Глубинное культивирование микроорганизмов: Глубинный способ культивирования наиболее широко используется в

Способы культивирования микроорганизмов

Глубинное культивирование микроорганизмов: Глубинный способ культивирования наиболее широко используется в

Культивирование – это процесс выращивания микроорганизмов в (на) питательной среде, в результате которого происходит размножение, накопление их биомассы и продуктов метаболизма (продуктов микробного синтеза).

Глубинный метод культивированиязаключается в выращивании микроорганизмов в жидкой питательной среде.

Преимущества глубинного культивирования продуцентов:

1. Позволяет получать бактериальную массу за короткое время.

2. Процесс легко управляем из-за высокой степени автоматизации.

3. Позволяет легко корректировать рН среды в ходе культивирования посредством дополнительного внесения питательных веществ, особенно углеводных и биологических стимуляторов.

4. При данном способе выращивания максимальные результаты культивирования легко воспроизводимы.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в аппаратах-культиваторах (биореакторах) складывается из следующих этапов:

– получение посевного материала;

– приготовление питательных сред;

– стерилизация питательных сред;

– очистка воздуха до и после аэрирования;

– производственное культивирование.

1. Получение посевного материала.Для засева питательной среды посевной материал готовят также глубинным способом. Вид посевного материала зависит от вида микроорганизма: для грибов и актиномицетов – это мицелиальная вегетативная масса, а для бактерий – молодая растущая культура на начальной стадии спороношения.

Получение посевного материала осуществляется постадийным увеличением массы микроорганизмов в четыре ступени:

– исходная культура продуцента;

– маточная культура, выращенная в колбах на качалке;

– посевная культура, выращенная в инокуляторе;

– посевная культура, выращенная в посевном аппарате.

Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Он резко возрастает, до 5-20 %, если продуцент размножается только вегетативно, и сокращается до 1 %, если культура спороносящая. Объем посевного аппарата составляет до 10 % от объема промышленного ферментера. При использовании слишком молодой культуры процесс получения посевного материала значительно удлиняется.

2. Приготовление питательных сред.В промышленных условиях питательные среды обычно готовят в отдельном цехе, чтобы загрязненное микроорганизмами сырье не попало в основное производство.

Среды готовят в емкостях, снабженных механическими мешалками, добавляя в определенной последовательности растворимые (соевая мука, кукурузная мука, мел) компоненты. При необходимости отдельные компоненты дополнительно обрабатывают: измельчают, просеивают, отваривают, экстрагируют.

Поэтому цех для приготовления питательных сред должен быть оборудован теплообменниками, дозаторами, размельчителями, экстракторами, варочными котлами, аппаратами для гидролиза. Для лучшего растворения среду нагревают до 70-80ºС острым паром.

3. Стерилизация питательных сред. Приготовленную питательную среду стерилизуют двумя способами – отделением микроорганизмов от среды или уничтожением их в среде. Перспективнее первый способ, поскольку при любом методе уничтожения микроорганизмов происходит частичное разрушение питательных компонентов среды.

Первый способ проводят с помощью полупроницаемых мембран в процессе микрофильтрации. Второй метод стерилизации проводят с помощью высоких температур.

Стерилизацию питательных сред можно проводить периодически и непрерывно. При периодическом способе процесс ведут в самом ферментере, куда заливают питательную среду, нагревают ее до температуры стерилизации, выдерживают при этой температуре нужное время и охлаждают.

При непрерывном способе предварительно стерилизуют аппараты и коммуникации проточным паром, затем подают в ферментер среду, которая прошла через нагревательную колонку, где нагрелась острым паром до 120-140 ºС, выдерживатель, где находилась нужное время при температуре стерилизации и холодильник, где охладилась до температуры культивирования.

Отдельно от среды периодическим способом стерилизуют пеногаситель и все корректирующие растворы.

4. Очистка воздуха до и после аэрирования.Атмосферный воздух содержит частицы пыли органической и неорганической природы, капли воды и микроорганизмы в количестве до 10 5 частиц на 1 м3.

Стерильность его достигается фильтрацией через объемные волокнистые фильтры.

Обычно необходима двойная очистка – на головном фильтре, затем на индивидуальных фильтрах непосредственно перед вводом воздуха в посевные и производственные ферментеры.

После аэрирования производственной культуры газовый поток, отводимый из ферментера, несет с собой клетки продуцента. Их отлавливают фильтрами на отводящем воздухоносе.

5 Производственное культивирование.Биосинтез веществ глубинным способом протекает достаточно быстро. Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18-24 часа, для спорообразующих она колеблется от 40 до 250 часов (для актиномицетов и микроскопических грибов) при непрерывной подаче воздуха (кроме анаэробов) и перемешивании.

Высокие концентрации питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы микроорганизмов. Поэтому питательная среда вводится в ферментер постепенно на стадии активного роста. Большинство продуцентов являются мезофильными микроорганизмами и оптимум их развития находится при температуре 22-32 ºС. Почти все быстро инактивируются при повышении температуры сверх оптимальной.

Процесс культивирования контролируют по изменению температуры, рН, расходу воздуха, частоте вращения мешалки, содержанию кислорода, а также путем периодического отбора проб (через 1-12 часов). В пробах определяют содержание углеводов, общего и аминного азота, наличие посторонней микрофлоры, исследуют морфологию микробных клеток.

