Глава 22. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний

Методы иммунологической диагностики инфекционных заболеваний

Глава 22. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний

Иммунологическая диагностика инфекционных заболеваний основана на выявлении антител в организме пациента к возбудителю инфекции методами серологических исследований. В их основе – взаимодействие антигена и антитела с образованием иммунных комплексов. Серологические реакции применяются в двух направлениях:

1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого.

2. Установление родовой, видовой и типовой принадлежности микроба или вируса.

Реакция агглютинации (РА). Принимают участие антигены в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и др. корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок. Различают реакцию микробной агглютинации, гемагглютинации, латексагглютинации, коаглютинации и т.д. (от вида иммунодиагностикума). Различают прямую и непрямую реакции агглютинации.

Реакция прямой агглютинации. В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены). Обычно используется взвесь инактивированных микроорганизмов.

Для определения вида микроорганизмов используют специальные диагностические агглютинирующие сыворотки, полученные путем гипериммунизации лаб. животных взвесью бактерий.

Титром такой сыворотки является ее наибольшее разведение, при котором наблюдается отчетливая агглютинация соответствующего антигена.

Развернутую РА проводят в пробирках или лунках пластин. Диагностическую сыворотку разводят до титра и вносят одинаковые количества антигена. При положительной реакции на дне пробирки (лунки) образуется рыхлый осадок в виде «зонтика», при отрицательном – осадок в виде «пуговицы». Реакция непрямой (пассивной) агглютинации.

Для получения феномена агглютинации антиген предварительно адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, целлюлоза, полистирол и др.) или клетки (эритроциты барана, 1(0)-группы крови человека). В качестве носителя используют эритроциты.

Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Если нагрузить эритроциты антителами, то их можно применять для выявления антигенов.

Используется для определения в сыворотке больного антител к сальмонеллам, шигеллам,Yersinia pseudotuberculosis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans. РНГА применяется для выявления антител к Tr. pallidum при лабораторной диагностике сифилиса.

Реакция связывания комплемента (РСК). Помимо антигена и антител принимает участие третий компонент – комплемент, который способен связываться с комплексом антиген-антитело.

Образование комплексов антиген-антитело и фиксация комплемента не сопровождаются видимыми изменениями. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную индикаторную гемолитичесчкую систему (эритроциты барана, обработанные гемолитической антисывороткой).

В присутствии комплемента (сыворотки морской свинки) происходит лизис эритроцитов. Если в опытной системе образовались комплексы антиген-антитело, которые связывают комплемент, то лизис эритроцитов в индикаторной системе не произойдет (реакция положительная).

Используется при определении антител к вирусу Коксаки, при лабораторной диагностике сифилиса – реакция Вассермана.

Реакция лизиса.

Сущность реакции состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий), на их поверхности образуется комплекс, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие этого происходит лизис этих клеток.

Эта реакция используется при типировании антигенов системы HLA на лимфоцитах. К типируемым лимфоцитам добавляют антисыворотки против различных HLA-антигенов, затем их отмывают и добавляют комплемент. Присутствие соответствующего антигена приводит к лизису лимфоцитов.

Реакция иммунофлюоресценции. Прямой метод иммунофлуоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченных флуорохромом с антигеном, который находится на клетке, в клетке или тканях. В качестве флуорохрома часто используют флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ).

Этот краситель дает зеленое свечение в ультрафеолетовых лучах, а тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) – оранжево-красное свечение. Прямой метод одноэтапный: на фиксированный мазок клеток с антигеном наносят диагностическую сыворотку с мечеными антителами, инкубируют, отмывают и учитывают свечение в люминесцентном микроскопе.

Непрямой метод иммунофлуоресценции заключается в том, что антиген обрабатывают обычной диагностической сывороткой, а для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют антисыворотку, меченную флуорохромом. Непрямой метод позволяет обнаруживать различные комплексы антиген-антитело с помощью одной меченной антиглобулиновой сыворотки.

Метод иммунной флуоресценции применяют для идентификации бактерий, вирусов, клеточных рецепторов и антигенов.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В методах иммуноферментного анализа используют иммунореагенты, меченные ферментами. Наиболее широко используется твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы используют полистироловые или поливиниловые планшеты или шарики, на которых адсорбированы антигены или антитела.

Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках полистироловой пластины. Затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченые ферментом.

После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат и хромоген для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. О наличии и количестве антител судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора.

Методы ИФА обладают высокой чувствительностью и специфичностью и получили наиболее широкое распространение среди иммунологических методов клинико-лабораторной диагностики.

Радиоиммунологический анализ. Принцип радиоиммунологического анализа (РИА) основан на выявлении комплекса антиген-антитело, в котором один из иммунореагентов был мечен радиоактивным изотопом.

Обычно используют изотопы йода (I-125 и I-131). Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков ионизирующего излучения.

Иммуноблотинг. Вариант ИФА, повышающий чувствительность метода при изучении гетерогенной смеси антигенов. Смесь антигенов подвергают дискэлектрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Полученные таким образом индивидуальные полосы антигенов переносят на нитроцеллюлозные полоски с помощью специального аппарата для переноса. В дальнейшем ход реакции сводится к гетерогенному не конкретному ИФА. Нитроцеллюлозные полоски с перенесенными на них антигенами обрабатывают испытуемой сывороткой.

Имеющиеся в ней антитела связываются с индивидуальными антигенами, представленными в виде отдельных полос. Связавшиеся антитела проявляют при обработке конъюгатом фермента с антителами к иммуноглобулинам человека. На последнем этапе определяют активность фермента.

Таким образом, можно определить против каких антигенов смеси направлены антитела сыворотки больного. На основе реакции иммуноблотинга созданы диагностические наборы для определения в сыворотке больного антител к вирусу гепатита С и ВИЧ-1-2.

Гибридизационный анализ (ГА). Проводится определение нуклеиновых кислот по связыванию с ДНК- и РНК- зондами. Метод ГА основан на отжиге одноцепочечного фрагмента нуклеиновой кислоты на комплиментарный ему участок другой молекулы анализируемой нуклеиновой кислоты с образованием двух цепочечной гибридной молекулы.

Зонд может быть получен либо химическим синтезом олигонуклеотидов. Либо с помощью синтеза ДНК на одной из нитей детектируемой ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы (для РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы). Полученная копия может быть встроена в плазмиду и затем размножена в составе каких-либо бактерий.

Зонд должен иметь репортерную группу, выявляемую ферментативно или физическим методом. В настоящее время в медицинской практике успешно применяются ДНК-зонды, в которых в качестве репортерных групп используют биотин, дегоксигенин, комплексы платины и др.

Введение меток может производиться с помощью химических, физических, фотохимических и ферментативных реакций. В частности при амплификации.

Также разнообразны методы детекции образовавшегося гибрида нуклеиновых кислот: с помощью хромогенных и хемилюминесцентных субстратов высокоактивных ферментов (пероксидаза, щелочная фосфатаза), люминесценции и др. На основе нерадиоизотопного ГА созданы диагностикумы для выделения вируса папилломы, герпеса, хламидий и уреаплазмы.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).ПЦР – это метод умножения числа копий нуклеиновых кислот (амплификация) in vitro. Перед проведением реакции из биологического материала выделяют ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания или ДНК генома клеток человека.

Полимеразная цепная реакция проводится с использованием двух или более олигонуклеотидных праймеров («затравки»), фланкирующих участок ДНК (РНК), специфический для определяемого участка генома.

Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК-полимеразой.

Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекает только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК в каждом последующем цикле. Как правило, проводится не менее 30 последовательных циклов реакции. Амплифицированный учасок именуют «ампликоном».

В результате реакции происходит экспоненциальное увеличение количества копий специфического фрагмента. При амплификации используется термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из бактерий Thermus aquaticus (Taq), живущих в горячих источниках.

Билет № 14

Источник: https://cyberpedia.su/4x99ca.html

Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний

Глава 22. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний

I. Иммунный ответ при инфекционных заболеваниях. Иммунный ответ — это реакция на чужеродный антиген, которая приводит к накоплению и активации клеток, участвующих в его удалении. Течение и исход любой инфекции зависят от силы иммунного ответа на антигены возбудителя.

А. Механические барьеры — кожа, слизистые, мерцательный эпителий дыхательных путей и ЖКТ — препятствуют попаданию микробов в кровь.

Б. Макрофаги препятствуют диссеминации инфекции. В защите от инфекции участвуют как макрофаги, например купферовские клетки, альвеолярные и перитонеальные макрофаги, так и циркулирующие моноциты. Макрофаги захватывают и уничтожают микробы, расщепляют антигены и представляют его T-хелперам.

В. Антитела, как и макрофаги, предотвращают диссеминацию инфекции.

1. IgM составляют основную часть антител, вырабатываемых при первичном иммунном ответе. IgM обладают высокой способностью к связыванию и активации комплемента, агглютинации и опсонизации микробов.

2. IgA присутствуют в сыворотке, лимфе, слезе, грудном молоке, на слизистых и в их секретах, например в слюне. Эти антитела участвуют в защите от микробов, попадающих на слизистые.

3. IgG составляют около 80% иммуноглобулинов сыворотки и являются основными антителами, которые обеспечивают защиту от бактерий, грибов и вирусов.

