнгера (Bünger bands), которые направляют концы регенерирующих аксонов для последующего воссоединения.

Подобный «классический» сценарий регенерации нервного волокна применим в случае повреждений, при которых сохраняется базальная мембрана, окружающая волокно (например, при размозжении нерва) [2].

Напротив, намного менее изучен механизм того, как восстанавливаются перерезанные нервные волокна, когда базальная мембрана оказывается разрушенной. Так, уже через пару дней после транссекции нерва между концами аксонов образуется новая ткань (так наз.

«нервный мостик» — nerve bridge), вскоре через которую с обеих сторон начинают мигрировать тяжи дедифференцированных Шванновских клеток, за которыми следуют регенерирующие аксоны [3] (рис. 1, А и Б).

В итоге, примерно через неделю, Шванновские клетки и концы аксонов встречаются в центре «нервного мостика», и структура нервного волокна восстанавливается. Но как Шванновские клетки определяют, в какую сторону им нужно мигрировать? Что происходит между перерезанными волокнами, в месте «нервного мостика», где Шванновские клетки и базальная мембрана отсутствуют?

Первые ответы на эти вопросы предоставляет работа Элисон Ллойд (Alison Lloyd) и ее коллег из Лондонского университетского колледжа (University College London), выполненная совместно с исследователями из Мюнстера (University of Münster), Германия.

Согласно результатам, недавно опубликованным в журнале «Cell», фибробласты, заполняющие «нервный мостик», оказались важнейшими участниками регенеративного процесса. Они способствуют пространственному перераспределению Шванновских клеток за счет активации сигнального пути ephrin-B/EphB2, транскрипционного фактора Sox2 и экспрессии адгезионных молекул.

В результате это позволяет Шванновским клеткам обеспечить направленный рост и воссоединение концов поврежденного нервного волокна.

Вначале авторы обнаружили, что на 2-е сутки после транссекции седалищного нерва у крысы в образовавшемся «нервном мостике» скапливаются клетки, не несущие маркерных молекул Шванновских клеток (S100β и p75NGFR) или аксонов (нейрофиламент RT97), но экспрессирующие типичные для фибробластов фибронектин и пролилгидроксилазу (участвует в синтезе коллагена). Чтобы выяснить, как взаимодействуют Шванновские клетки и фибробласты, исследователи проследили совместное поведение этих клеток in vitro. Как и ожидалось, отдельно культивируемые Шванновские клетки распределялись по поверхности пластика равномерно. Однако при их культивировании с фибробластами происходили кардинальные изменения: Шванновские клетки начинали мигрировать и собирались в кластеры — явление, именуемое «клеточным сортингом» (cell sorting) (рис. 2, А).

Рис.1: Регенерация периферических нерных волокон после транссекции А — Общая схема и роль сигнального пути эфрин-В2–EphB2–Sox2–N-кадгерин во взаимодействии Шванновских клеток и фибробластов. Б — Иммунофлуоресцентный анализ: p75 (зеленый) — Шванновские клетки, RT97 (красный) — аксоны, Hoechst (синий) — клеточные ядра.

Как выяснилось, фибробласты индуцируют подобное поведение Шванновских клеток путем контактных клеточных взаимодействий (изолированных мембран фибробластов достаточно, чтобы вызвать такую кластеризацию).

Наиболее известные медиаторы контактного клеточного сортинга — эфрины (ephrins) и их Eph-рецепторы, наиболее крупное семейство рецепторных тирозинкиназ [4]. Соответственно, авторы проверили гипотезу об участии эфрин/EphR-опосредованных сигналов в сортинге Шванновских клеток.

Действительно, фибробласты экспрессируют эфрин-В2 лиганд, в то время как Шванновские клетки несут соответствующий рецептор — EphB2.

Оба компонента оказались необходимыми и достаточными для кластеризации Шванновских клеток: миРНК-опосредуемое ингибирование EphB2 рецептора отменяет наблюдаемый клеточный сортинг, а добавление к Шванновским клеткам рекомбинантных эфринов типа В запускает образование кластеров в отсутствие фибробластов.

При образовании кластера Шванновские клетки взаимодействуют не только с фибробластами, но и друг с другом, поэтому Parrinello с соавт. изучили экспрессию адгезионных молекул на их поверхности. В монокультурах Шванновских клеток N-кадгерин располагается как на клеточной мембране, так и в цитоплазме.

Но в присутствие фибробластов характер экспрессии молекулы меняется и N-кадгерин скапливается в местах межклеточных контактов.

Как и в случае с описанием эфрин-В2/EphB2 взаимодействия, авторы работы использовали широкий спектр методов, чтобы подемонстрировать первостепенную роль гомофильных N-кадгериновых контактов в сортинге Шванновских клеток.

Важной особенностью клеточного сортинга является устойчивая и долгосрочная реорганизация взаимодействий между клетками при формировании клеточных скоплений, что говорит о весьма вероятных изменениях на уровне генной экспрессии.

Sox2, один из ключевых регуляторов транскрипционной программы эмбриональных и тканеспецифических стволовых клеток, активен в предшественницах Шванновских клеток во время эмбриогенеза, а также в пролиферирующих дедифференцированных Шванновских клетках [5]. Э.

 Ллойд и коллеги предположили, что именно Sox2 может претендовать на роль связующего звена между активацией сигнального пути эфрин/EphR и перераспределением N-кадгерина в Шванновских клетках.

В подтверждение этому, было выявлено, что оверэкспрессия Sox2 достаточна, чтобы воспроизвести кластеризацию Шванновских клеток в отсутствие фибробластов и вызвать локализацию N-кадгерина на мембране в местах межклеточных контактов (рис. 2, Б).