Глубинный способ выращивания микроорганизмов может быть как периодическим, так и непрерывным.

При периодическом способепродуценты выращивают в какой-либо среде без ее смены, загружая в биореактор весь объем питательной среды и посевного материала (инокулят) одновременно. Процесс ведется до образования определенного количества биомассы или продукта метаболизма.

Непрерывное культивирование, в отличие от периодического, имеет явные преимущества и является более перспективным. Сущность его заключается в том, что в ферментаторе (биореакторе) поддерживаются постоянные условия среды, в результате чего микроорганизм остается в определенном физиологическом состоянии.

Рис. 3. Кривая роста микроорганизма

Предыдущая78910111213141516171819202122Следующая

Дата добавления: 2014-12-27; просмотров: 5249; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

ПОСМОТРЕТЬ ЁЩЕ:

Источник: https://helpiks.org/1-127505.html

Глубинный способ культивирования микроорганизмов

Глубинное культивирование микроорганизмов: Глубинный способ культивирования наиболее широко используется в
⇐ ПредыдущаяСтр 6 из 8Следующая ⇒

Глубинный метод выращивания в промышленных условиях патогенных микроорганизмов впервые был применен Н. Е. Лебедевым в 1950 году.

Внедрение его в промышленное производство явилось большим достижением в микробиологии, давшим возможность получить большое количество бактериальной массы за короткое время.

С применением интенсивной аэрации скорость размножения микроорганизмов бывает еще выше.

Так, на синтетических средах накопление микроорганизмов бактерий кишечной группы за 14 часов культивирования с применением принудительной аэрации составляет 25 млрд/мл, на мясных средах 50—60 млрд/мл, в то время как при культивировании этих же микробов и на тех же средах без аэрации, то есть в стационарных (состоянии покоя) условиях, количество микробов не превышает 1—2 млрд/мл. Такая большая разница в накоплении биомассы объясняется тем, что при аэрации практически отсутствует начальная стационарная фаза, фаза отрицательного ускорения размножения становится более продолжительной. В условиях аэрации бактерии сразу начинают интенсивно размножаться, переходя в фазу ускоренного размножения и логарифмическую фазу.

Для выращивания микроорганизмов в промышленных условиях в настоящее время применяют реакторы с барбатерами и металлическими мешалками для диспергирования воздуха. Размешиваний питательной среды и ее аэрацию следует рассматривать как единый процесс, так как равномерно аэрировать всю культуральную жидкость в больших емкостях, не прибегая к размешиванию, невозможно.

Значительный интерес представляет вопрос о связи между интенсивностью потребления кислорода микроорганизмами и его содержанием в среде. Известно, что кислород плохо растворяется в воде. Вода при 20° С содержит только 0,0009% кислорода, при 37° С в воде, соприкасающейся с воздухом, содержится 0,0007% кислорода.

В связи с этим в питательную среду поступление кислорода должно быть очень интенсивным. Скорость поступления кислорода в любую часть культуральной жидкости должна быть не менее скорости его потребления.

В противном случае произойдет местное или временное обеднение среды кислородом, что вызовет повреждение микробных клеток.

Глубинный способ культивирования в биопромышленности является основным при производстве большинства биопрепаратов. Он осуществляется, как правило, в реакторах (ферментерах) большой емкости. Их подразделяют на две группы: по конструкции и по принципу перемешивания культуральной жидкости

Рис. 2.3.1.Упрощенные схемы биореакторов различных типов:

А — реактор с механическим перемешиванием; Б — барботажная колонна; В — эрлифтный реактор с внутренней циркуляцией; Г — лифтный реактор с внешней циркуляцией. Стрелки указывают направление потока культуральной среды

В биореакторах, относящихся к первой группе,перемешивание клеток происходит путем аэрирования воздухом.

Это барботажный тип биореактора, при котором процесс перемешивания суспензии осуществляется поднимающимися пузырьками воздуха.

В случае барботажных биореакторов обычно получают хорошие ростовые характеристики для большого числа клеточных культур. Однако сложность поддержания суспензии в гомогенном состоянии при высоких концентрациях биомассы клеток сужает сферу их применения.

Несколько больших значений максимальной концентрации клеточной биомассы можно достичь при применении эрлифтных биореакторов, в которых создаются направленные циркуляционные потоки.

В эрлифтных биореакторах перемешивание суспензии осуществляется за счет применения специальной конструкции, создающей градиент плотности (как правило, это конструкция с внутренним цилиндром).

Вторая группа биореакторов представляет собой аппараты с применением механических перемешивающих устройств. Биореакторы этого типа позволяют изучать растительные клеточные популяции в очень широком диапазоне концентраций биомассы клеток. Вместе с тем стрессовое воздействие перемешивающего устройства на клеточную популяцию часто ограничивает их применение.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в реакторах складывается из следующих этапов:

1) подготовка реактора к посеву;

2) отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними;

3) приготовление матровой культуры для засева питательной среды;

4) посев матровой культуры в реактор с питательной средой для получения производственной расплодки микроорганизмов;

5) выращивание микроорганизмов и контроль за ходом процесса культивирования.

При глубинном выращивании микроорганизмов их культуры могут находиться в периодических и хемостатных (непрерывных) системах.

Периодическая система

Периодической системой культивирования называют систему, в которой после внесения бактерий (засева) в питательную среду не производится ни добавления, ни удаления каких-либо компонентов, кроме газовой фазы.