Г. Лимфоциты. Существуют три популяции лимфоцитов: B-, T – и NK-лимфоциты. B-лимфоциты попадают в кровь и периферические органы иммунной системы из костного мозга и дифференцируются в плазматические клетки, продуцирующие антитела. T-лимфоциты также происходят из костного мозга, но созревают в тимусе.

T-лимфоциты делятся на несколько субпопуляций, которые различаются по функциям и поверхностным антигенам (см. гл. 1, п. II.А). В разрушении зараженных клеток участвуют по крайней мере 2 типа лимфоцитов.

Это цитотоксические T-лимфоциты — лимфоциты CD8, функция которых ограничена HLA, и NK-лимфоциты, функция которых не ограничена HLA и которые способны разрушать инфицированные клетки на ранних стадиях инфекционного процесса, до появления цитотоксических T-лимфоцитов.

Существуют 2 механизма, с помощью которых лимфоциты уничтожают микроорганизмы: разрушение инфицированных клеток при непосредственном контакте и выработка цитокинов, активирующих макрофаги. Больные с недостаточностью клеточного иммунитета подвержены таким заболеваниям, как туберкулез, корь, диссеминированный кандидоз, инфекция, вызванная вирусом varicella-zoster, даже при нормальном гуморальном иммунитете.

Д. Комплемент — это система сывороточных белков, которые разрушают клетки и участвуют в воспалении и регуляции иммунного ответа. Благодаря способности опсонизировать микроорганизмы, связываясь с их поверхностью непосредственно или через антитела, комплемент усиливает фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов.

Е. Интерфероны — группа цитокинов, которые играют важную роль в иммунитете, в том числе противовирусном. Известны 3 типа интерферонов: интерферон альфа (вырабатывается лейкоцитами), интерферон бета (вырабатывается фибробластами) и интерферон гамма (вырабатывается активированными T-лимфоцитами).

Общие принципы иммунодиагностики инфекционных заболеваний

А. Анамнез. При оценке результатов серологических исследований учитывают следующие данные.

1. Анамнез заболевания.

2. Сведения о перенесенных заболеваниях.

3. Сведения о вакцинации (сроки проведения и виды вакцин).

4. Сведения о поездках.

5. Место жительства и контакт с неблагоприятными факторами окружающей среды.

6. Сведения о контактах с источниками инфекции.

7. Сведения о контактах с животными.

8. Время года.

Б. Пробы для исследования. Для посева и определения антигенов возбудителя можно использовать разные ткани и биологические жидкости.

Для определения антител к возбудителю обычно используют сыворотку, СМЖ и синовиальную жидкость.

Чтобы выявить нарастание титра антител к какому-либо возбудителю, пробы сыворотки забирают в период разгара и в период выздоровления. При обнаружении антител в СМЖ исключают поражение ЦНС.

III. Иммунологические методы, применяемые для диагностики инфекционных заболеваний.

А. РИА — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело, один из компонентов которой несет радиоактивную метку. Метод позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела и определять их концентрацию в исследуемой пробе.

Б. Иммунофлюоресцентный анализ также применяют для выявления как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцентным красителем. Антитела чаще всего метят флюоресцеинаизотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии.

Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа:

1. Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа.

2. Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить антитела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывается с немечеными антителами. Комплексы антиген—антитело выявляются с помощью меченых антител к иммуноглобулинам.

3. Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.

В. Методы, основанные на реакции преципитации. При взаимодействии растворимых антигенов с антителами образуются высокомолекулярные комплексы антиген—антитело, которые выпадают в виде осадка в растворе или откладываются в виде полос преципитации в геле. Использование очищенных антигенов позволяет определить концентрацию антител в исследуемой пробе.

1. Преципитация в растворе. При добавлении антигена в возрастающей концентрации к одному и тому же количеству антител выпадает разное количество преципитата.

Можно построить график — кривую преципитации, — который отражает зависимость между концентрацией антигена и количеством преципитата: при избытке антител количество преципитата возрастает с увеличением концентрации антигена, в зоне эквивалентности (количество антигена примерно равно количеству мест связывания на антителах) образуется максимальное количество преципитата, при избытке антигена количество преципитата уменьшается с увеличением концентрации антигена.

2. Иммунодиффузия — наиболее распространенный из всех методов, основанных на реакции преципитации.

а. Простая радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля, содержащего антитела в известной концентрации, вырезают лунки; 2) антиген, помещенный в эти лунки, диффундирует в гель; 3) вокруг лунок образуются кольца преципитации, диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод обычно применяется для определения концентрации иммуноглобулинов.

б. Двойная радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля вырезают лунки для антигена и антител; 2) антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации на некотором расстоянии от лунок. По расстоянию от лунки с антигеном до линии преципитации можно определить концентрацию антигена.

3. Электрофорез

а. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание двух методов — иммунодиффузии и зонального электрофореза. Иммуноэлектрофорез применяется в основном для исследования сывороточных белков.

Суть метода заключается в следующем: 1) в лунку, вырезанную в тонком слое геля, помещают исследуемую сыворотку; 2) проводят электрофоретическое разделение белков сыворотки; 3) в геле вырезают бороздку, параллельную направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняют ее смесью антител к сывороточным белкам; 4) разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации (см. гл. 20, п. I.А).

б. Встречный электрофорез.

Суть метода заключается в следующем: 1) исследуемые антигены и смесь антител помещают в лунки, расположенные на противоположных концах пластины с гелем; 2) вдоль линии, соединяющей лунки, пропускают постоянный электрический ток; 3) в электрическом поле антитела и антигены быстро перемещаются по направлению друг к другу; 4) в месте связывания антигенов с антителами образуются линии преципитации. Встречный электрофорез применяют в тех случаях, когда антигены и антитела обладают разной электрофоретической подвижностью. Этот метод позволяет быстро определить антигены или антитела в исследуемой пробе и применяется в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний.

Г. Методы, основанные на реакции агглютинации, довольно чувствительны и применяются для выявления антигенов на поверхности клеток или частиц и полуколичественного определения антител к этим антигенам.

Суть методов заключается в следующем: при связывании клеток или частиц, покрытых антигеном, с антителами образуются крупные агрегаты.

Для определения титра антител к поверхностным антигенам клеток или к антигенам, сорбированным на поверхности частиц, смешивают известное количество клеток или частиц, покрытых антигеном, с разными разведениями исследуемой пробы, например сыворотки.

1. Реакция прямой агглютинации применяется для выявления поверхностных антигенов микробов или клеток крови и антител к этим антигенам.

Суть метода заключается в следующем: серийные разведения исследуемой пробы (например, сыворотки) смешивают с клетками, за титр антител принимают величину, обратную максимальному разведению сыворотки, которое вызывает агглютинацию.

Этот метод более чувствителен, чем методы, основанные на преципитации, поскольку при равной концентрации антигена объем агглютината больше объема преципитата. Реакция агглютинации не зависит от температуры, если только не обусловлена холодовыми агглютининами, которые более эффективны при температуре ниже 37°C.

2. Реакция непрямой агглютинации основана на агглютинации эритроцитов, других клеток или частиц (например, латекса или бентонита), покрытых антигеном.

Для определения титра антител серийные разведения сыворотки в физиологическом растворе смешивают с известным количеством покрытых антигеном клеток или частиц.

Реакция непрямой агглютинации — чувствительный метод, позволяющий определять растворимые антигены в низких концентрациях.

Д. Реакция связывания комплемента. Суть метода заключается в следующем: 1) антиген смешивают с антителами; 2) к образовавшимся комплексам антиген—антитело добавляют известное количество комплемента, который связывается с этими комплексами; 3) количество несвязанного комплемента оценивают в реакции гемолиза с эритроцитами барана.

Е. Твердофазный ИФА — надежный, экономичный и высокочувствительный метод. Он основан на использовании стандартных препаратов очищенных антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментом. Эти препараты сохраняют и иммунологические свойства, и ферментативную активность, которую можно измерить при добавлении субстрата данного фермента (см. гл. 20, п. I.Е).

Ж. Другие методы

1. Определение уровня C-реактивного белка. C-реактивный белок — белок острой фазы воспаления, относящийся к бета-глобулинам.

C-реактивный белок, как и другие белки острой фазы воспаления, появляется в сыворотке вскоре после повреждения тканей и начала воспаления.

Повышение уровня C-реактивного белка наблюдается при острых бактериальных и вирусных инфекциях, инфаркте миокарда, злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях (см. гл. 15, п. II.Б).

2. Определение титра холодовых агглютининов.Холодовые агглютинины — это IgM, которые вызывают максимальную агглютинацию эритроцитов при 4°C.

Холодовые агглютинины появляются при некоторых заболеваниях, например при микоплазменной пневмонии, реже при гриппе, аденовирусной инфекции и других острых респираторных заболеваниях, а также при сонной болезни.

Диагностически значимым считается выявление холодовых агглютининов в титре 1:32 или четырехкратное повышение их титра в течение 7—14 сут.

3. Определение титра агглютинирующих антител. Агглютинирующие антитела к возбудителю появляются в сыворотке при многих инфекционных заболеваниях: сальмонеллезе, паратифе, бруцеллезе, туляремии, риккетсиозе и других.