Таким образом, авторы предоставили достаточные свидетельства того, что сигнальный путь эфрин-В2–EphB2–Sox2–N-кадгерин ответственен за формирование кластеров Шванновскими клетками in vitro (рис. 1, А (врезка)).

Но справедливо ли это в случае направленной миграции Шванновских клеток через образованный фибробластами «нервный мостик»? Для ответа на этот вопрос был предложен следующий подход.

Исследователи культивировали флуоресцентно меченые (GFP+) Шванновские клетки и ганглии задних корешков спинного мозга на стрипах с иммобилизированным рекомбинантным эфрином-В2; добавление NGF (фактора роста нервов) служило индуктором роста аксонов из эксплантированного ганглия.

Как ожидалось, Шванновские клетки собирались в тяжи, располагающиеся параллельно стрипам. Более того, аксоны, хаотично распределенные в отсутствие Шванновских клеток, тоже образовывали направленные параллельные пучки (рис. 2, В). Это свидетельствует о том, что Шванновские клетки, сгруппированные в тяжи под действием эфрина-В2, способны координировать миграцию аксонов in vitro.

Рис.2: А — Кластеризация Шванновских клеток (S100β+) в присутствие фибробластов.

Б — Оверэкспрессия Sox2 в Шванновских клетках с помощью аденовирусного вектора вызывает накопление N-кадгерина в местах межклеточных контактов.

В — Эфрин-В2 определяет локализацию Шванновских клеток (зеленый) и аксонов (красный). Г — Нарушение направленного роста аксонов у EphB2−/− мышей (4-й день после частичной транссекции).

В завершение своего детального исследования, Parrinello с соавт.

подтвердили важность эфрин/EphR взаимодействий в восстановлении периферических нервов in vivo с помощью локального введения ингибитора EphB2 рецептора, а также изучая нервную регенерацию у EphB2-дефицитных мышей.

Дефицит сигналов через EphB2 рецептор вызывал дисорганизацию направленного аксонального роста: около половины аксонов отклонялось более чем на 45° от оси нерва, хотя часть аксонов продолжала регенерировать в желаемом направлении (рис. 2, Г).

Несомненно, работа Э. Ллойд и коллег вносит существенный вклад в раскрытие молекулярных основ регенерации периферических нервных волокон после наиболее тяжелого повреждения — транссекции.

И тот факт, что именно фибробласты определяют пространственную ориентацию и миграцию Шванновских клеток при восстановлении нерва, нельзя назвать неожиданным, учитывая ранее известные функции фибробластов в заживлении поврежденных тканей, при воспалении и ангиогенезе [6].

Интересно отметить, что эфрин/EphR сигналы, как и фибробласты, вовлечены в контроль указанных процессов — образования сосудов [7] и репарации тканей, в том числе в центральной нервной системе [8]. Все это прекрасно иллюстрирует общие эволюционные корни регенеративных механизмов в различных тканях и при различных повреждениях.

Тем не менее, сигнальный путь эфрин-В2–EphB2 не следует рассматривать как универсальный молекулярный координатор роста аксонов в центральной и периферической нервной системе.

Хотя EphB2 экспрессируется во многих структурах головного мозга [9], фенотип EphB2−/− мышей не характеризуется грубыми нарушениями развития нервной системы (например, выявлены дефекты в формировании передней спайки полушарий, иннервации внутреннего уха и организации гиппокампальных аксонов) [9–11]. Более того, как показали Parrinello с соавт.

, у EphB2−/− мышей половина регенерирующих аксонов все же сохраняют верное направление роста через «нервный мостик». Это говорит о весьма вероятном наличии дополнительных сигнальных путей, осуществляющих пространственную регуляцию восстановления нервных волокон.

В заключение необходимо отметить, что локальная активация EphB2 может стать верной терапевтической мишенью при лечении различных раневых повреждений. Пока низкомолекулярные агонисты этого рецептора на международном рынке лекарственных средств отсутствуют.

Parrinello S., Napoli I., Ribeiro S., Digby P.W., Fedorova M., Parkinson D.B., Doddrell R.D., Nakayama M., Adams R.H., Lloyd A.C. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 2010; 143(1): 145–155.

Источник: http://genescells.ru/news/fibroblastyi-opredelyayut-napravlenie-migratsii-shvannovskih-kletok-pri-vosstanovlenii-povrezhdennyih-nervnyih-volokon-posredstvom-ephrin-b-ephb2-signalnogo-puti/

Гэб и система ephr/ephrin: связь между нейрососудистыми и нейропсихиатрическими расстройствами

ЭФРИН (Ephrin): Относится к группе хемоцитокинов, опосредующих миграцию клеток или

Структурная целостность гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) необходима для создания и поддержания гомеостаза головного мозга.

Любое нарушение структурных компонентов ГЭБ может оказать разрушительное воздействие на психическое здоровье. За последние пару лет было опубликована череда важных исследований нейрососудистых единиц (НСЕ).

Они рассматривают ГЭБ в качестве потенциальной новой цели для разработки альтернативных методов лечения мозговых и сосудистых патологий.

Структурные компоненты и функции ГЭБ

ГЭБ представляет собой клеточно-сосудистую структуру, отделяющую центральную нервную систему от периферического кровообращения (Obermeier et al., 2013). Он состоит из цереброваскулярных эндотелиальных клеток (ЭК), образующих мозговые сосуды, частей астроцитов и внеклеточного матрикса (ВM), обеспечивающих структурную поддержку (Abbott et al., 2006).

Перициты также имеют отношение к формированию ГЭБ (Cabezas et al., 2014). Все эти элементы выполняют свои функции, формируя селективный физический (Abbott et al.