Отсюда следует, что периодическая система может поддерживать размножение клеток в течение ограниченного времени, на протяжении которого состав питательной среды изменяется от благоприятного (оптимального) для их роста до неблагоприятного, вплоть до полного прекращения процесса размножения.

Рост в такой «закрытой системе» подчиняется определенным закономерностям. Общую закономерность роста и размножения бактериальной популяции принято показывать графически в виде кривой, отражающей зависимость логарифма числа живых клеток от времени культивирования.

Типичная кривая (рис. 2.3.2.) имеет S-обзразную форму и позволяет различать несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности: начальную (или лаг-)фазу, экспоненциальную (или логарифметическую, лог-)фазу, стационарную и фазу отмирания.

Рис. 2.3.2. График фаз роста бактерий

Начальная фаза. Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией (момент посева) и достижением максимальной скорости деления микробов. Продолжительность этой фазы зависит главным образом от предшествующих условий культивирования и возраста инокулята,а так же от степени пригодности питательной среды для роста данного микроба.

Если инокулят взят из старой культуры, то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от таковых предшествующей культуры, приспособление к новым условиям может быть связано с синтезом новых ферментов, которые ранее не были нужны и поэтому не синтезировались.

Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом.

Экспоненциальная фаза, или фаза логарифмического роста характеризируется постоянной максимальной скоростью деления клеток.

Период генерализации (лат. Generatio – рождение, воспроизведение) – это время между двумя последовательными делениями бактерий – в этой стадии будет постоянным для данного вида, а количество бактерий будет увеличиваться в геометрической прогрессии.

Следовательно, после “n” генерации количество клеток в культуре будет равно “2n”. Длительность лог-фазы – обычно 5-6 часов.

Величина клеток и количество содержания в них белка у многих бактерий в лог-фазе то же остаются постоянными и в целом микробная популяция состоит из «стандартных клеток».

Если увеличение биомассы бактерий, включая белки, РНК, липиды и другие макромолекулы, происходит пропорционально увеличение численности бактериальных клеток, то такое состояние определяют понятием «сбалансированный рост».

Поэтому за ростом культуры в стадии «сбалансированного роста» лог-фазы можно следить, пользуясь каким-нибудь одним из этих показателей.

За стадией сбалансированного роста уже в лог-фазе наступает стадия отрицательного ускорения, при которой скорость размножения бактерий перестает быть максимальной.

В результате число делящихся особей – уменьшается, а число погибших – увеличивается. Ее длительность около 2-х часов.

Причина замедления размножения: истощение питательной среды, накопление продуктов метаболизма, увеличение плотности клеточной суспензии и мн.др.

В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста).

Стационарная фаза максимума. В ней число новых живых бактерий почти равно числу отмерших (равновесие). Переход от лог-фазы к стационарной происходит постепенно.

Причины замедления роста нами обозначены при описании стадии отрицательного ускорения (нехватка питательной среды, большая плотность бактериальной популяции, низкое порциальное давление О2, накопление токсических продуктов обмена). Все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе.

Но и в стационарной фазе могут еще происходить такие процессы, как использование запасных веществ, распад части рибосом и синтез ферментов. Наблюдаемая картина зависит от того, какой именно фактор лимитирует рост.

Быстро гибнут лишь очень чувствительные клетки, другие – еще долго сохраняют жизнеспособность – до тех пор, пока еще есть возможность получать необходимую для этого энергию в процессе окисления каких-либо запасных веществ или клеточных белков. Количество биомассы, достигнутое в стационарной фазе, называют выходом или урожаем. Урожай зависит от природы и количества используемых питательных веществ, а так же от условий культивировании.

Фаза отмирания. В этой фазе можно выделить три стадии:

а) стадия ускорения, гибели, характеризующаяся превышением числа отмирающих клеток над количеством вновь образующихся (около 3 часов);

б) стадия логарифметической гибели – отмирание клеток происходит с постоянной скоростью ( 5 часов);

в) стадия уменьшения скорости отмирании, во время которой оставшиеся в живых клетки переходят в стадию покоя.

Одновременно с ростом биомассы одних клеток, происходит увеличение числа клеток в популяции за счет деления других и постоянная утилизация субстратов питательной среды. Такой рост возможен лишь в том случае, если питательная среда сбалансирована по всем компонентам, необходимым бактериальной клетке для роста и размножения.

Следовательно, нелимитированность питательной среды по какому-либо питательному компоненту – одно из основных обязательных условий максимального роста микробной популяции.

Если же питательная среда лимитирована по какому-либо питательному компоненту, то скорость роста замедляется вплоть до полной остановки роста после полной утилизации этого компонента.

Иногда в комплексной питательной среде бактериальные клетки используют имеющиеся субстраты последовательно.

Это происходит тогда, когда присутствие одного субстрата в среде приводит к подавлению синтеза фермента, участвующего в метаболизме других питательных веществ.

В этих условиях «подавляемые» ферменты начинают синтезироваться и осуществлять метаболизм лишь тогда, когда ингибирующий (подавляющий) их субстрат будет израсходован бактериальными клетками.

Такая регуляция физиологии бактерий концентрацией питательных веществ в субстрате приводит к изменениям в скорости роста, а следовательно, и в кривой роста, на которой появляется одна или несколько переходных (т.е.