Титр этих антител можно определить в реакции агглютинации инактивированных бактерий при добавлении разных разведений сыворотки. Сыворотку для исследования обычно собирают дважды: в период разгара и в период выздоровления (через 10—21 сут).

Диагностически значимым считают четырехкратное повышение титра антител.

4. Реакция Нейфельда — набухание клеточной стенки бактерий под действием антител к типоспецифическим капсульным полисахаридам, видимое при световой микроскопии.

Эту реакцию можно наблюдать при добавлении антител, направленных против полисахаридов клеточной стенки Haemophilusinfluenzae, Streptococcuspneumoniae и Neisseriameningitidis (серотипов A и C), к этим бактериям.

Реакция Нейфельда применяется для исследования сыворотки и СМЖ.

5. Реакция с лизатом амебоцитов мечехвоста (Limuluspolyphemus) применяется для диагностики инфекций, прежде всего сепсиса и менингита, вызванных грамотрицательными бактериями. Метод основан на том, что при добавлении бактериальных эндотоксинов жидкий лизат амебоцитов меченосца превращается в гель.

IV. Кожные пробы, основанные на аллергических реакциях замедленного типа, — наиболее простой и доступный способ оценки клеточного иммунитета.

А. Антигены для проведения кожных проб. Кожные пробы обычно проводят с очищенным туберкулином, трихофитоном, дерматофитином 0, столбнячным анатоксином, антигенами вируса эпидемического паротита и Coccidioidesimmitis (см. гл. 18, п. III.Ж и табл. 22.2).

Б. Заболевания и состояния, которые сопровождаются угнетением клеточного иммунитета и, следовательно, аллергических реакций замедленного типа, перечислены ниже.

1. Первичные и вторичные иммунодефициты.

2. Острые вирусные инфекции, в том числе эпидемический паротит, краснуха, корь, инфекция, вызванная вирусом varicella-zoster, грипп, инфекционный мононуклеоз.

3. Грибковые инфекции, например кокцидиоидоз, криптококкоз, аспергиллез.

4. Бактериальные инфекции, в том числе туберкулез, бактериальные менингит и пневмония.

5. Злокачественные новообразования.

6. Иммунизация живыми вирусными вакцинами.

7. Лечение кортикостероидами и иммунодепрессантами.

8. Аутоиммунные заболевания.

9. Большие операции.

10. Истощение.

В. Техника проведения кожных проб

1. Участок кожи для инъекции обрабатывают антисептиком.

2. Внутрикожно вводят 0,1 мл раствора антигена. Для этого используют туберкулиновый шприц объемом 1 мл и иглу 27 G длиной 12 мм.

3. Место инъекции обводят несмываемым карандашом.

4. Через 24—72 ч (в зависимости от используемого антигена) измеряют два размера эритемы и папулы, рассчитывают средний и записывают результат кожной пробы в миллиметрах.

Г. Реакция на внутрикожное введение антигена и сроки ее развития зависят от вида антигена.

Источник: http://rosoblses.ru/infektscionnye-zabolevaniya/diagnostika-infektscionnyh-zabolevanii/immunologicheskie-metody-diagnostiki-infektscionnyh-zabolevanii.html

Глава 22. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний

Глава 22. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний

Адельман Д., под ред. – Иммунология

41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57

58

59 60 61

>

Б. Инактивированные вирусные вакцины, например антирабическая и противогриппозная, применяют по строгим показаниям: укус животного, больного бешенством, высокий риск заражения гриппом у беременной с сердечно-сосудистыми заболеваниями или заболеваниями легких. Столбнячный и дифтерийный анатоксины при беременности не противопоказаны и даже рекомендуются, если ранее не применялись.

В. Беременность матери не служит противопоказанием к вакцинации ребенка, в том числе живыми вирусными вакцинами.

IX. В табл.21.1 приведена схема вакцинации грудных детей, а в табл.21.2— детей младшего и старшего возраста, не вакцинированных ранее. У недоношенных детей и детей с низким весом при рождении применяются эти же схемы вакцинации.

X. Вакцинация взрослых. После полного курса вакцинации в детском возрасте каждые 10лет проводят ревакцинацию против столбняка и дифтерии. Лицам старше 65лет ежегодно вводят противогриппозную и пневмококковую вакцины. Схема, приведенная в табл.21.2, может использоваться для вакцинации взрослых, ранее не вакцинированных и не переболевших данным заболеванием.

XI. Новые рекомендации

А. В 1989г. в США была отмечена вспышка кори, в связи с чем было рекомендовано провести ревакцинацию всего населения. Ревакцинацию против кори можно проводить в 5—6лет (по рекомендациям Центра по контролю заболеваемости) или в 11—12лет (по рекомендации Комитета по инфекционным заболеваниям при Американской академии педиатрии).

Б. В связи с тем что ранее выпускавшаяся вакцина против Haemophilus influenzae типаB эффективна только у детей старше 2лет, была предложена новая вакцина, состоящая из полисахарида Haemophilus influenzae типаB, конъюгированного с белком-носителем. Эта вакцина эффективна у грудных детей. В табл.21.3 приведена характеристика выпускаемых в США вакцин против Haemophilus influenzae типаB.

В. В связи с недостаточной эффективностью выборочной вакцинации против гепатитаB было рекомендовано проводить вакцинацию всего населения. Рекомбинантную вакцину против гепатитаB вводят трижды в грудном возрасте (см. табл.21.4).

Г. Поскольку применение инактивированной брюшнотифозной вакцины нередко сопровождается местными реакциями и лихорадкой, была разработана живая брюшнотифозная вакцина. Ее назначают перед поездкой в районы с широким распространением заболевания.

Д. В настоящее время на стадии разработки находятся инактивированная вакцина против гепатитаA и живая вакцина против вируса varicella-zoster. Кроме того, исследуются новые комбинированные вакцины, использование которых позволит сократить количество инъекций у грудных детей.

XII. Иммунопрофилактика перед зарубежными поездками

Большинство лиц, вакцинированных в соответствии с современными требованиями системы здравоохранения США, не нуждаются в дополнительной вакцинации перед зарубежными поездками. Перед поездкой в Европу, Канаду, Мексику, Австралию, Новую Зеландию, на Карибские острова и после поездки в эти страны дополнительной вакцинации не требуется.

При поездке в другие страны может потребоваться вакцинация против холеры, брюшного тифа, бешенства, менингококковой инфекции, японского энцефалита и желтой лихорадки.

Поскольку санитарно-гигиеническая обстановка в странах Африки, Азии, Южной и Центральной Америки, южной части Тихого океана, Среднего и Дальнего Востока значительно различается, перед поездкой разрабатывают индивидуальный план вакцинации, исходя из следующих рекомендаций.

А. Необходимо знать требования к вакцинации, предъявляемые в данной стране. Эти сведения постоянно публикуются (Health Information for International Travel) и ежегодно пересматриваются Центром по контролю заболеваемости. В нем, а также в консульстве страны, в которую планируется поездка, можно получить консультацию по всем вопросам, связанным с вакцинацией.

Б. Иммуноглобулин против гепатитаA рекомендуется всем выезжающим в развивающиеся страны и районы распространения возбудителя. При длительных поездках введение препарата повторяют каждые 6мес. Если пребывание в районах распространения возбудителя длится более года, обычно возникает носительство. Оно приводит к развитию иммунитета, при котором дальнейшее введение иммуноглобулина не требуется.

В. Следует учитывать последовательность посещения разных стран и их районов (сельских и городских).

Г. Поездку следует планировать заранее, чтобы иметь достаточно времени для полного курса вакцинации и получения международного свидетельства.

XIII. Временное прерывание курса вакцинации

Временное прерывание курса вакцинации не приводит к снижению иммунитета, приобретенного после завершения этого курса. После прерывания курса вакцинации количество ревакцинаций не меняется и не зависит от длительности перерыва.

XIV. Средства для активной иммунизации

Выпускаемые в настоящее время вакцины представлены в табл.21.5. В ней указаны дозы, путь введения, эффективность и побочные эффекты каждой вакцины. В Центре по контролю заболеваемости можно приобрести вакцины, находящиеся на стадии разработки. Их применяют только по специальным показаниям.

XV. Средства для пассивной иммунизации

А. Нормальные иммуноглобулины 1. Нормальный иммуноглобулин получают из обогащенной иммуноглобулинами плазмы здоровых доноров. В препарате содержатся IgG и следовые количества IgM, IgA и других белков плазмы. Концентрация IgG в препарате (16,5% раствор) составляет 165мг/мл. Нормальный иммуноглобулин хранят при температуре2—8°C. Замораживать препараты иммуноглобулинов нельзя.

а. Препарат вводят глубоко в крупную мышцу, используя иглу 18—20G. Следует избегать попадания в кровеносный сосуд.

Взрослым и детям старшего возраста в одно место инъекции вводят не более 5мл, детям грудного и младшего возраста— не более 1—3мл препарата. Одновременно вводят не более 20мл препарата.

Больным с тяжелой тромбоцитопенией или любым другим нарушением гемостаза нормальный иммуноглобулин противопоказан. Показания к применению и дозы нормального иммуноглобулина приведены в табл.21.6.

б. Все препараты нормальных иммуноглобулинов безопасны и не содержат ВИЧ и вируса гепатитаB. Нормальные иммуноглобулины, разрешенные к применению в США, вызывают инфекционные осложнения крайне редко.