, 2006), транспортный (Begley and Brightman, 2003) и метаболический (Pardridge, 2003, 2016) барьер, который четко контролирует прохождение молекул в и из паренхимы головного мозга и предотвращает проникновение в мозг токсинов или патогенов (Obermeier et al., 2013).

Рисунок 1. Клеточные и сигнальные компоненты гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) в норме. Сигнальные молекулы из астроцитов, влияют на создание и/или поддержание свойств ГЭБ.

Кроме того, различные представители семейства эфринов (лигандов Eph-рецепторовEphrins) классов «А» и «В», расположенные на астроцитах и/или перицитах, активируют рецепторы EphA и EphB на эндотелиальных клетках (ЭК), чтобы влиять на дифференцировку ЭК во время ангиогенеза и на развитие плотных контактов во время формирования барьера (барьергенеза).

Эндотелиальные клетки

Церебральные ЭК имеют уникальные характеристики по сравнению с периферическими ЭК: клетки связаны друг с другом непрерывными внутриклеточными мультипротеиновыми комплексами, называемыми плотными контактами (рис. 1). Они ограничивают ток межклеточных веществ и направляют молекулы через ГЭБ по контролируемому пути (Abbott et al., 2006).

Такой физический барьер позволяет свободно пропускать в мозг и из него только небольшие газообразные и липофильные молекулы, тогда как большие молекулы должны активно переноситься посредством специальных транспортных систем, таких как глюкозный транспортёр типа 1 (GLUT-1) или транспортер больших нейтральных аминокислот типа 1 (LAT-1) (Borst and Schinkel, 2013).

Потенциально вредные соединения, такие как глутамат, активно выходят из мозга даже против градиента концентрации, что требует АТФ в качестве источника энергии (Hawkins and Viña, 2016).

Как правило, большие гидрофильные молекулы не могут переноситься через ГЭБ, за исключением случаев специфического рецепторного или адсорбционно-опосредованного трансцитоза (Pardridge, 2003, 2016, Strazielle и Ghersi-Egea, 2016).

Плотные контакты являются ключевыми регуляторами межклеточной проницаемости. Основными составляющими плотных контактов являются межмембранные молекулы, такие как окклюдины (Yu et al., 2005), которые связываются с цитоскелетом через вспомогательные белки, клаудины (Piehl et al.

, 2010) и соединительные молекулы адгезии (junctional adhesion molecules – JAM-A, -B, -C, Mandel et al., 2012). Во время раннего эмбриогенеза уже происходит прорастание сосудов, активно идет ангиогенез (Obermeier et al., 2013).

Зрелые плотные каналы фиксированы и должны поддерживаться на протяжении всей жизни.

Астроциты

Астроциты через свои отростки, которыми они контактируют с сосудами мозга, регулируют свойства ГЭБ (Kettenmann and Verrratsky, 2008).

Среди других функций регулирование ионного баланса вокруг ГЭБ, секреция и переработка нейротрофических факторов, необходимых для контроля плотных контактов (Gee and Keller, 2005).

В частности, астроциты секретируют такие молекулы, как глиальный нейротрофический фактор (GDNF, Igarashi et al., 1999), трансформирующий ростовой фактор β (TGF-β; Dobolyi et al.

, 2012), ангиопоэтин 1 (ANG1, Easton, 2012), фактор роста фибробластов 2 (FGF2, Reuss и др., 2003) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF; Rosenstein et al., 2010), который действует на ЭК, чтобы либо способствовать образованию плотных контактов, либо регулировать проницаемость ГЭБ (рисунок 1).

Менингеальные кровеносные сосуды, которые не имеют контактов с астроцитами, проявляют более высокую проницаемость сосудов, чем в случае с эндотелиальными клетками ГЭБ, что подтверждает необходимость астроцитов для индуцирования свойств ГЭБ (Lécuyer et al., 2016).

Базальная мембрана

Неклеточный компонент НСЕ представляет собой основную мембрану, состоящую из структурных белков, таких как коллаген-IV, ламинин и фибронектин (Cardoso et al., 2010). Основная функция базальной мембраны заключается в обеспечении стабильности других структур НСЕ и регулировании их взаимодействия (Baeten and Akassoglou, 2011).

Рецепторы эритропоэтин-продуцирующей гепатоцеллюлярной карциномы (EphR) и лиганды, взаимодействующие с Eph-рецепторами (эфрины – ephrin).

В 1990 году впервые была обнаружена система эритропоэтин-продуцирующая гепатоцеллюлярная карцинома (EphR)/ephrin. EphrinA1 был охарактеризован как индуцируемый фактором некроза опухоли (TNF) белок в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC; Holzman et al., 1990).

EphRs/ephrins обычно регулирует контактную зависимость между клетками, определяя их взаимодействие. Во время развития организма эта система играет важную роль в пространственной организации, направлении аксонов, формировании синаптических связей и ремоделировании кровеносных сосудов.

В зрелом возрасте система главным образом регулирует синаптическое ремоделирование, эпителиальную дифференцировку, ремоделирование костных структур, иммунную функцию, секрецию инсулина и самообновление стволовых клеток (Kullander and Klein, 2002; Yamaguchi and Pasquale, 2004; Pasquale, 2005, 2008).

Eph-рецепторы содержат наибольшее семейство рецепторных тирозинкиназ (RTK). Eph-рецепторы и эфрины можно разделить на подклассы A и B. У людей известны девять EphA и пять EphB-рецепторов.

Они состоят из внеклеточной части, включающей глобулярный лигандсвязывающий домен и цитоплазматический домен.