временных) стационарных фаз.

Преимущества периодических систем:

— малая стоимость аппарата и системы управления;

— гибкость, т. е. возможность наработки в одном биореакторе разных продуктов;

— время культивирования можно произвольно менять;

— процесс менее подвержен инфицированию, мутациям ток вследствие отсутствия протока и притока из-за относительно малого времени ферментации;

— процесс удобен для получения малых количеств продукта;

— условия культивирования можно поддерживать в оптимуме как в фазе роста биомассы, так и в фазе биосинтеза продукта, причем оптимальные условия для биомассы и продукта могут быть различны;

— процесс удобен для реализации биосинтеза вторичных метаболитов.

Недостатки:

— необходимость приготовления посевного материала

— велико непродуктивное время ферментации;

— в связи с частой стерилизацией быстрее изнашиваются измерительные приборы, особенно датчики величины рН.

— производительность по биомассе и продукту часто ниже, чем при непрерывном процессе

Непрерывная система

Проточное (непрерывное) культивирование характеризуется постоянным добавлением в биореактор свежей питательной среды и постоянным отбором либо суспензии (открытое проточное культивирование), либо отработанной среды (закрытое проточное культивирование). В непрерывных процессах биообъект постоянно поддерживается в экспоненциальной фазе роста. Непрерывная культура представляет собой открытую систему, стремящуюся к установлению динамического равновесия.

Для микроорганизмов создаются неизменные условия среды. Проточное культивирование конструктивно более сложно и поддерживается автоматическим регулированием, так как связано с включением в схему биореактора дополнительных устройств перистальтических насосов, разделительных устройств и др.

Принцип непрерывного (проточного) культивирования микробов состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно втекает такой же объем культуры. По такому принципу организуются две разновидности технического процесса непрерывного культивирования: процесс (технология) полного вытеснения и технология полного смещения.

⇐ Предыдущая12345678Следующая ⇒

Рекомендуемые страницы:

Источник: https://lektsia.com/4x9497.html

6 – Глубинное культивирование

Глубинное культивирование микроорганизмов: Глубинный способ культивирования наиболее широко используется в

ГЛУБИННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ

       По сравнению с рассмотренным нами ранее поверхностным  способом культивирования  микроорганизмов  глубинный  способ  культивирования имеет ряд существенных преимуществ: при его  использовании  возможно менять  состав  питательной  среды  в  широком  интервале   значений концентраций различных компонентов, добиваясь при этом максимального выхода  целевого  продукта   с   единицы   объема   ферментационного оборудования, в  технологическом  процессе  значительно  сокращается доля ручного труда (транспортировка питательной среды, загрузка и разгрузка аппарата)  он  требует  меньших  затрат  на  организацию процесса автоматизации различных стадий,  предлагает более простую последующую переработку биомассы микроорганизмов с целью выделения и очистки готового продукта.

     Рассмотрим  принципиальную  технологическую  схему   глубинного культивирования микроорганизмов на рис.1.

     Рис.1  Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов.

     1 – смеситель питательной среды; 2 – колонка для непрерывной стерили     зации потока питательной среды; 3 – теплообменник – выдерживатель;     4 – теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 – инокуляторы (или посевные аппараты); 6 – индивидуальный фильтр для очистки      воздуха; 7 – ферментер; 8,9 – насосы; масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 – компрессор; 12 – головной фильтр для очистки воздуха.

Для  любого  биотехнологического  процесса   существует множество вариантов организации производства на промышленном  уровне. Однако все процессы можно разделить на две большие группы –  периодические и непрерывные.

 При  периодическом  способе  производства простерилизованный  ферментер заполняется  питательной средой,  часто  уже   содержащей   нужные микроорганизмы.   Биохимические   процессы   в    этом    ферментере продолжаются от нескольких часов  до  нескольких  дней. При этом типе культивирования клеточная культура может пройти все фазы своего развития:

 1) Lag-фазу, или фазу задержанного роста, при которой клетки растут медленно и адаптируются к новой среде обитания в объеме ферментера;

2)   фазу ускорения – когда адаптация закончилась и клетки начинают интенсивно делиться

3) Log-фазу, характеризующаяся интенсивным делением клеток и сбалансированностью роста всей популяции;

4) фазу замедленного роста, связанную с исчерпанием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболизма;

 5) Const– фазу или стационарную фазу, при которой прирост новых клеток количественно равняется числу погибающих;

6) фазу отмирания, характеризующуюся прогрессирующей гибелью клеток.

Синтез первичных метаболитов наиболее интенсивно идет с середины  Log-фазы до середины стационарной. Ближе к концу стационарной фазы может начаться синтез вторичных метаболитов.

 Периодически ферментер опорожняют, моют, стерилизуют, целевой продукт отправляют на очистку, и начинают  новый  цикл.

Системы, функционирующие в таких условиях, характеризуются как batch-системы (замкнутые системы). Большинство современных биотехнологических систем функционируют как batch-процессы, при которых однажды оптимизированные условия обеспечивают максимальное накопление целевого (требуемого) продукта.

 При непрерывном  способе  подача равных объемов сырья (питательных веществ)  и   отвод   культуральной жидкости, содержащей клетки продуцента и целевой продукт  осуществляется одновременно. Такие ферментационные системы характеризуются как открытые.