в. Нормальный иммуноглобулин не применяют при частых острых респираторных заболеваниях, бронхиальной астме и аллергических заболеваниях в отсутствие дефицита IgG.

г. Побочные действия. При случайном попадании в сосуд нормальный иммуноглобулин может вызвать анафилактоидную реакцию, поскольку агрегаты IgG активируют комплемент. Местные реакции при применении нормального иммуноглобулина— боль, асептический абсцесс, фиброз, поражение седалищного нерва.

2. Нормальный иммуноглобулин для в/в введения. Поскольку в/м инъекции не позволяют вводить нормальный иммуноглобулин в высоких дозах, в настоящее время все чаще применяется нормальный иммуноглобулин для в/в введения. В США разрешены к применению 7препаратов нормального иммуноглобулина для в/в введения.

Они используются для заместительной терапии у больных с недостаточностью гуморального иммунитета (см. гл.18,п.VI.А.1.а.1). Эти препараты содержат достаточный уровень антител к столбнячному, дифтерийному анатоксинам и вирусу полиомиелита. Титр антител к другим микроорганизмам может быть разным.

Нормальный иммуноглобулин для в/в введения назначают при X-сцепленной агаммаглобулинемии, тяжелом комбинированном иммунодефиците, иммунной тромбоцитопенической пурпуре, болезни Кавасаки и хроническом лимфолейкозе, сопровождающемся гипогаммаглобулинемией и рецидивирующими инфекциями.

Нормальный иммуноглобулин для в/в введения применяют также для профилактики цитомегаловирусной пневмонии после трансплантации костного мозга и лечения синдрома Гийена—Барре.

Показано, что у новорожденных с низким весом и у ВИЧ-инфицированных детей, у которых содержание лимфоцитовCD4 превышает 400мм–1, нормальный иммуноглобулин для в/в введения снижает риск тяжелых бактериальных инфекций.

В неконтролируемых исследованиях показано, что нормальный иммуноглобулин для в/в введения эффективен при аутоиммунных заболеваниях, в том числе при полимиозите и миастении. Препараты иммуноглобулина для в/в введения безопасны и редко вызывают серьезные побочные эффекты (см. гл.18,п.VI.А.1.б), в том числе вирусные инфекции.

Б. Специфические иммуноглобулины применяются для профилактики и лечения некоторых инфекций. Их выделяют из сыворотки вакцинированных или недавно перенесших инфекцию доноров (см. табл.21.7). Стандартизация этих препаратов основана на определении титра антител к антигенам соответствующего возбудителя.

Специфические иммуноглобулины вызывают побочные эффекты реже, чем иммунные сыворотки, получаемые из сыворотки животных. Специфические иммуноглобулины наиболее эффективны при введении сразу после заражения.

Поскольку продолжительность их действия невелика, одновременно с ними по возможности следует вводить соответствующие вакцины.

В. Свежезамороженная плазма. Свежезамороженную плазму для переливания выпускают в пластиковых контейнерах. Одна доза свежезамороженной плазмы соответствует 200—250мл донорской плазмы.

Этот препарат применяют: 1)для увеличения ОЦК при шоке; 2)как источник иммуноглобулинов при невозможности применения нормальных иммуноглобулинов (с этой целью свежезамороженную плазму назначают в дозе 20мл/кг/мес); 3)как источник компонентов плазмы при их дефиците, например фактораVIII при гемофилии или ингибитора C1-эстеразы при наследственном отеке Квинке (дозы подбирают индивидуально). Свежезамороженная плазма имеет некоторые преимущества перед нормальными иммуноглобулинами, поскольку она содержит компоненты, отсутствующие в нормальных иммуноглобулинах: IgA, IgM, компоненты комплемента и другие. К недостаткам свежезамороженной плазмы относятся: 1)риск передачи инфекции; 2)объемная перегрузка; 3)риск аллергических реакций; 4)риск реакции «трансплантат против хозяина» при переливании необлученной свежезамороженной плазмы больным с недостаточностью клеточного иммунитета.

Г. Иммунные сыворотки 1. Поскольку риск осложнений при использовании иммунных сывороток, в том числе противоядных и антитоксических, очень высок, они применяются только в тех случаях, когда отсутствуют соответствующие специфические иммуноглобулины. Иммунные сыворотки вызывают местные и системные аллергические реакции и сывороточную болезнь.

Сывороточная болезнь развивается приблизительно у 20% реципиентов иммунных сывороток, полученных от лошадей, через 1—3нед после введения. Ее риск особенно высок при назначении иммунных сывороток в высоких дозах. Предварительное иммунологическое исследование неинформативно. Для предупреждения и снижения тяжести сывороточной болезни применяют H1-блокаторы.

Сведения о некоторых иммунных сыворотках приведены в табл.21.8.

2. Меры предосторожности а. Иммунные сыворотки применяются только по абсолютным показаниям.

б. Обязательно уточняют, назначались ли иммунные сыворотки раньше и не было ли на них реакций. Особую осторожность следует соблюдать при сенсибилизации к лошадиным эпидермальным аллергенам. Даже в отсутствие реакций на иммунные сыворотки в анамнезе их вводят только после проведения кожных проб.

в. Сначала проводят пунктационную пробу. Иммунную сыворотку разводят физиологическим раствором в соотношении 1:100. Реакцию оценивают через 20мин. Если она отрицательна, внутрикожно вводят 0,02мл сыворотки в разведении 1:1000. При отрицательной реакции пробу повторяют с сывороткой в разведении 1:100. Реакцию оценивают через 30мин.

г. Если внутрикожная проба отрицательна, вводят гетерологичную сыворотку в/м. Даже при отрицательных кожных пробах соблюдают все меры предосторожности. При положительной кожной пробе проводят десенсибилизацию (см. гл.21,п.XV.Г.2.ж).

д. Если иммунную сыворотку необходимо ввести в/в, сначала медленно вводят пробную дозу— 0,5мл сыворотки в 10мл физиологического раствора или 5% раствора глюкозы— и наблюдают за больным в течение 30мин. В отсутствие реакции вводят сыворотку в разведении 1:20, со скоростью не более 1мл/мин. Профилактика и лечение анафилактических реакций описаны в гл.11,пп.V—VI.

е. Следует помнить, что иммунные сыворотки часто вызывают пирогенные реакции.

ж. При системных реакциях на иммунные сыворотки в анамнезе или положительных кожных пробах показана десенсибилизация.

1) Под рукой должны быть средства для лечения анафилактических реакций (см. гл.11,п.V).

2) Единой схемы десенсибилизации не существует. Можно руководствоваться рекомендациями Американской академии педиатрии (Report of the Committee of Infectious Diseases. Elk Grove Village, IL: American Academy of Pediatrics, 1994. Pp.46—49).

3) Если во время десенсибилизации развивается аллергическая реакция, а иммунная сыворотка абсолютно показана, рекомендуется следующее.

а) Вводят адреналин, 0,3—0,5мл раствора 1:1000 в/м, детям— 0,01мл/кг в/м, и другие препараты, используемые для лечения анафилактических реакций.

б) Наблюдают за больным в течение 15—30мин.

в) В отсутствие ухудшения вводят сыворотку в максимальной дозе, не вызывающей аллергическую реакцию, после чего дозу сыворотки осторожно повышают.

4) Профилактическое назначение H1-блокаторов и кортикостероидов снижает риск анафилактической реакции. За 2ч до введения очередной десенсибилизирующей дозы сыворотки назначают метилпреднизолон, 1—2мг/кг в/в, и дифенгидрамин, 1,5мг/кг (не более 50мг) в/в или в/м.

Х.Кесарвала, Дж.Кишияма.

I. Иммунный ответ при инфекционных заболеваниях

Иммунный ответ— это реакция на чужеродный антиген, которая приводит к накоплению и активации клеток, участвующих в его удалении. Течение и исход любой инфекции зависят от силы иммунного ответа на антигены возбудителя.

А. Механические барьеры— кожа, слизистые, мерцательный эпителий дыхательных путей и ЖКТ— препятствуют попаданию микробов в кровь.

Б. Макрофаги препятствуют диссеминации инфекции. В защите от инфекции участвуют как макрофаги, например купферовские клетки, альвеолярные и перитонеальные макрофаги, так и циркулирующие моноциты. Макрофаги захватывают и уничтожают микробы, расщепляют антигены и представляют его T-хелперам.

В. Антитела, как и макрофаги, предотвращают диссеминацию инфекции.

1. IgM составляют основную часть антител, вырабатываемых при первичном иммунном ответе. IgM обладают высокой способностью к связыванию и активации комплемента, агглютинации и опсонизации микробов.

2. IgA присутствуют в сыворотке, лимфе, слезе, грудном молоке, на слизистых и в их секретах, например в слюне. Эти антитела участвуют в защите от микробов, попадающих на слизистые.

3. IgG составляют около 80% иммуноглобулинов сыворотки и являются основными антителами, которые обеспечивают защиту от бактерий, грибов и вирусов.

Г. Лимфоциты. Существуют три популяции лимфоцитов: B-, T- и NK-лимфоциты. B-лимфоциты попадают в кровь и периферические органы иммунной системы из костного мозга и дифференцируются в плазматические клетки, продуцирующие антитела. T-лимфоциты также происходят из костного мозга, но созревают в тимусе.

