Иммунный блоттинг.: В настоящее время для подтверждения специфичности первично­го

Иммуноблоттинг (выявление антител в сыворотках больных к определенным антигенам возбудителя)

Иммунный блоттинг.: В настоящее время для подтверждения специфичности первично­го

Иммуноблоттинг (иммуноблот) – высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в т.ч. при помощи РИГА или ИФА. Иммуноблоттинг – разновидность гетерогенного иммунного анализа.

Этот метод выявления антител к отдельным антигенам возбудителя основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые в виде отдельных полос нанесены специфические белки, разделенные гель-электрофорезом.

Если имеются антитела против определенных антигенов -появляется темная линия в соответствующем локусе стрипа. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов.

Материалом для исследования является сыворотка или плазма крови человека. Для исследования на одном стрипе необходимо 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки.

ООО “Лабораторная диагностика” использует иммуноблоттинговые наборы для выявления антител к возбудителям различных заболеваний фирмы “EUROIMMUN” (Германия), “MIKROGEN” (Германия):

ВПГ1 и ВПГ2 IgM/IgG(герпесвирусная инфекция)

ЦМВ IgM/IgG(цитомегаловирусная инфекция)

Краснуха IgG

TORCH-профиль IgM(Токсоплазмоз, Краснуха, Цитомегаловирус, ВПГ 1 и ВПГ 2)

ВЭБ IgMTIgG(вирусная инфекция Эпштейна-Барра)

ВГС IgG(вирусный гепатит С)

Используют наборы двух типов – вестерн-блот и лайн-блот.

Вестерн-блот:Наборы содержат тестовые стрипы-мембраны с электрофоретически разделенными нативными антигенами соответствующих инфекционных агентов, т.о. антигены располагаются в порядке молекулярной массы .

На мембраны могут быть также нанесены 1-2 дополнительные линии с клинически значимыми антигенами (вестерн-лайн блот). Это надежный подтверждающий метод, исключает ложноположительные ответы и перекрестные реакции.

Лайн-блот:В этом случае на тестовые стрип-мембраны нанесены только клинически значимые антигены (нативные, синтетические или рекомбинантные) в определенном порядке. Такой подход используется при дифференциальной диагностике нескольких инфекций на одном стрипе .

Сущность его заключается в переносе молекул исследуемого вещества с одного твердого носителя, используемого для фракционирования биополимеров, на другой, где с помощью иммунохимической реакции происходит их специфическое выявление. Современный высокочувствительный метод заключается в идентификации белков, в том числе вирусных антигенов.

Метод основан на комбинации гель-электрофореза и реакции антиген-антитело. Высокая степень разрешения достигается за счет электрофоретического разделения белков, глико- и липопротеинов и максимальной специфичностью детектирующих иммунных сывороток или моноклональных антител.

В оптимально отработанных условиях иммуноблотингом можно обнаруживать антиген в количествах менее 1 нг в испытуемом объеме. Технически иммуноблотинг выполняется в три приема:

1) подлежащие анализу белки подвергаются разделению в полиакриламидном геле в присутствии денатурирующих веществ: додецилсульфата натрия или мочевины, этот процесс часто обозначают как SDS-PAGE; разделенные белки могут визуализироваться после окрашивания и сравниваться с эталонными образцами;

2) разделенные белки переносятся с геля путем наложения (блотинга) на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируются на нем; во многих случаях, но

не всегда, при переносе сохраняются количественные соотношения белков;

3) на фильтры наносятся детектирующие поли- или моноклональные антитела, содержащие радиоизотопную или ферментную метку; для обнаружения связавшихся антител применяют также антивидовую меченую сыворотку, иными словами, на заключительном этане блотинг

аналогичен твердофазным иммунологическим тестам.

Следует иметь в виду, что в данной постановке иммуноблотинга белки находятся в денатурированном состоянии, и поэтому могут не распознаваться антителами, специфическими по отношению к нативному белку, но зато при наличии сывороток ко всем составляющим пептидам одновременно выявляется весь антигенный спектр испытуемого белка.

Иммуноблотинг достаточно широко используется в исследованиях строения вирусов гепатитов, в частности, для установления антигенного родства между отдельными штаммами.

Высокая разрешающая способность иммуноблотинга позволяет получать хорошие результаты и в диагностической практике, когда требуется идентифицировать вирус в тканях или экскретах больного.

В зависимости от исследуемого вещества различают ДНК,— РНК и белок — блоттинг.

Иммунохимическое выявление антигенов можно проводить с помощью антител, конъюгированных с меткой. В качестве метки в последнее время широко применяют либо радиоактивные изотопы, либо ферменты (пероксидазу, щелочную фосфатазу, лактамазу и др.).

Время блоттинга путем диффузии составляет 36—48 ч. Но наиболее быстрый и эффективный способ переноса белков с гелей — электроблот, время которого, в основном, составляет 1—3 ч , для некоторых высокомолекулярных белков— более 12 ч.