Через некоторое время после начала процесса в таком ферментере устанавливается динамическое равновесие между процессами размножения клеток с одной стороны и процессами отмирания и вымывания живых клеток их аппарата с другой.

В результате концентрация клеток устанавливается на определенном уровне, задаваемом технологическим режимом (скоростью протока, количеством питательных веществ, температурой). Теоретически такая сonst-фаза, при неизменных параметрах процесса культивирования  может поддерживаться бесконечно долго.

Ферментер, работающий в таком режиме, значительно более прост в управлении, по сравнению с аналогичным, работающим в периодическом режиме. Это обусловлено тем, что при постоянстве концентрации клеток продуцента постоянными являются и все их потребности (питательные вещества, воздух) и параметры процесса (тепловыделение, уровень рН, выделение целевого продукта).

Принцип непрерывного проточного культивирования  похож на непрерывные процессы в химической технологии и подобно им  может реализовываться по двум основным схемам:

1.     процесс идеального (полного) вытеснения;

2.     процесс идеального (полного) смешения;

         Реактор для  выращивания  микроорганизмов  в  процессе  полного вытеснения в общем  виде  представляет  собой  трубу,  расположенную вертикально или горизонтально. При этом в один конец медленно втекает среда и посевной  материал (микроорганизмы),  а  из  другого  конца  вытекает   культуральная жидкость.

  При  этом из-за примерно одинаковой скорости движения и отсутствия завихрений  перемешивания  слоев  жидкости   в   реакторе   не происходит (ламинарный режим).

Уменьшение концентрации питательных веществ и накопление продуктов биосинтеза, а так – же клеточной биомассы происходит в таком реакторе не только во времени, но и в пространстве (от начала реактора к концу).    В   таком   режиме    обычно    проводят    анаэробное культивирование.

   Процесс   полного   вытеснения   применяется    в крупнотоннажных производствах в тех случаях,  когда  желательно  избежать  потери времени на опорожнение, стерилизацию и заполнение емкости (производство пива).

         В  процессе  полного  смешения  рост  культур   микроорганизмов происходит в реакторе-ферментере при интенсивном перемешивании культуральной среды с помощью мешалок (турбулентный режим).

  При этом в любой  точке  ферментера  все  параметры  среды  должны  быть примерно  одинаковы. Изменение всех параметров культивирования происходит только во времени.

  Этот  метод  культивирования,  называемый  еще гомогенно-непрерывным, наиболее  широко  применяется  в аэробных процессах, как периодических, так и непрерывных.

Выбор между  периодическим  и  непрерывными  способами  зависит прежде всего от экономических причин,  а  так  же  от  специфичности условий производства тех или иных веществ.

Непрерывные процессы, как правило, лучше  приспособлены  для  крупномасштабного  производства, из-за постоянства концентрации клеток в них легче поддерживать во времени параметры процесса (температуру, рН, уровень аэрирования), однако  до  настоящего  времени  большая  часть  микробиологических продуктов производится  периодическим  способом.

  Причинами  этого  в основном являются малотоннажность и широкий ассортимент производимых продуктов, а также  особенности  культивирования  тех  или  иных  их продуцентов, что не позволяет унифицировать как ферментеры, так и их технологическую оснастку. Все это вместе часто  делает  экономически невыгодным внедрение непрерывных технологий.

Однако в таких областях, как  крупномасштабное   производство   растворителей,   промышленных ферментов,  кормового  белка  и   кормовых   добавок   (аминокислот, витаминов и др.), биологической  очистке  сточных  вод,  непрерывные способы прочно заняли главенствующее положение.

В последнее время  все чаще начинают использовать методы, занимающие промежуточное положение между непрерывным и периодическим культивированием (полунепрерывное культивирование):

1.периодическое культивирование с подпиткой, при котором, помимо первичного внесения питательного субстрата до засева культуры, в процессе культивирования в аппарат через определенные интервалы добавляют небольшие объемы питательных веществ либо порциями, либо непрерывно «по каплям».

2. полунепрерывный  отъемно-доливной метод, когда в течении всего процесса периодического культивирования часть одержимого   биореактора периодически изымается и добавляется равное количество свежей питательной среды.

Такой прием обеспечивает регулярное «омолаживание» (обновление) культуры и в 2-3 раза задерживает (отдаляет) ее переход в фазу  отмирания.

 Недостаток состоит в том, что доливы осуществляют питательной средой полного состава, что неприемлемо для синтеза вторичных метаболитов.

3.Этого недостатка лишен метод полунепрерывной регулируемой ферментации.

Суть этого метода состоит в том, что в определен время, начиная с логарифмической фазы размножения, по специально разработанной программе, в культуральную жидкость, добавляют отдельные компоненты питательной среды (сначала раствор сахаров,  потом аммония сульфат и другие микроэлементы, а так же те или иные вещества предшественники), поддерживая их концентрацию на постоянном благоприятном уровне – вначале для роста массы клеток, а затем – для синтеза целевого продукта (вторичного метаболита). Периодически из ферментатора отбирают пробы культуральной жидкости и определяют концентрацию сначала клеток, а потом и  целевого продукта.  Ферментацию прекращают после того как она достигает максимума. Этим способом удается не только продлить активную фазу, в которой находится продуцент, но и повысить степень использования им субстрата, а в конечном итоге – продуктивность процесса, то есть увеличить выход конечного продукта в расчете на потребленный субстрат.