T-лимфоциты делятся на несколько субпопуляций, которые различаются по функциям и поверхностным антигенам (см. гл.1,п.II.А). В разрушении зараженных клеток участвуют по крайней мере 2типа лимфоцитов.

Это цитотоксические T-лимфоциты— лимфоцитыCD8, функция которых ограничена HLA, и NK-лимфоциты, функция которых не ограничена HLA и которые способны разрушать инфицированные клетки на ранних стадиях инфекционного процесса, до появления цитотоксических T-лимфоцитов.

Существуют 2механизма, с помощью которых лимфоциты уничтожают микроорганизмы: разрушение инфицированных клеток при непосредственном контакте и выработка цитокинов, активирующих макрофаги. Больные с недостаточностью клеточного иммунитета подвержены таким заболеваниям, как туберкулез, корь, диссеминированный кандидоз, инфекция, вызванная вирусом varicella-zoster, даже при нормальном гуморальном иммунитете.

Д. Комплемент— это система сывороточных белков, которые разрушают клетки и участвуют в воспалении и регуляции иммунного ответа. Благодаря способности опсонизировать микроорганизмы, связываясь с их поверхностью непосредственно или через антитела, комплемент усиливает фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов.

Е. Интерфероны— группа цитокинов, которые играют важную роль в иммунитете, в том числе противовирусном. Известны 3типа интерферонов: интерферональфа (вырабатывается лейкоцитами), интерферонбета (вырабатывается фибробластами) и интерферонгамма (вырабатывается активированными T-лимфоцитами).

II. Общие принципы иммунодиагностики инфекционных заболеваний

А. Анамнез. При оценке результатов серологических исследований учитывают следующие данные.

1. Анамнез заболевания.

2. Сведения о перенесенных заболеваниях.

3. Сведения о вакцинации (сроки проведения и виды вакцин).

4. Сведения о поездках.

5. Место жительства и контакт с неблагоприятными факторами окружающей среды.

6. Сведения о контактах с источниками инфекции.

7. Сведения о контактах с животными.

8. Время года.

Б. Пробы для исследования. Для посева и определения антигенов возбудителя можно использовать разные ткани и биологические жидкости.

Для определения антител к возбудителю обычно используют сыворотку, СМЖ и синовиальную жидкость.

Чтобы выявить нарастание титра антител к какому-либо возбудителю, пробы сыворотки забирают в период разгара и в период выздоровления. При обнаружении антител в СМЖ исключают поражение ЦНС.

III. Иммунологические методы, применяемые для диагностики инфекционных заболеваний, приведены в табл.22.1.

А. РИА — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело, один из компонентов которой несет радиоактивную метку. Метод позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела и определять их концентрацию в исследуемой пробе.

Б. Иммунофлюоресцентный анализ также применяют для выявления как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцентным красителем.

Антитела чаще всего метят флюоресцеина изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии.

Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа.

1. Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа.

2. Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить антитела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывается с немечеными антителами. Комплексы антиген—антитело выявляются с помощью меченых антител к иммуноглобулинам.

3. Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.

В. Методы, основанные на реакции преципитации. При взаимодействии растворимых антигенов с антителами образуются высокомолекулярные комплексы антиген—антитело, которые выпадают в виде осадка в растворе или откладываются в виде полос преципитации в геле. Использование очищенных антигенов позволяет определить концентрацию антител в исследуемой пробе.

1. Преципитация в растворе. При добавлении антигена в возрастающей концентрации к одному и тому же количеству антител выпадает разное количество преципитата.

Можно построить график— кривую преципитации,— который отражает зависимость между концентрацией антигена и количеством преципитата: при избытке антител количество преципитата возрастает с увеличением концентрации антигена, в зоне эквивалентности (количество антигена примерно равно количеству мест связывания на антителах) образуется максимальное количество преципитата, при избытке антигена количество преципитата уменьшается с увеличением концентрации антигена.

>

Источник: http://medbookaide.ru/books/fold1002/book2100/p58.php

2 Вопрос: Методы иммунологической диагностики инфекционных заболеваний

Глава 22. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний

Иммунологическаядиагностика инфекционных заболеванийоснована на выявлении антител в организмепациента к возбудителю инфекции методамисерологических исследований. В основевсех серологических реакций лежитвзаимодействие антигена и антитела собразованием иммунных комплексов.Серологическиереакции применяются в двух направлениях.

1.Обнаружениес диагностической целью антител всыворотке крови обследуемого. В этомслучае из двух компонентов реакции(антитела, антиген) неизвестным являетсясыворотка крови. Постановка реакциипроводится с заведомо известнымиантигенами (диагностикумами).

Положительныйрезультат реакции свидетельствует оналичии в крови антител, гомологичныхприменяемому антигену; отрицательныйрезультат указывает на отсутствиетаковых. Достоверные результаты получаютпри исследовании “парных” сыворотоккрови больного, взятой в первые дниболезни и через разные промежуткивремени от начала заболевания.

В этомслучае удается наблюдать динамикунарастания антител. При вирусныхинфекциях лишь четырехкратное и большееповышение титра антител во второйсыворотке имеет диагностическоезначение.

2.Установлениеродовой, видовой и типовой принадлежностимикроба или вируса. В этом случаенеизвестным компонентом реакции являетсяантиген. Для этой цели используютсядиагностические иммунные сыворотки,полученные от животных после вакцинациисоответствующими антигенами. Этосерологическая идентификациямикроорганизмов.

Приинфекционных заболеваниях серологическиеисследования для обнаружения специфическихантител являются более доступным методомлабораторной диагностики, чембактериологическое выявление возбудителя.В ряде случаев серологические исследованияявляются единственным методом диагностикиинфекционных заболеваний.

Реакцияагглютинации (РА). В этой реакции принимаютучастие антигены в виде частиц (микробныеклетки, эритроциты и другие корпускулярныеантигены), которые склеиваются антителамии выпадают в осадок.

В зависимости отвида используемого иммунодиагностикумаразличают реакцию микробной агглютинации,гемагглютинации, латексагглютинации,коаглютинации и т.д.

Для диагностикиинфекционных заболеваний реакциюагглютинации проводят в двух направлениях:определяют вид выделенного от больногомикроба-возбудителя с помощьюдиагностической агглютинирующейсыворотки (серологическая идентификациямикроба) и обнаруживают специфическиеантитела в сыворотке больного, используястандартный микробный диагностикум(серодиагностика заболевания, постановкасерологического диагноза). Различаютпрямую и непрямую реакции агглютинации.Реакция прямой агглютинации микробов.В этой реакции антитела (агглютинины)непосредственно агглютинируюткорпускулярные антигены (агглютиногены).Обычно используется взвесь инактивированныхмикроорганизмов. Для определения видамикроорганизмов используют специальныедиагностические агглютинирующиесыворотки, полученные путем гипериммунизациилабораторных животных взвесью бактерий.Титром такой сыворотки является еенаибольшее разведение, при которомнаблюдается отчетливая агглютинациясоответствующего антигена. РазвернутуюРА проводят в пробирках или лункахпластин. Диагностическую сывороткуразводят до титра и вносят одинаковыеколичества антигена. При положительнойреакции на дне пробирки (лунки) образуетсярыхлый осадок в виде «зонтика»,приотрицательном – осадок в виде «пуговицы».Реакциянепрямой (пассивной) агглютинации. Дляполучения феномена агглютинации антигенпредварительно адсорбируют накорпускулярном носителе, которым служатинертные частицы (латекс, целлюлоза,полистирол и др.) или клетки (эритроцитыбарана, 1(0)-группы крови человека). Вреакции непрямой гемагглютинации (РНГА)в качестве носителя используют эритроциты.Нагруженные антигеном эритроцитысклеиваются в присутствии специфическихантител к данному антигену и выпадаютв осадок. Если нагрузить эритроцитыантителами, то их можно применять длявыявления антигенов. Реакция непрямойгемагглютинации используется дляопределения в сыворотке больного антителк сальмонеллам, шигеллам,Yersiniapseudotuberculosis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans. РНГАприменяется для выявления антител кTr. pallidum при лабораторной диагностикесифилиса.

Реакциясвязывания комплемента (РСК). В РСКпомимо антигена и антител принимаетучастие третий компонент – комплемент,который способен связываться с комплексомантиген-антитело.

Образование комплексовантиген-антитело и фиксация комплементане сопровождаются видимыми изменениями.Для обнаружения связывания комплементаиспользуют дополнительную индикаторнуюгемолитичесчкую систему (эритроцитыбарана, обработанные гемолитическойантисывороткой).

В присутствии комплемента(сыворотки морской свинки) происходитлизис эритроцитов. Если в опытной системеобразовались комплексы антиген-антитело,которые связывают комплемент, то лизисэритроцитов в индикаторной системе непроизойдет (реакция положительная).

РСКиспользуется при определении антителк вирусу Коксаки, при лабораторнойдиагностике сифилиса – реакция Вассермана.

Реакциялизиса.

Сущность реакции состоит в том,что при взаимодействии специфическихантител с антигенами клеток (эритроцитов,бактерий), на их поверхности образуетсякомплекс, который активирует комплементпо классическому пути, вследствие этогопроисходит лизис этих клеток.