Также эфрины можно отличить по их мембранному прикреплению: эфрины А закреплены с помощью гликозилфосфатидилинозитола (GPI), тогда как Эфрины B присоединены через один трансмембранный домен, содержащий короткую цитоплазматическую PDZ-связывающую часть (Lisabeth et al., 2013).

Система EphR/Ephrin: сигнальные механизмы

Помимо известной двунаправленной сигнализации, активирующейся при взаимодействии между клетками (Pasquale, 2008; Murai and Pasquale, 2011; Klein, 2012; Lisabeth et al., 2013), имеется несколько альтернативных сигнальных механизмов с помощью системы EphR/ephrin.

При взаимодействии рецептор/лигандом активируются несколько нисходящих сигнальных каскадов опосредующих клеточное притягивание-адгезию или отталкивание в зависимости от типа и обилия лигандов и рецепторов, присутствующих на поверхностях клеток (Janes et al., 2012).

Среди прочих, эти сигнальные пути включают Src-семейство киназ, митоген-активированную протеинкиназу и опосредованные интегрины (Lackmann and Boyd, 2008; Pasquale, 2008; Pitulescu and Adams, 2010).

После первоначального взаимодействия рецептор/лиганд интактные комплексы EphR/ Ephrin вместе с потенциально связанными цитоплазматическими белками и окружающей мембраной имплантируются в клетки. Этот механизм называется трансэндоцитозом.

Он обеспечивает механизм переключения между клеточным притягиванием-адгезией/отталкиванием и прекращением действия сигнальной активности рецепторов (Lisabeth et al., 2013).

Помимо трансэндоцитоза другой альтернативный сигнальный механизм представляет активация ферментов, которые инициируют протеолитическое расщепление (Atapattu et al., 2014). Среди таких ферментов расщепления дезинтегрин А и металлопротеазы (A disintegrin and metalloproteases – АДАМ), а также и матриксные металлопротеазы (MMP) (Atapattu et al., 2014).

Несколько EphR/ephrins обоих подклассов A и B могут взаимодействовать с ADAM, что приводит к их собственному расщеплению. Расщепление рецептора, связанного с лигандом, приводит к разрушению молекулярных связей между взаимодействующими клетками.

MMP расщепляют белки, расположенные либо на мембранах, либо во внеклеточном пространстве (Miller et al., 2008). Их основная функция – разрушить структурные компоненты эндотелиальных клеток для облегчения миграции клеток (Streuli, 1999), особенно во время ангиогенеза и воспалительных процессов (Kessenbrock et al., 2010; Palmisano and Itoh, 2010).

Недавно было показано, что ММР освобождают ephrinA1 и ephrinA2 от их GPI-части, что приводит к высвобождению функциональных растворимых мономеров, которые могут действовать на отдаленные Eph-рецепторы (Beauchamp and Debinski, 2012).

Вслед за исходной стадией пролиферации, опосредуемой ADAM или MMP, EphRs/ephrins могут быть дополнительно обработаны внутримембранными расщепляющими протеазами, такими как γ-секретаза (Bergmans and De Strooper, 2010) или нейропсин (Attwood et al., 2011; Morohashi and Tomita, 2013).

Эти взаимодействия генерируют цитоплазматические активные фрагменты (Litterst et al., 2007; Xu and Henkemeyer, 2009), которые могут, например, регулировать поведенческие реакции, такие как тревожность (Attwood et al., 2011).

Такие сигнальные механизмы системы Eph/ephrin могут играть роль в развитии патологии головного мозга, что создает возможность для выявления альтернативных целей для терапии.

Роль системы EphR/Ephrin в развитии и функционировании сосудистой сети и ГЭБ

Взаимодействие конкретных типов клеток в правильном развитии сосудистой системы и функционировании ГЭБ является важным процессом, который требует соответствующей координации во времени и пространстве. В этой координации определенную роль играет и система EphR / ephrin.

Во время ангиогенеза VEGF индуцирует экспрессию ephrinA1, которая активирует EphA2 на соседних ЭК, тем самым оказывая ангиогенные эффекты in vitro и in vivo (Cheng et al., 2002; Brantley-Sieders et al., 2004).

Астроциты высвобождают VEGF во время эмбрионального развития и, следовательно, могут способствовать раннему формированию плотных контактов.

При дальнейшей дифференциации ЭК и правильном формировании ГЭБ наблюдается ингибирование активности EphA2 в эндотелиальных клетках микрососудов человеческого мозга, что играет важную роль в дальнейшем усилении плотных контактов (Zhou et al., 2011;).

Таким образом, регулирование доз EphA2 может лежать в основе «переключения» между ранним/ангиогенным и поздним/барьергенным эффектами EphA2 для эндотелиоцитов.

Более того, предполагается, что взаимодействия между EphA2-экспрессирующими эндотелиальными клетками с экспрессирующими ephrinA1 периваскулярными астроцитами или перицитами также могут контролировать образование плотных контактов в физиологических условиях или их дисфункцию во время патогенных процессов (Lécuyer et al., 2016).

Следует учесть, что избыточная экспрессия некоторых взаимодействий EphR/ephrin может влиять на целостность ГЭБ, в конечном счете влияя на гомеостаз мозга. Астроциты экспрессируют несколько членов системы EphR / ephrin (Nestor et al., 2007), которые могут иметь значение в ходе ангиогенеза и/или барригенеза. Например, правильное взаимодействие между EphA4 / ephrinA5 на ЭК и отростках астроцитов, соответственно, необходимо для развития нормальной сосудистой системы в гиппокампе взрослых мышей (Hara et al., 2010).  Также показано, что сигналы EphA4 направляют рост новых мелких сосудов в ответ на глиально-зависимую стимуляцию (Goldshmit et al., 2006).