         4. Если целевой продукт является эндометаболитом, т.е. находится внутри клетки, то для получения более плотной клеточной культуры проводят периодическое культивирование в режимедиализа.

При этом питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану и через нее же отводится часть культуральной жидкости без клеток. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность.

Этот метод не нужно путать с непрерывным проточным культивированием.

     Метод  проточного   непрерывного   культивирования   пришел   в микробиологию   из   химической   технологии.

   Принцип   проточного культивирования  состоит  в  том,  что  в  сосуд,  где  размножаются микроорганизмы,  непрерывно  подается  свежая  питательная  среда  и одновременно вытекает такой  же  объем  культуральной  жидкости, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности.

Основным принципом непрерывных процессов (как уже отмечалось выше) является точное соблюдение равновесия между приростом биомассы вследствие деления клеток и их убылью в результате разбавления содержимого свежей питательной средой.

В зависимости от того, на каком принципе основано поддержание постоянства концентрации клеток различают турбидостатический и хемостатический режимы непрерывного культивирования.

При турбидостатическом режиме культивирования постояннство  концентрации клеток обеспечивается управляемым изменением скорости протока жидкости через аппарат за счет подачи больших или меньших объемов питательной среды.

Наиболее распространенным методом определения концентрации клеток в культуральной жидкости является измерение светорассеивания (мутности) выходящего из ферментера потока с помощью прибора-нефелометра, измеряющего мутность жидкости по величине светорассеяния.

Сам прибор посредством электрической схемы связан с насосом для подачи питательной среды или вентилем (краном), регулирующим эту подачу.

 Повышение концентрации клеток в культуральной жидкости, приводит к увеличению светорассеяния,  что автоматически вызывает увеличение объема подаваемой в аппарат свежей питательной среды, и что, в свою очередь, приводит к вымыванию избыточных клеток. Наоборот, при уменьшении светорассеяния (снижении концентрации клеток) скорость протока жидкости через аппарат уменьшается и соответственно уменьшается процесс их вымывания из ферментера.

 Недостатком турбидостатического режима является то, что в этом режиме невозможно достигнуть полного усвоения питательных веществ и при выделении целевого продукта они могут безвозвратно теряться или загрязнять его, усложняя процесс очистки.

При длительном культивировании в турбидостате возникает довольно серьезная проблема, связанная с прилипанием клеток к фотоэлементу и искажения его показаний. Однако имеются и определенные преимущества.

Так, например, если засевается смешанная культура, то в турбидостате автоматически отбирается более быстро растущий вид, что может использоваться для предохранения его от заражения посторонней микрофлорой (если, конечно, она растет медленнее) и селекции определенных форм.

             При хемостатическом режиме поддержание постоянства концентрации культуры  продуцента осуществляется за счет регулирования не выходящего,  а  входящего  потока.

  Сущность регулирования состоит в том, что концентрацию основного питательного  вещества (или одного из основных),  поступающего  в реактор  устанавливают  на  определенном   уровне, который ограничивает (лимитирует) степень размножения микроорганизмов, поддерживая тем самым культуру микроорганизма в определенной нужной концентрации. Такой метод  регулирования называется хемостатическим, а реактор – хемостатом.

   Хемостаты применяются в процессах, характеризующихся малой скоростью протока жидкости и низкой концентрацией питательных веществ, что облегчает саморегулировку системы. Недостатком хемостатического метода регулирования  является  то, что в этом случае обычно не удается получить продукты  в  достаточно высокой концентрации и добиться полной утилизации питательных веществ.

Особенно неэффективными являются такие реакторы при получении различных вторичных метаболитов,  таких  как  антибиотики.

Это связано с  тем,  что  процесс  получения  вторичных  метаболитов состоит из двух стадий, и оптимальные условия  для  той  или  другой стадии могу существенно  различаться  между  собой.

  Одноступенчатый хемостат в лучшем случае может  обеспечить  только  компромис  между разными условиями, оптимальными  для  этих  двух  условий.  Условия, более благоприятные для каждой стадии жизненного цикла можно создать при использовании двух-  или  более  ступенчатого  хемостата.

Однако такой установкой весьма сложно управлять и она требует больших капиталовложений. В настоящее время одноступенчатый  и  многоступенчатые хемостаты  нашли  применение  в  основном  в   различных   процессах утилизации отходов и очистки сточных вод.

Еще одним недостатком непрерывного метода  является то, что в таких аппаратах невозможно или очень трудно и неудобно использовать неразмножающиеся клетки, споры или чистые ферменты.

Вымываемые из ферментера клетки или ферменты практически невозможно регенерировать (отделить, промыть, вернуть в аппарат) без потери активности и с сохранением асептики. Аналогичные проблемы имеют место и при периодическом культивировании.

Это  является  весьма  невыгодным  с экономической точки зрения,  учитывая  высокую  стоимость  чистых ферментных препаратов и  штаммов микроорганизмов, а так же сложность подготовки и запуска процесса.

         Эффективным способом решения этой проблемы является использование так называемых иммобилизованных биокатализаторов (клеток или ферментов). Процесс иммобилизации заключается в (закреплении) молекул фермента или целых живых клеток на (или в) специальных носителях или насадках значительно большего (на много порядков) размера.