Эта реакцияиспользуется при типировании антигеновсистемы HLA на лимфоцитах. К типируемымлимфоцитам добавляют антисывороткипротив различных HLA-антигенов, затем ихотмывают и добавляют комплемент.Присутствие соответствующего антигенаприводит к лизису лимфоцитов.

Реакцияиммунофлюоресценции. Прямой методиммунофлуоресценции (по Кунсу) основанна взаимодействии антител, меченныхфлуорохромом с антигеном, которыйнаходится на клетке, в клетке или тканях.В качестве флуорохрома часто используютфлуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ).

Этоткраситель дает зеленое свечение вультрафеолетовых лучах, атетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ)- оранжево-красное свечение. Прямойметод одноэтапный: на фиксированныймазок клеток с антигеном наносятдиагностическую сыворотку с меченымиантителами, инкубируют, отмывают иучитывают свечение в люминесцентноммикроскопе.

Непрямой метод иммунофлуоресценциизаключается в том, что антиген обрабатываютобычной диагностической сывороткой, адля обнаружения образовавшегосякомплекса антиген-антитело используютантисыворотку, меченную флуорохромом.Непрямой метод позволяет обнаруживатьразличные комплексы антиген-антителос помощью одной меченной антиглобулиновойсыворотки.

Метод иммунной флуоресценцииприменяют для идентификации бактерий,вирусов, клеточных рецепторов и антигенов.

Иммуноферментныйанализ (ИФА). В методах иммуноферментногоанализа используют иммунореагенты,меченные ферментами. Наиболее широкоиспользуется твердофазный ИФА. В качестветвердой фазы используют полистироловыеили поливиниловые планшеты или шарики,на которых адсорбированы антигены илиантитела.

Для выявления антител известныйантиген адсорбируют в лунках полистироловойпластины. Затем вносят исследуемуюсыворотку, в которой хотят обнаружитьантитела к данному антигену. Послеинкубации лунки промывают для удалениянесвязавшихся белков и вносят в нихантииммуноглобулиновые антитела,меченые ферментом.

После инкубации иотмывания в лунки добавляют специфичныйдля фермента субстрат и хромоген длярегистрации конечных продуктоврасщепления субстрата. О наличии иколичестве антител судят по изменениюцвета и интенсивности окраски раствора.

Методы ИФА обладают высокой чувствительностьюи специфичностью и получили наиболееширокое распространение средииммунологических методов клинико-лабораторнойдиагностики.

Радиоиммунологическийанализ. Принцип радиоиммунологическогоанализа (РИА) основан на выявлениикомплекса антиген-антитело, в которомодин из иммунореагентов был меченрадиоактивным изотопом. Обычно используютизотопы йода (I-125 и I-131). Учет реакциипроводят по убыванию или по возрастаниюрадиоактивности (в зависимости отметодики РИА) с помощью специальныхсчетчиков ионизирующего излучения.

Иммуноблотинг.Вариант ИФА, повышающий чувствительностьметода при изучении гетерогенной смесиантигенов. Смесь антигенов подвергаютдискэлектрофорезу в полиакриламидномгеле в присутствии додецилсульфатанатрия.

Полученные таким образоминдивидуальные полосы антигеновпереносят на нитроцеллюлозные полоскис помощью специального аппарата дляпереноса. В дальнейшем ход реакциисводится к гетерогенному не конкретномуИФА. Нитроцеллюлозные полоски сперенесенными на них антигенамиобрабатывают испытуемой сывороткой.

Имеющиеся в ней антитела связываютсяс индивидуальными антигенами,представленными в виде отдельных полос.Связавшиеся антитела проявляют приобработке конъюгатом фермента сантителами к иммуноглобулинам человека.На последнем этапе определяют активностьфермента.

Таким образом, можно определитьпротив каких антигенов смеси направленыантитела сыворотки больного. На основереакции иммуноблотинга созданыдиагностические наборы для определенияв сыворотке больного антител к вирусугепатита С и ВИЧ-1-2.

Гибридизационныйанализ (ГА). Проводится определениенуклеиновых кислот по связыванию с ДНК-и РНК- зондами. Метод ГА основан на отжигеодноцепочечного фрагмента нуклеиновойкислоты на комплиментарный ему участокдругой молекулы анализируемой нуклеиновойкислоты с образованием двух цепочечнойгибридной молекулы.

Зонд может бытьполучен либо химическим синтезомолигонуклеотидов. Либо с помощью синтезаДНК на одной из нитей детектируемой ДНКс помощью фермента ДНК-полимеразы (дляРНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы).Полученная копия может быть встроенав плазмиду и затем размножена в составекаких-либо бактерий.

Зонд должен иметьрепортерную группу, выявляемуюферментативно или физическим методом.В настоящее время в медицинской практикеуспешно применяются ДНК-зонды, в которыхв качестве репортерных групп используютбиотин, дегоксигенин, комплексы платиныи др.

Введение меток может производитьсяс помощью химических, физических,фотохимических и ферментативных реакций.В частности при амплификации.

Такжеразнообразны методы детекцииобразовавшегося гибрида нуклеиновыхкислот: с помощью хромогенных ихемилюминесцентных субстратоввысокоактивных ферментов (пероксидаза,щелочная фосфатаза), люминесценции идр. На основе нерадиоизотопного ГАсозданы диагностикумы для выделениявируса папилломы, герпеса, хламидий иуреаплазмы.

Полимеразнаяцепная реакция (ПЦР). ПЦР – это методумножения числа копий нуклеиновыхкислот (амплификация) in vitro. Передпроведением реакции из биологическогоматериала выделяют ДНК или РНК возбудителяинфекционного заболевания или ДНКгенома клеток человека.

Полимеразнаяцепная реакция проводится с использованиемдвух или более олигонуклеотидныхпраймеров («затравки»),фланкирующихучасток ДНК (РНК), специфический дляопределяемого участка генома.

Процессамплификации заключается в повторяющихсяциклах температурной денатурации ДНК,отжига праймеров с комплементарнымипоследовательностями и последующейдостройки полинуклеотидных цепей сэтих праймеров ДНК-полимеразой. Праймерыориентированы таким образом, что синтезс помощью полимеразы протекает толькомежду ними, удваивая количество копийэтого участка ДНК в каждом последующемцикле.

Как правило, проводится не менее30 последовательных циклов реакции.Амплифицированный учасок именуют«ампликоном».Врезультате реакции происходитэкспоненциальное увеличение количествакопий специфического фрагмента. Приамплификации используется термостабильнаяДНК-полимераза, выделенная из бактерийThermus aquaticus (Taq), живущих в горячих источниках.

Билет14

Источник: https://studfile.net/preview/5868146/page:6/

Глава 22. Иммунологические методы диагностики инфекционных заболеваний

Х. Кесарвала, Дж. Кишияма

I. Иммунный ответ при инфекционных заболеваниях. Иммунный ответ — это реакция на чужеродный антиген, которая приводит к накоплению и активации клеток, участвующих в его удалении. Течение и исход любой инфекции зависят от силы иммунного ответа на антигены возбудителя.

А. Механические барьеры — кожа, слизистые, мерцательный эпителий дыхательных путей и ЖКТ — препятствуют попаданию микробов в кровь.

Б. Макрофаги препятствуют диссеминации инфекции. В защите от инфекции участвуют как макрофаги, например купферовские клетки, альвеолярные и перитонеальные макрофаги, так и циркулирующие моноциты. Макрофаги захватывают и уничтожают микробы, расщепляют антигены и представляют его T-хелперам.

В. Антитела, как и макрофаги, предотвращают диссеминацию инфекции.

1. IgM составляют основную часть антител, вырабатываемых при первичном иммунном ответе. IgM обладают высокой способностью к связыванию и активации комплемента, агглютинации и опсонизации микробов.

2. IgA присутствуют в сыворотке, лимфе, слезе, грудном молоке, на слизистых и в их секретах, например в слюне. Эти антитела участвуют в защите от микробов, попадающих на слизистые.

3.

IgG составляют около 80% иммуноглобулинов сыворотки и являются основными антителами, которые обеспечивают защиту от бактерий, грибов и вирусов.

Г. Лимфоциты. Существуют три популяции лимфоцитов: B-, T- и NK-лимфоциты. B-лимфоциты попадают в кровь и периферические органы иммунной системы из костного мозга и дифференцируются в плазматические клетки, продуцирующие антитела. T-лимфоциты также происходят из костного мозга, но созревают в тимусе.

T-лимфоциты делятся на несколько субпопуляций, которые различаются по функциям и поверхностным антигенам (см. гл. 1, п. II.А). В разрушении зараженных клеток участвуют по крайней мере 2 типа лимфоцитов.

Это цитотоксические T-лимфоциты — лимфоциты CD8, функция которых ограничена HLA, и NK-лимфоциты, функция которых не ограничена HLA и которые способны разрушать инфицированные клетки на ранних стадиях инфекционного процесса, до появления цитотоксических T-лимфоцитов.

Существуют 2 механизма, с помощью которых лимфоциты уничтожают микроорганизмы: разрушение инфицированных клеток при непосредственном контакте и выработка цитокинов, активирующих макрофаги. Больные с недостаточностью клеточного иммунитета подвержены таким заболеваниям, как туберкулез, корь, диссеминированный кандидоз, инфекция, вызванная вирусом varicella-zoster, даже при нормальном гуморальном иммунитете.