Что касается типов «В», ephrinB2 контролирует встраивание VEGF-рецептора (VEGFR) -2, что необходимо для активации этого рецептора и правильного развития эндотелиальных клеток во время ангиогенеза (Bochenek et al., 2010; Sawamiphak et al., 2010; Pitulescu и Adams, 2014).

В это же время взаимодействие EphB2/ephrinB2 необходимо для правильного формирования кровеносных сосудов (Foo et al., 2006). Для развития сердечно-сосудистой системы важными являются и EphB4/ephrinB2 обусловленные сигналы для правильного определения артериальной или венозной идентичности (Wang et al., 1998; Adams et al.

, 1999; Gerety et al., 1999; Gale et al., 2001; Augustin and Reiss, 2003).

Дисфункция ГЭБ и система Eph/Ephrin. Есть ли связь между нейрососудистой и нейропсихиатрической патологией?

Неплотность ГЭБ является отличительной чертой нейрососудистых патологий, сопутствующих нейровоспалительным процессам (Lee et al., 2009; Abbott and Friedman, 2012). Также были показаны признаки дисфункции ГЭБ при нейропсихиатрических расстройствах, которые сопровождались повышением уровней циркулирующих провоспалительных цитокинов и TNF (Miller et al., 2009; Janelidze et al.

, 2011; Liu et al., 2012; Salim et al., 2012; Najjar et al., 2013). Кроме того, доклинические и клинические исследования свидетельствуют о широком диапазоне нейрососудистых и нейропсихиатрических расстройств при которых выявляется нейровоспаление (Dantzer et al., 2008; Wood, 2014; Hodes et al.

, 2015; Patel and Frey, 2015; Seligman and Nemeroff, 2015, Miller and Raison, 2016, Barnes et al., 2017, Menard и др., 2017). Можно предположить, что общие нейробиологические субстраты могут лежать в основе подобных заболеваний.

Ввиду регуляторных функций системы EphR/ephrin во время формирования и созревания надлежащих свойств герметизации ГЭБ кажется очевидным, что эту систему можно считать центром нарушений головного мозга, связанных с дисфункцией ГЭБ.

Доклинические исследования показали, что представители системы EphR/ephrin группы «А» ( в особенности выделяется рецептор EphA2) опосредуют воспаление во время травмы, ишемии и других хронических воспалительных состояний у мышей с нейрососудистыми заболеваниями (Jellinghaus et al., 2013; Thundyil et al., 2013; Ende et al., 2014).

В частности, активация рецептора EphA2 происходит после черепно-мозговой травмы и способствует развитию воспаления путем повышения проницаемости ГЭБ (Thundyil et al., 2013). Интересно, что промотор ephrinA1, самый высокоактивный лиганд для EphA2, является мишенью провоспалительного маркера TNF (Ende et al., 2014).

Кроме того, в то время как TNF обладает ангиогенными свойствами во время раннего эмбриогенеза (Cheng and Chen, 2001; Munthe and Aasheim, 2002), он также вызывает гиперпроницаемость ГЭБ у взрослых посредством активации как EphA2, так и EphA4 в эндотелиальных клетках, что сопровождается развитием или обострением нейрососудистых расстройств (Jellinghaus et al., 2013; Thundyil et al.

, 2013; Ende et al., 2014). Таким образом, исследование сигнальных путей, обусловленных EphA2/ephrinA1, может выявить новые молекулярные триггеры патологии с воспалительными/нейрососудистыми/нейропсихиатрическими расстройствами, что может нам указать на альтернативные цели терапевтических вмешательств.

Также была показано, что связь ephrinA5, экспрессируемого на астроцитах, с ​​его соответствующим рецептором EphA4 на эндотелиоцитах, увеличивается в гиппокампе мышей с эпилепсией височной доли, свидетельствуя об увеличенном развитии мелких сосудов, что плохо влияет на гомеостаз головного мозга (Shu et al., 2016).

Интересно отметить, что селективная блокада взаимодействия EphA4/epHRin ведет к ослаблению проявления болезни, что еще больше подтверждает терапевтическую значимость избирательного воздействия на систему EphR/ephrin при нейрососудистых/нейропсихических расстройствах.

Рисунок 2. Клеточные и сигнальные компоненты ГЭБ в патологических условиях.

При патологии головного мозга чрезмерная активация астроцит- или перицит-зависимых эфринных сигналов может влиять на плотные контакты посредством повышения активности Eph-рецепторов с последующим повышением проницаемости ГЭБ для воспалительных факторов, циркулирующих в крови, таких как фактор некроза опухоли (TNF).

Доказано, что выраженное стрессовое воздействие коррелирует с нарушением функции ГЭБ и нарушением плотных контактов, что может вызвать более выраженные проявления неврологических и нейропсихиатрических расстройств. Однако конкретные молекулярные медиаторы таких эффектов еще не определены.

Что касается представителей группы «В», было высказано предположение, что связь между TNF и EphB2 имеет отношение к индуцированию воспалительных путей (Pozniak et al., 2014). Также было показано, что EphB2 регулирует когнитивные функции и устойчивость/уязвимость к стрессовым воздействиям (Yuferov et al., 2013; Zhang et al.

, 2016). Среди триггеров нейропсихиатрических расстройств стресс является одним из наиболее вредных (Charney and Manji, 2004). Показано, что всего лишь 2 дня стресса провоцируют морфологические изменения в эндотелиальных клетках, которые сопровождаются дисрегуляцией экспрессии клаудина-5 и окклюдина (рис. 2).