При этом биокатализатор из фактически гомогенного становится гетерогенным.  Существует целый ряд методов иммобилизации, основанных на механическом,  физико-химическом и химическом закреплении ферментов  и  клеток  на  носителях природного или искусственного происхождения.

После  окончания  процесса  такой  катализатор  легко  отделить фильтрованием от культуральной жидкости,  очистить,  а  иногда  даже  регенерировать.

Такие катализаторы обычно имеют большой срок действия, по  сравнению с неиммобилизованными, удобны в обращении, но  имеют  гораздо  более высокую стоимость и требуют использования специально сконструированных для их использования ферментеров, что препятствует их широкому использованию. (Более подробно об иммобилизованных биокатализаторах и специальных конструкциях ферментеров см. методичку “Инженерная энзимология”.

Источник: https://studizba.com/lectures/2-biologicheskie-discipliny/137-osnovy-tehnologii-processy-i-apparaty-biotehnologicheskih-proizvodstv/1890-6-glubinnoe-kultivirovanie.html

Основных метода культивирования микроорганизмов

Глубинное культивирование микроорганизмов: Глубинный способ культивирования наиболее широко используется в

Ку льтивирование микроорганизмов можно поводить поверхностным или глубинным, периодическим или непрерывным методами, в аэробных или анаэробных условиях.

Большое значение при выборе способа культивирования имеет отношение выбранного для культивирования микроорганизма к молекулярному кислороду и конечная цель культивирования: накопление биомассы или получение определенного метаболита (спирта, кислорода, фермента и т.д.).

При культивировании поверхностнымспособоммикроорганизмы выращивают на поверхности плотной, сыпучей среды или в тонком слое жидкой среды, при этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. В жидких средах аэробные микроорганизмы часто растут, образуя на поверхности пленку.

Факультативные анаэробы развиваются не только на поверхности, но и в толще жидкой среды, вызывая более или менее равномерное ее помутнение. На сыпучих средах поверхностным методом получают ферментные препараты.

Поверхностное культивирование микроорганизмов применяется как в лабораторных условиях, так и в промышленности

Все способы культивирования аэробных микроорганизмов сводятся к увеличению поверхности соприкосновения питательной среды с кислородом воздуха. При глубинном культивировании в жидких средах микроорганизмы используют растворенный кислород.

Вместе с тем растворимость кислорода в воде невелика, поэтому, чтобы обеспечить рост аэробных микроорганизмов в толще среды, ее необходимо постоянно аэрировать (подводить кислород в глубь жидкой среды).

Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью.

Наиболее широко распространенный в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на качалках, обеспечивающих встряхивание или вращение колб или пробирок, обеспечивая большее соприкосновение среды с воздухом и насыщение ее кислородом.

Аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием (барботированием) через толщу среды стерильного воздуха.

Этот способ используется в лабораторных исследованиях, но особенно широкое применение он нашел в промышленной микробиологии при получении биомассы, в производстве антибиотиков, ферментов, кислот.

Преимущества глубинного культивирования заключаются в том, что этот способ не требует больших площадей и громоздкого оборудования, объем ферментаторов можно увеличить за счет увеличения высоты, простота обслуживания, возможность автоматизации, удобство выделения целевого продукта из культуральной жидкости.

Глубинное культивирование микроорганизмов может быть периодическим и непрерывным.

При периодическом методе культивирования весь объем питательной среды засевают чистой культурой, и выращивание ведут в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта.

Поскольку культивирование ведется на невозобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), клетки все время находятся в меняющихся условиях.

Сначала они имеют в избытке все питательные вещества, затем постепенно наступает недостаток питания и отравление вредными продуктами обмена. В связи с этим культура в своем развитии проходит четыре фазы роста и размножения, в течение которых изменяются размеры клеток, скорость размножения, морфологические и физиологические свойства (рис. 3.1).

Первая стадия – лаг-фаза, или фаза задержки роста, следует непосредственно за внесением посевного материала в питательную среду.

В этой фазе микроорганизмы не размножаются, а приспосабливаются к среде, происходит повышение содержания нуклеиновых кислот, увеличение размера.

Эта стадия является подготовкой к дальнейшему интенсивному синтезу белка клеткой, т.е. ее росту и размножению.

Вторая стадия – фаза логарифмического роста(экспоненциальная) характеризуется высокой скоростью размножения клеток, так как в среде много питательных веществ и мало вредных продуктов обмена.

Время, необходимое для удвоения числа клеток, называется продолжительностью генерации.

В благоприятных условиях клетки бактерий делятся каждые 20-30 мин, их число увеличивается в геометрической прогрессии (1, 2, 4, 8, 16 и т.д.).

Третья стадия – стационарная (фаза зрелости), когда размножение микроорганизмов замедляется, и скорости размножения и отмирания уравновешиваются, в результате чего число клеток остается постоянным.

Четвертая стадия – фаза отмирания, когда начинается гибель клеток и их количество снижается за счет отмирания и автолиза (самопереваривания).

Периодическое культивирование осуществляется во многих производствах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Недостатком периодического культивирования являются нерациональные затраты времени на прохождение всех четырех стадий развития культуры, причем период самой активной жизнедеятельности – фаза логарифмического роста – занимает небольшую часть производственного цикла.