Д. Комплемент — это система сывороточных белков, которые разрушают клетки и участвуют в воспалении и регуляции иммунного ответа. Благодаря способности опсонизировать микроорганизмы, связываясь с их поверхностью непосредственно или через антитела, комплемент усиливает фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов.

Е. Интерфероны — группа цитокинов, которые играют важную роль в иммунитете, в том числе противовирусном. Известны 3 типа интерферонов: интерферон альфа (вырабатывается лейкоцитами), интерферон бета (вырабатывается фибробластами) и интерферон гамма (вырабатывается активированными T-лимфоцитами).

II. Общие принципы иммунодиагностики инфекционных заболеваний

А. Анамнез. При оценке результатов серологических исследований учитывают следующие данные.

1.Анамнез заболевания.

2.Сведения о перенесенных заболеваниях.

3.

Сведения о вакцинации (сроки проведения и виды вакцин).

4.Сведения о поездках.

5.Место жительства и контакт с неблагоприятными факторами окружающей среды.

6.Сведения о контактах с источниками инфекции.

7.Сведения о контактах с животными.

8.Время года.

Б. Пробы для исследования. Для посева и определения антигенов возбудителя можно использовать разные ткани и биологические жидкости.

Для определения антител к возбудителю обычно используют сыворотку, СМЖ и синовиальную жидкость.

Чтобы выявить нарастание титра антител к какому-либо возбудителю, пробы сыворотки забирают в период разгара и в период выздоровления. При обнаружении антител в СМЖ исключают поражение ЦНС.

III. Иммунологические методы, применяемые для диагностики инфекционных заболеваний, приведены в табл. 22.1.

А. РИА — высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело, один из компонентов которой несет радиоактивную метку. Метод позволяет обнаруживать как антигены, так и антитела и определять их концентрацию в исследуемой пробе.

Б. Иммунофлюоресцентный анализ также применяют для выявления как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцентным красителем.

Антитела чаще всего метят флюоресцеина изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии.

Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа.

1. Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа.

2. Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить антитела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывается с немечеными антителами. Комплексы антиген—антитело выявляются с помощью меченых антител к иммуноглобулинам.

3.

Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.

В. Методы, основанные на реакции преципитации. При взаимодействии растворимых антигенов с антителами образуются высокомолекулярные комплексы антиген—антитело, которые выпадают в виде осадка в растворе или откладываются в виде полос преципитации в геле. Использование очищенных антигенов позволяет определить концентрацию антител в исследуемой пробе.

1. Преципитация в растворе. При добавлении антигена в возрастающей концентрации к одному и тому же количеству антител выпадает разное количество преципитата.

Можно построить график — кривую преципитации, — который отражает зависимость между концентрацией антигена и количеством преципитата: при избытке антител количество преципитата возрастает с увеличением концентрации антигена, в зоне эквивалентности (количество антигена примерно равно количеству мест связывания на антителах) образуется максимальное количество преципитата, при избытке антигена количество преципитата уменьшается с увеличением концентрации антигена.

2. Иммунодиффузия — наиболее распространенный из всех методов, основанных на реакции преципитации (см. гл. 20, пп. I.Б—В).

а. Простая радиальная иммунодиффузия.

Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля, содержащего антитела в известной концентрации, вырезают лунки; 2) антиген, помещенный в эти лунки, диффундирует в гель; 3) вокруг лунок образуются кольца преципитации, диаметр которых пропорционален концентрации антигена. Метод обычно применяется для определения концентрации иммуноглобулинов.

б. Двойная радиальная иммунодиффузия. Суть метода заключается в следующем: 1) в тонком слое геля вырезают лунки для антигена и антител; 2) антиген и антитела диффундируют навстречу друг другу, образуя линии преципитации на некотором расстоянии от лунок. По расстоянию от лунки с антигеном до линии преципитации можно определить концентрацию антигена.

3.

Электрофорез

а. Иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание двух методов — иммунодиффузии и зонального электрофореза. Иммуноэлектрофорез применяется в основном для исследования сывороточных белков.

Суть метода заключается в следующем: 1) в лунку, вырезанную в тонком слое геля, помещают исследуемую сыворотку; 2) проводят электрофоретическое разделение белков сыворотки; 3) в геле вырезают бороздку, параллельную направлению миграции белков при электрофорезе, и заполняют ее смесью антител к сывороточным белкам; 4) разделенные при электрофорезе белки (антигены) и антитела диффундируют навстречу друг другу. В местах связывания антител с антигенами образуются дуги преципитации (см. гл. 20, п. I.А).

б. Встречный электрофорез.

Суть метода заключается в следующем: 1) исследуемые антигены и смесь антител помещают в лунки, расположенные на противоположных концах пластины с гелем; 2) вдоль линии, соединяющей лунки, пропускают постоянный электрический ток; 3) в электрическом поле антитела и антигены быстро перемещаются по направлению друг к другу; 4) в месте связывания антигенов с антителами образуются линии преципитации. Встречный электрофорез применяют в тех случаях, когда антигены и антитела обладают разной электрофоретической подвижностью. Этот метод позволяет быстро определить антигены или антитела в исследуемой пробе и применяется в экспресс-диагностике инфекционных заболеваний.

Г. Методы, основанные на реакции агглютинации, довольно чувствительны и применяются для выявления антигенов на поверхности клеток или частиц и полуколичественного определения антител к этим антигенам.

Суть методов заключается в следующем: при связывании клеток или частиц, покрытых антигеном, с антителами образуются крупные агрегаты.

Для определения титра антител к поверхностным антигенам клеток или к антигенам, сорбированным на поверхности частиц, смешивают известное количество клеток или частиц, покрытых антигеном, с разными разведениями исследуемой пробы, например сыворотки.

1. Реакция прямой агглютинации применяется для выявления поверхностных антигенов микробов или клеток крови и антител к этим антигенам.

Суть метода заключается в следующем: серийные разведения исследуемой пробы (например, сыворотки) смешивают с клетками, за титр антител принимают величину, обратную максимальному разведению сыворотки, которое вызывает агглютинацию.

Этот метод более чувствителен, чем методы, основанные на преципитации, поскольку при равной концентрации антигена объем агглютината больше объема преципитата. Реакция агглютинации не зависит от температуры, если только не обусловлена холодовыми агглютининами, которые более эффективны при температуре ниже 37°C.

2. Реакция непрямой агглютинации основана на агглютинации эритроцитов, других клеток или частиц (например, латекса или бентонита), покрытых антигеном.

Для определения титра антител серийные разведения сыворотки в физиологическом растворе смешивают с известным количеством покрытых антигеном клеток или частиц.

Реакция непрямой агглютинации — чувствительный метод, позволяющий определять растворимые антигены в низких концентрациях.

Д. Реакция связывания комплемента. Суть метода заключается в следующем: 1) антиген смешивают с антителами; 2) к образовавшимся комплексам антиген—антитело добавляют известное количество комплемента, который связывается с этими комплексами; 3) количество несвязанного комплемента оценивают в реакции гемолиза с эритроцитами барана.

Е. Твердофазный ИФА — надежный, экономичный и высокочувствительный метод. Он основан на использовании стандартных препаратов очищенных антигенов или антител, ковалентно связанных с ферментом. Эти препараты сохраняют и иммунологические свойства, и ферментативную активность, которую можно измерить при добавлении субстрата данного фермента (см. гл. 20, п. I.Е).

Ж. Другие методы

1. Определение уровня C-реактивного белка. C-реактивный белок — белок острой фазы воспаления, относящийся к бета-глобулинам.

C-реактивный белок, как и другие белки острой фазы воспаления, появляется в сыворотке вскоре после повреждения тканей и начала воспаления.

Повышение уровня C-реактивного белка наблюдается при острых бактериальных и вирусных инфекциях, инфаркте миокарда, злокачественных новообразованиях и аутоиммунных заболеваниях (см. гл. 15, п. II.Б).

2. Определение титра холодовых агглютининов. Холодовые агглютинины — это IgM, которые вызывают максимальную агглютинацию эритроцитов при 4°C.

Холодовые агглютинины появляются при некоторых заболеваниях, например при микоплазменной пневмонии, реже при гриппе, аденовирусной инфекции и других острых респираторных заболеваниях, а также при сонной болезни.

Диагностически значимым считается выявление холодовых агглютининов в титре 1:32 или четырехкратное повышение их титра в течение 7—14 сут.

3.

Определение титра агглютинирующих антител. Агглютинирующие антитела к возбудителю появляются в сыворотке при многих инфекционных заболеваниях: сальмонеллезе, паратифе, бруцеллезе, туляремии, риккетсиозе и других. Титр этих антител можно определить в реакции агглютинации инактивированных бактерий при добавлении разных разведений сыворотки. Сыворотку для исследования обычно собирают дважды: в период разгара и в период выздоровления (через 10—21 сут).

Диагностически значимым считают четырехкратное повышение титра антител.

4. Реакция Нейфельда — набухание клеточной стенки бактерий под действием антител к типоспецифическим капсульным полисахаридам, видимое при световой микроскопии.