Эти изменения сопровождаются уменьшением экспрессии глиального фибриллярного кислого протеина, что указывает на дополнительное негативное воздействие на астроциты (Sántha et al., 2016).

Исследование прошлого года ясно продемонстрировало пагубные последствия стресса для проницаемости ГЭБ, которые выражались увеличением его проницаемости (Menard et al., 2017).

Доказательством того, что система EphR/ephrin может представлять собой важную терапевтическую мишень для лечения нейрососудистых и нейропсихиатрических расстройств, является контролируемая реактивация EphB4/ephrinB2 при сердечно-сосудистых расстройствах, при которой улучшаются механизмы восстановления ГЭБ (Ghori et al. , 2017).

Заключение

Несмотря на то, что в нескольких исследованиях доказано, что дисфункция ГЭБ наблюдается при широком спектре психопатологий, до сих пор неизвестно, является ли нарушение ГЭБ причиной или следствием заболевания.

Уже определено, что проницаемость ГЭБ увеличивается во время воспаления, что имеет положительную сторону, так как обеспечивает прохождение факторов роста или антител, которые препятствуют воспалительному процессу.

С другой стороны, улучшение герметичных свойств ГЭБ поможет в периоды стресса или гипоксии (Abbott et al., 2006).

Изучение влияния системы EphR/ephrin в отдельных компонентах ГЭБ при ангиогенезе и барьергенезе, а также их действие при физиологических и патологических процессах, может открыть новые пути для понимания нейробиологических основ неврологических заболеваний. Это может помочь выявить новые терапевтические цели для создания новых типов эффективных лекарств.
 

Источник. 

Другие статьи выпуска

β-амилоида в плазме, церебральная атрофия и риск деменции

Источник: https://www.pfizerprofi.ru/condition/nevrologiya/daydzhest-novostey-nevrologii/geb-i-sistema-ephrephrin-svyaz-mezhdu-neyrososudistymi-i-neyropsihiatricheskimi-rasstroystvami

Ингибирование передачи сигналов, опосредованных эфрином b3, способствует усилению реакции гибели клеток немелкоклеточного рака легкого после комбинированного лечения ионизирующим излучением и pkc 412 | гибель клеток и болезнь – Статьи – 2020

ЭФРИН (Ephrin): Относится к группе хемоцитокинов, опосредующих миграцию клеток или

  • Клеточная смерть
  • химиотерапия
  • Немелкоклеточный рак легкого
  • радиотерапия

Лучевая терапия часто используется для лечения немелкоклеточного рака легких (NSCLC).

Ранее мы показали, что комбинация ионизирующего излучения (ИК) и аналога ставроспорина PKC 412, но не Ro 31–8220, увеличивает гибель клеток в клетках NSCLC. Для идентификации генов, участвующих в усилении гибели клеток, было проведено профилирование общего гена в ответ на совместное введение (i) PKC 412 с IR или (ii) Ro 31–8220 с IR.

Эти комбинированные методы лечения вызывали повышенную регуляцию 140 и 179 генов и понижающую регуляцию 253 и 425 генов соответственно.

Определенные гены были отобраны и проверены с помощью количественной ПЦР в реальном времени, и из этих генов было предложено надежное подавление экспрессии Ephrin B3 в качестве возможного механизма гибели клеток при комбинированном лечении IR и PKC 412.

Действительно, подавление Ephrin B3 с использованием миРНК в клетках NSCLC приводила к значительному изменению их морфологии с удлиненным фенотипом, уменьшенной пролиферацией и повышенной передачей сигналов гибели клеток.

Более того, молчание Ephrin B3 в сочетании с IR вызывало снижение IR-опосредованного G 2 -арреса, вызывало клеточное старение, ингибировало фосфорилирование MAPK ERK и p38 и вызывало усиление экспрессии p27 kip1 . Наконец, глушение Ephrin B3 в комбинации с сенсибилизированными IR клетками U-1810 к индуцированному IR апоптозу. В заключение мы идентифицируем и описываем Ephrin B3 как предполагаемую сигнальную молекулу, участвующую в ответе клеток NSCLC на комбинированную обработку с PKC 412 и ионизирующим излучением.

У пациентов с немелкоклеточной карциномой легкого (НМРЛ) прогноз плохой, при 5-летней выживаемости около 10%. 1 Химиотерапия (КТ) и лучевая терапия (РТ) являются стандартными методами лечения неоперабельных случаев НМРЛ, но часто встречается высокая внутренняя резистентность, препятствующая хорошему клиническому лечению.

Механизмы, ответственные за внутреннюю и приобретенную устойчивость к RT, включают клеточные сигнальные изменения, например, повышенную репарацию ДНК и передачу сигналов фактора роста или нарушение активации клеточной гибели.

Таким образом, мы показали, что нарушение передачи сигналов апоптоза через членов семейства Bcl-2 Bak и Bax, нарушение функции митохондриального высвобождения цитохрома с и последующее влияние на активацию каспазы, все вносят вклад в выраженную резистентность к RT клеток NSCLC.

2, 3, 4 С целью поиска методов лечения, которые могли бы вызвать гибель клеток в клетках NSCLC, резистентных к ионизирующему излучению (IR), мы показали, что стауроспорин может обойти устойчивость и вызвать высвобождение цитохрома с и последующую активацию каспазы-3.

3 Далее мы исследовали, могут ли аналоги стауроспорина, PKC 412 и Ro 31–8220, повышать чувствительность клеток NSCLC к IR. 5, 6 Действительно, было показано, что PKC 412 сенсибилизирует RT и запускает митохондриально-опосредованный апоптотический ответ, хотя Ro 31–8220 этого не делает, а вместо этого увеличивает передачу сигналов выживания.