В течение последних тридцати лет все большее значение приобретает более прогрессивный метод непрерывного культивирования микроорганизмов, который состоит в том, что культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает свежая питательная среда и с такой же скоростью отводиться культуральная жидкость. Посевной материал выращивается до стадии логарифмического роста и вносится в питательную среду. Длительность периода логарифмического роста зависит от количества питательных веществ в среде, а также от количества вредных продуктов обмена, выделяемых клеткой.

При большой скорости притока среда быстро обновляется, питательные вещества не успевают накопиться и культура поддерживается сколь угодно долго в активном состоянии, не достигая стадии отмирания. Несмотря на значительное аппаратное усложнение технологического процесса, метод непрерывного культивирования имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим способом.

В последние годы активно разрабатывается и применяется метод непрерывного культивирования клеток микроорганизмов в иммобилизованном(прикрепленном) состоянии – на пленках, гранулах, волокнах специально подобранных синтетических полимерных материалов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов функционируют многократно и в течение длительного времени сохраняют высокую биохимическую активность.

Непрерывное культивирование очень перспективно и широко используется в пищевой и микробиологической промышленности и создает возможность автоматического поддержания заданных оптимальных условий, благодаря чему обеспечивается стандартность готового продукта при наименьших затратах.

76. Чем интересен объемно-доливной метод культивирования.

Когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалент­ною объема среды. Это приводит к регулярному омолаживанию культуры и к за­держке ее перехода к фазе отмирания.

77. Чем интересен подпитки метод культивирования.

По­мимо внесения питательного субстрата в реактор до введения в него биообъекта, в процессе культивирования в аппарат добавляют питательные вещества через определенные промежутки времени порциями или непрерывно «по каплям». Иногда дополнительно вносят биообъект.

78. Чем интересен диализный метод культивирования.

Питательный субстрат постоянно поступает в реактор через специальную мембрану. Диализ ведет к снижению концентрации продуктов жизнедеятельности клеток, неблагоприятно влияющих на их жизнеспособность.

79. Как функционирует ферментер полного вытеснения

Открытая система полного вытеснения отличается от системы идеального смешения тем, что культура в ней не перемешивается, а представляет собой поток жидкости через трубку. Наиболее распространенным аппаратом для культивирования в данном случае является трубчатый ферментер. Этот принцип может использоваться на стадии брожения при производстве пива.

80. как функционирует ферментер полного смещения.

К ним относятся турбостаты, рН-статы. Культура в ней перемешивается.

81. Чем регулируются хемостаты и турбидостаты.

Хемостат- поступление питательной среды регулируется плотностью клеток.онтролируется напрямую: задается скорость потока и к ней подстраивается концентрация биомассы.

Турбидостат – регулируется плотностью клеток.контролируется по принципу обратной связи: скорость потока зависит от требуемой концентрации биомассы клеток на выходе.

82. Кривая роста популяции при переодическом культивирование с указанием фаз роста.

а) лаг-фазу– сравнительно медленный рост внесенной культуры, осваивающей новую среду обитания в объ­еме биореактора; б) экспоненциальную фазу– бурное деление клеток, сбалан­сированный рост культуры; в) фазу замедленного роста,связанного с исчерпа­нием питательных субстратов и накоплением токсических продуктов метаболиз­ма; г) стационарную фазу– прирост клеток равен их убыли; д) фазу отмирания– постепенное снижение числа жизнеспособных клеток.

83. Как на производстве сокращают лаг-фазу.

Лаг-фаза сокращается ( или может совсем отсутствовать), если активные молодые клетки из экспоненциальной фазы роста перенести в свежую среду того же состава и той же температуры.

84. Чем отличается время генерации и время удвоения биомассы.

Время генерации – период удвоения клеток.

Время удвоения – период необходимая для удвоения биомассы.

Пример: для растений: время генерации-20-70 часов

Время удвоения – 1-2 недели

85. Формула абсолютной скорости роста.

Прирост числа клеток за определенный промежуток времени.

V=dx/dt

86. Удельная скорость роста (две формулы).

µ- удельная скорость роста(прирост клетки за час)

µ=V/x исход= dx/dt * 1/x

µ=2,3(lg X – lgXo)/t1-t2

87. Классификация непрерывных систем культивирования.

Открытые

А) гомогенно-непрерывные

одноступенчетые

– многоступенчетые

а) простые

б) сложные

Б) гетерогенно – непрерывные

– трубчатые

– противоточные

2) замкнутые(механическое определение клеток)

А) 100% рецикуляция

Б) рост в интерфазе

88. В каких системах устанавливается равновесно подвижное состояние. (Точно в каких системах не нашла, только равенство)

µ= dx/dt*1/x или dx/dt = µ*b условие непрерывного культивирования мгновенный прирост биомассы компенсируется уносом биомассы со средой (Dх ) т.е µx –Dx=0 или (µ-D)*x=0, откуда D=µ, это равенство основное условие поддержания равновесия.

89.Как функционирую трубчатые ферментеры.

Трубчатый ферментер (газлифтный) состоит из реактора кожухотрубчатого типа, через который жидкость потоком воздуха перемещается в верхнюю часть аппарата и, попадая в сепаратор, возвращается в реактор, где снова увлекается воздухом, подвергаясь таким образом циркуляции.

90. Как функционирует противоточные ферментеры.

Барботажные ферментеры. Подача воздуха в них осуществляется через борбатажные устройства, которые расположены в нижней части а

Источник: https://megaobuchalka.ru/7/7671.html

Medic-studio
Добавить комментарий