Эту реакцию можно наблюдать при добавлении антител, направленных против полисахаридов клеточной стенки Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae и Neisseria meningitidis (серотипов A и C), к этим бактериям.

Реакция Нейфельда применяется для исследования сыворотки и СМЖ.

5. Реакция с лизатом амебоцитов мечехвоста (Limulus polyphemus) применяется для диагностики инфекций, прежде всего сепсиса и менингита, вызванных грамотрицательными бактериями. Метод основан на том, что при добавлении бактериальных эндотоксинов жидкий лизат амебоцитов меченосца превращается в гель.

IV. Кожные пробы, основанные на аллергических реакциях замедленного типа, — наиболее простой и доступный способ оценки клеточного иммунитета.

А. Антигены для проведения кожных проб. Кожные пробы обычно проводят с очищенным туберкулином, трихофитоном, дерматофитином 0, столбнячным анатоксином, антигенами вируса эпидемического паротита и Coccidioides immitis (см. гл. 18, п. III.Ж и табл. 22.2).

Б. Заболевания и состояния, которые сопровождаются угнетением клеточного иммунитета и, следовательно, аллергических реакций замедленного типа, перечислены ниже.

1.Первичные и вторичные иммунодефициты.

2.Острые вирусные инфекции, в том числе эпидемический паротит, краснуха, корь, инфекция, вызванная вирусом varicella-zoster, грипп, инфекционный мононуклеоз.

3.

Грибковые инфекции, например кокцидиоидоз, криптококкоз, аспергиллез.

4.Бактериальные инфекции, в том числе туберкулез, бактериальные менингит и пневмония.

5.Злокачественные новообразования.

6.Иммунизация живыми вирусными вакцинами.

7.Лечение кортикостероидами и иммунодепрессантами.

8.Аутоиммунные заболевания.

9.Большие операции.

10.Истощение.

В. Техника проведения кожных проб

1.Участок кожи для инъекции обрабатывают антисептиком.

2.Внутрикожно вводят 0,1 мл раствора антигена. Для этого используют туберкулиновый шприц объемом 1 мл и иглу 27 G длиной 12 мм.

3.

Место инъекции обводят несмываемым карандашом.

4.Через 24—72 ч (в зависимости от используемого антигена) измеряют два размера эритемы и папулы, рассчитывают средний и записывают результат кожной пробы в миллиметрах.

Г.Реакция на внутрикожное введение антигена и сроки ее развития зависят от вида антигена (см. табл. 22.2).

V. Диагностика вирусных инфекций.

В настоящее время широко применяются 4 способа диагностики вирусных инфекций: 1) выделение вируса в культуре клеток (наиболее точный способ); 2) выявление цитоплазматических, внутриядерных включений и гигантских многоядерных клеток в окрашенных мазках; 3) выявление не менее чем четырехкратного возрастания титра антител к вирусу на разных стадиях заболевания; 4) выявление вируса или его антигенов в тканях и биологических жидкостях с помощью экспресс-тестов.

А. Материалом для выделения вируса в культуре клеток могут служить мазки со слизистой глотки и носоглотки, мокрота, моча, кал, кровь, СМЖ, экссудат, биоптат.

При взятии проб соблюдают правила асептики, пробу помещают в стерильный контейнер и транспортируют в лабораторию. При подозрении на особо опасные инфекции соблюдают дополнительные меры предосторожности и используют специальное оборудование.

Выделение возбудителя в этом случае проводят в специализированных лабораториях.

Б. Соскоб со дна везикулы

1.Делают надрез скальпелем по периферии везикулы.

2.Приподнимают отслоившийся эпидермис и удаляют жидкость с помощью тампона.

3.

Скальпелем делают соскоб со дна везикулы. При этом следует избегать кровотечения.

4.Полученный материал переносят на 2 чистых предметных стекла и делают 2 мазка диаметром 5—10 мм.

5.Мазки высушивают на воздухе и фиксируют спиртом.

6.Фиксированные мазки окрашивают по Гимзе или обрабатывают антителами, меченными флюоресцентным красителем.

7.Для получения надежных результатов соскоб производят трижды.

В. Продукцию антител к вирусным антигенам можно оценить с помощью реакции нейтрализации, реакции торможения гемагглютинации, реакции связывания комплемента и твердофазного ИФА.

Пробы крови (2—10 мл) забирают на ранней стадии заболевания и спустя 2—3 нед. В стерильных условиях получают сыворотку, помещают ее в стерильную пробирку и до отправки в лабораторию хранят в холодильнике или замораживают (–20°C).

Диагностически значимым считается четырехкратное повышение титра антител в ходе заболевания.

1. Реакция связывания комплемента (см. гл. 22, п. III.Д).

2. Реакция нейтрализации — высокоспецифичный метод, основанный на связывании вируса антителами и его нейтрализации. Метод позволяет определить уровень противовирусных антител и способность исследуемой сыворотки нейтрализовать вирусы.

Суть метода заключается в следующем: 1) производят серийные разведения исследуемой сыворотки; 2) разные разведения сыворотки смешивают с известным количеством вируса; 3) сыворотку добавляют к культуре клеток, восприимчивой к данному вирусу; 4) нейтрализующую активность сыворотки оценивают по снижению способности вирусов инфицировать культуру клеток.

3.

Реакция торможения гемагглютинации — высокоспецифичный и чувствительный метод, позволяющий определить даже незначительное количество противовирусных антител в биологических жидкостях. Этот метод основан на способности некоторых вирусов сорбироваться на эритроцитах, в частности на человеческих эритроцитах группы 0 и куриных эритроцитах, и вызывать гемагглютинацию.

Если исследуемая биологическая жидкость содержит противовирусные антитела, при ее добавлении к вирусам будет наблюдаться торможение гемагглютинации. Чем выше содержание противовирусных антител в исследуемой жидкости, тем сильнее подавляется гемагглютинация.

Г. Для экспресс-диагностики вирусных инфекций применяют серологические методы, основанные на применении стандартных противовирусных антител. Эти методы перечислены ниже.

1.РИА.

2.Иммунофлюоресцентный анализ.

3.

Твердофазный ИФА.

Д. Инфекционный мононуклеоз вызывает вирус Эпштейна—Барр. Заболевание обычно возникает в детском и молодом возрасте.

К характерным проявлениям инфекционного мононуклеоза относятся лихорадка, боль в горле, увеличение лимфоузлов, спленомегалия, лимфоцитоз.

Поскольку сходная клиническая картина наблюдается также при цитомегаловирусной инфекции, бруцеллезе, туляремии, остром токсоплазмозе и на ранних стадиях краснухи, для диагностики инфекционного мононуклеоза используют серологические методы.

1. Гетерофильные антитела — IgM, взаимодействующие с антигенами животных неродственных видов, например барана или быка. Эти антитела выявляются примерно у 90% больных инфекционным мононуклеозом. Гетерофильные антитела в низком титре могут присутствовать и у здоровых людей.

а. Проба Пауля—Буннелля — стандартный метод лабораторной диагностики инфекционного мононуклеоза. Он заключается в выявлении гетерофильных антител к эритроцитам барана с помощью реакции гемагглютинации.

Гетерофильные антитела при инфекционном мононуклеозе отличаются от гетерофильных антител, присутствующих в сыворотке здоровых и больных сывороточной болезнью, по способности абсорбироваться тканью почек морской свинки и эритроцитами быка (см. табл. 22.3).

Диагностически значимым считается титр 1:128—1:256. Гетерофильные антитела обычно обнаруживают через 3—4 нед после начала заболевания.

Реакция Пауля—Буннелля бывает положительной при лейкозах, вирусных гепатитах, цитомегаловирусной инфекции, лимфоме Беркитта, ревматоидном артрите и после введения иммунных сывороток. Титр антител не отражает тяжести заболевания, однако при измерении в динамике позволяет следить за течением заболевания.

б. Экспресс-тест на гетерофильные антитела (Моно-Тест, Уэмпоул Лэборэтрис). Гетерофильные антитела в этом исследовании выявляются при агглютинации стабилизированных формалином эритроцитов лошади. Абсорбцию тканью почек морской свинки и эритроцитами быка не проводят.

2. Специальные серологические методы. Инфекционный мононуклеоз не всегда сопровождается появлением гетерофильных антител. Они, в частности, отсутствуют у детей. В этом случае применяют следующие серологические методы.

а. Антитела к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр выявляют методом иммунофлюоресценции. На ранней стадии заболевания в сыворотке больного появляются IgM к капсидному антигену.

Их титр становится максимальным через 2 нед после начала заболевания и снижается в течение 2—3 мес.

Присутствие IgM к капсидному антигену вируса Эпштейна—Барр свидетельствует о недавнем заражении, а IgG — о ранее перенесенном заболевании.

б. Антитела к ранним антигенам вируса Эпштейна—Барр выявляются методом непрямой иммунофлюоресценции. Титр этих антител становится максимальным через 2—3 нед после начала заболевания.

в. Антитела к ядерному антигену вируса Эпштейна—Барр выявляются методом непрямой иммунофлюоресценции с применением комплемента и меченых антител к нему. Антитела к ядерному антигену появляются примерно через 4 нед после начала заболевания и сохраняются на протяжении всей жизни.

Источник: http://immunologia.narod.ru/22.htm

Medic-studio
Добавить комментарий