Было продемонстрировано, что усиление передачи сигналов рецептора фактора роста посредством EGFR влияет на реакцию NSCLC на IR (рассмотрено в 1 ). Лечение, при котором ингибиторы EGFR или моноклональные антитела, такие как цетуксимаб, используются в комбинации с CT и / или RT.

Эти методы лечения, к сожалению, только увеличили выживаемость в небольшой части когорты пациентов, то есть в тех, у которых опухоли имеют аберрантную сеть передачи сигналов EGFR.

Для подавляющего большинства пациентов с НМРЛ другие пути, вероятно, являются ведущими опухолями и должны быть терапевтически вмешаны либо отдельно, либо в сочетании с КТ / РТ.

В текущем исследовании мы применили глобальную и неконтролируемую стратегию для изучения потенциальных ключевых сигнальных событий, дающих ответную реакцию или устойчивость RT в клетках NSCLC.

Следовательно, полное профилирование гена клеточной линии NSCLC U-1810 проводилось только после ИК или ИК в комбинации с PKC 412 или Ro 31–8220 с использованием массива генов на основе Affymetrix. Данные генного массива вместе с проверкой на генный, белковый и функциональный уровни позволяют предположить, что Ephrin B3, лиганд Eph-рецепторов (EphR), является предполагаемым регулятором резистентности к RT клеток NSCLC.

Ранее мы показали, что комбинация IR и PKC 412 сенсибилизированных клеток NSCLC к индуцированной IR апоптотической гибели клеток 5, что было подтверждено здесь (Figure 1).

Таким образом, комбинация IR и PKC 412 запускает усиление апоптотической передачи сигналов, что проиллюстрировано расщеплением PARP в специфическом фрагменте расщепления 85 кДа (фиг.

1a), двукратным увеличением опосредованного каспазой расщепления цитокератина 18 7, 8 (Figure 1b) и повышенная активация каспазы-3 и апоптотическая ядерная морфология (данные не представлены). Более того, комбинированное лечение IR и PKC 412 явно вызывало более выраженное ингибирование пролиферации, чем любое лечение отдельно (Figure 1c).

Комбинированное лечение IR и PKC 412 вызывает гибель клеток NSCLC U-1810.

Клетки U-1810 подвергали воздействию ИК (8 Гр) и через 24 ч после инкубации обрабатывали РКС 412 (1 мкМ) в течение еще 24 ч до вестерн-блот-анализа расщепления PARP ( а ) или проточного цитометрического анализа расщепления цитокератином 18 ( б ) был осмотрен. Представленные данные являются средством трех независимых экспериментов. Т- тест использовали для статистического анализа (* = Р 0, 05.

Анализ экспрессии генов Affymetrix

РНК выделяли из 10 миллионов клеток U-1810, которые не были обработаны или обработаны PKC-412, Ro 31–8220, облучением или комбинацией IR и PKC 412 или Ro 31–8220 в указанные моменты времени после обработки.

РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Mini в соответствии с инструкциями производителя (RNeasy Midi Handbook; Qiagen, Germantown, MD, USA).

Чистоту и концентрацию РНК оценивали с использованием УФ-видимого спектрофотометра NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies Wilmington, DE, USA).

Gene expression analyses were performed using the Affymetrix platform (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA). The synthesis of cRNA, labeling and hybridization were performed according to the protocols provided by the manufacturer. The data were analyzed by the GeneSpring GX software (Agilent Technologies).

Normalization of gene expression data was accomplished in two ways: per chip normalization and per gene normalization. For per chip normalization, all expression data on a chip were normalized to the 50th percentile of all values on that chip.

For per gene normalization, the data for a given gene was normalized to the median expression level of that gene across all samples. The data sets were then assigned to three groups for the experiments (control, PKC 412, and Ro 31–8220 either alone or in combination with IR).

The expression profiles from the three independent experiments were compared using ANOVA (parametric test, variances assumed equal) to identify genes that were differentially expressed between the different treatments. All further analyses were carried out on the remaining 863 probe sets.

Cytokeratin 18 cleavage

Caspase-mediated cytokeratin 18 cleavage is accompanied by the appearance of a specific neo-epitope in the cytokeratin 18 molecule. 7, 8, 31 An antibody that recognizes this epitope, M30 CytoDEATH-FITC antibody (Roche Diagnostics Scandinavia AB, Stockholm, Sweden), was used.

Ice-cold-methanol-fixed cells (−20 °C, 30 min) were stained with the M30 CytoDEATH-FITC antibody and the percentage of cells showing positive staining was analyzed with flow cytometry by measuring the FITC fluorescence in the FL1 of fluorescence-associated cell sorting calibur (BD Biosciences, Stockholm, Sweden).

Results presented are the means±SEM of the three independent experiments, P >0.05.

Количественная валидация ПЦР в реальном времени

Reverse-transcribed cDNAs from the indicated samples were used as templates. The housekeeping gene glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH ) was applied as a positive control and also used for normalization of the different template values.

To amplify the cDNA, 100 ng of the reverse-transcribed cDNA from each sample was subjected to 40 cycles of real-time quantitative PCR in a 20- μ l total reaction volume.

The Ephrin B3, protein phosphatase 2 gamma isoform, estrogen receptor 1, Rab33A and GAPDH primers and probes were purchased from Applied Biosystems (Applied Biosystems, Stockholm, Sweden) and were designed to flank the target DNA sequence.

The mRNA gene expressions of each gene in the treated U-1810 cells were given as fold increase or reduction compared with untreated U-1810 cells after normalization against GAPDH.

Вестерн-блот анализ

The total protein content was extracted using a lysis buffer (6 M urea and 2% SDS in 200 m M ammonium bicarbonate and protease inhibitor cocktail (Roche, Mannheim, Germany)).

The lysates were sonicated, cleared from the insoluble cell membranes and debris by centrifugation (10 000 g/10 min), and the protein content was measured using the bicinchoninic acid (BCA) assay (Interchim, Montiuçon Cedex, France).

Western blot analyses were carried out as previously described 4 and the following primary antibodies were used: Ephrin B3, Ku80 (Abcam, Cambridge, UK), Akt (phospho ser473- and total), Cyclin B1, ERK, p38 (phospho- and total), phospho-cdc2 (Tyr15) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), PARP, p21 WAF1/Cip1, and p27 Kip1 (BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA), EphA4 (S-20) and p16 INK4A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) and GAPDH (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA).

Silencing of Ephrin B3 expression with siRNA

Ephrin B3 siRNA was purchased from Qiagen. The 5′-CCAGGAGTATAGCCCTAAT-3′ target sequence (sequence 1) corresponding to 748–766 bp, which is described as unique relative to other Ephrin members 32 and Dharmafect (Dharmacon, Lafayette, CO, USA) were used according to the manufacturers' instructions.

To rule out the off-target effect of the Ephrin B3 siRNA, another sequence 5′-GCTCGCACCACGATTACTA-3′ corresponding to 786–804 bp (sequence 2), also previously noted as specific for Ephrin B3 ligand, 32 was applied in corresponding experiments (see Supplementary Figure S2). For each experiment 500 000 cells were seeded onto 10-cm dishes and transfected after 6 h using 100 n M siRNA.

Non-target siRNA (Dharmacon) was used as control. In all these experiments, cells were not confluent even at late time points as they started to be arrested in G1 and grow very slowly shortly after transfection. Hence, a risk that other Ephrins may signal onto Ephs as a consequence of confluency could be considered small.

Irradiation was performed 48 h after transfection when silencing of Ephrin B3 expression was achieved and the cells were then harvested at indicated time points post IR.

Cell division analysis using carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester (CFSE)

The CFSE is a cell-permeable dye, that is, non-fluorescent until it is cleaved by intracellular esterases to yield a fluorescent carboxyfluorescein succinimidyl ester, that is, retained within the cells.

During each cell division, the fluorescent label will be progressively diluted, allowing cell proliferation to be monitored by fluorescence-associated cell sorting. 15 Briefly, the same volume of U-1810 cells from the same stock suspension was seeded onto each plate.

The cells were incubated at room temperature for 5 min in complete medium containing 2.5 μ mol/l CFSE. Thereafter, the cells were washed and incubated in fresh medium followed by siRNA transfection.

At 48 h post-transfection (=0 h) or at 48 h post IR (=48 h), the cells were collected for fluorescence-associated cell sorting analysis without prior fixation. CFSE fluorescence was detected in the FL1 channel and the data is given as CFSE-associated IFL signal.

Cell cycle distribution

Three million cells were pelleted at 500 × g and resuspended in 100 μ l of ice-cold PBS. Next, the cells were fixed by a drop-wise addition of 1 ml of ice-cold 70% ethanol while vortexing.

Upon analysis, the cells were centrifuged at 200 × g , washed in PBS and resuspended in 1 ml of propidium iodide staining solution (40 μ g/ml propidium iodide and 10 μ g/ml RNase-A in PBS).

Analysis of the cell cycle distribution was carried out on a FACScan Instrument (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) in the FL2 channel and analyzed using ModFit LT Verity Software (Topsham, ME, USA). In these experimental settings, cell debris, as well as the subG1 population, was excluded from the analysis by gating of the cells.

Analysis of nuclear morphology

Nuclear morphology was evaluated as the number of cells with abnormal nuclei as defined in Figure 4b (right). The cells were harvested after the indicated treatments using cell dissociation solution (CDS, Sigma Aldrich). After washing in PBS, the cells were fixed for 10 min in 4% PFA solution.

The nuclei of fixed cells were stained with mounting media containing Hoechst 33342 (Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA). The number of cells with nuclear morphology indicative of an apoptotic or mitotic catastrophe phenotype was quantified using a fluorescent microscope (ZEISS Axioplan 2 imaging microscope, ZEISS, Thornwood, NY, USA).

At least 100 cells were assessed in each sample and apoptosis is presented as the percentage of cells with fragmented nuclei.

Analysis of senescent cells

To reveal a senescent phenotype of the cells, the Senescence Cells Histochemical Staining Kit (Sigma Aldrich) was applied according to the manufacturer's instructions. Briefly, cells were seeded onto 60-mm plates and fixed for 7 min at room temperature.

The cells were then washed with PBS and stained with X-gal-based staining mixture overnight at 37 °C without CO 2 .

Triplicates samples were analyzed in which the percentage of blue-stained cells expressing β -galactosidase 100 total cells examined in three representative fields was evaluated.

глоссарий

CK18

cytokeratin 18

CFSE

carboxyfluorescein diacetate N -succinimidyl ester

Коннектикут

chemotherapy

инфракрасный

ионизирующее излучение

НМРЛ

non-small cell lung carcinoma

RT

radiotherapy

RT qPCR

real-time quantitative PCR

STS

staurosporine

Дополнительная информация прилагается к статье о веб-сайте, посвященном смерти и болезням клеток (//www.nature.com/cddis)

Источник: https://ru.ovalengineering.com/inhibition-ephrin-b3-mediated-survival-signaling-contributes-increased-cell-death-response-non-small-141657

Medic-studio
Добавить комментарий