Конкретный выбор сорбентов для различных модификаций блотов (нитроцеллюлоза либо бумага, обработанная соответствующим образом), выбор условий блокирования и иммуно-химического выявления антигенов полностью зависит от антигена, его количества, метода иммуноанализа и целей исследования.

Возможность обнаружить антитела к конкретным антигенам возбудителя позволяет оценить значимость этих антител (специфичность для данного этиологического агента), исключить реакцию на перекрестные антигены.

Это и отличает иммуноблоттинг от ИФА, где в качестве антигена могут быть использованы различные комбинации антигенных детерминант – как специфичные, так и нет, дающих перекрестные реакции с другими возбудителями.

В другом случае, при получении положительного результата в ИФА можно только предполагать, что он является следствием перекрестного реагирования, а в случае иммуноблоттинга это доказательно

Метод ИБ по целому ряду обстоятельств получил наибольшее распространение как метод, пригодный для использования в качестве теста подтверждения.

Безусловное достоинство метода — возможность тестирования антител к слабо или вовсе нерастворимым антигенам и исключение стадии введения радиоактивной метки в антигены.

О чувствительности в случае ИБ судят по предельному количеству нанесенного на гель антигена, которое при фракционировании белков удается выявить иммунохимически после переноса с геля на твердую фазу (нитроцеллюлозу).

Общая чувствительность анализа зависит от целого ряда причин: условий фракционирования и иммобилизации антигена на твердом носителе, уровня фона, специфичности и аффинности антител.

Важное значение имеет вид используемой метки и способ ее выявления.

Таким образом, метод иммуноблотинга позволяет идентифицировать зоны антигена на твердой фазе, не связывая весь белок с антителами специфической сыворотки.

Иммуноблотинг и его модификации в основном используются для типирования бактериальных и вирусных антигенов и антител, особенно в случае недостаточной разрешающей способности обычных систем, а также при анализе иммуноглобулинов, нуклеиновых кислот или как тест подтверждения в сочетании с другими методами.

Большие трудности интерпретации результатов перекресных при реакциях и в случаях начальных стадий сероконверсии.

В первой ситуации при повторном исследовании через промежуток определенный времени антитела не выявляются, а во в втором иммуноблоте появляются новые полосы, свидетельствующие о антител появлении к протеинам или гликопротеидам ВИЧ, характеризуя ответной динамику иммунной реакции на антигены вируса.

Является фактически конечным верификационным методом в цепи серологических исследований, позволяющих сделать окончательное заключение о ВИЧ-позитивности пациента или же отвергнуть таковую.

Для постановки ИБ используют нитроцеллюлозные полоски, на которые методом горизонтального и затем вертикального иммунофореза заранее перенесены белки ВИЧ в порядке нарастания их молекулярных масс. Антитела испытываемых сывороток взаимодействуют с белками определенных зонах полоски.

Дальнейший ход реакции не отличается от такового для ИФА, то есть предусматривает обработку полоски (стрипа) конъюгатом и хромоген-субстратом с отмыванием не связавшихся компонентов и прекращением реакции дистиллированной водой.

Предварительное электрофоретическое разделение белков и их фиксация на нитроцеллюлозе позволяет идентифицировать антитела к конкретным белкам в соответствии с наличием (или отсутствием) окрашивания (серовато-голубого) соответствующих зон полоски. Иммуноблотинг не может использоваться для массового скрининг исследования вследствие высокой стоимости и является методом индивидуального арбитража на заключительном этапе серологического исследования.

Существует достаточно четкие корреляции между результатами исследования сывороток в ИБ и ИФА. Дважды положительные в ИФА (в разных тест-системах) сыворотки интерпретируются затем в ИБ как ВИЧ-позитивные в 97-98% случаев.

Сыворотки, положительные в ИФА лишь в одной из двух использованных тест-системах, оказываются ВИЧ-позитивными в ИБ не чаще, чем в 4% случаев.

При проведении подтверждающих исследований около 5% ИБ могут давать так называемые “неопределенные” результаты, которым, как правило, соответствуют положительные ИФА, но не РИП.

Примерно в 20% случаев “неопределенные” ИБ вызывают антитела к gag- белкам ВИЧ-1 (р55, р25, р18). [3] При получении сомнительных результатов иммуноблотинга необходимо исследование повторить через 3 месяца и при сохранении неопределённости результата – через 6 месяцев.

Радио-иммунный метод (РИМ)(Радиоиммунологический анализ, РИА) Радиоиммунный анализ – метод количественного определения биологически активных веществ, (гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и др.

) в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами. Последними чаще всего являются специфические антитела.

В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют in vitro. Для Р. а.

выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества.

Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты.

Метод отличается высокой чувствительностью, его можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

С помощью коммерческого набора фирмы “ЭББОТТ” — Австрия II-I 125 удается выявлять HBsAg в концентрациях до 0, 1 нг/мл.

К преимуществам метода можно отнести возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении.

Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

Диагностические наборы для выявления различных антигенов вирусов гепатитов А, В и D и антител к ним выпускаются фирмой “Изотоп” (Ташкент) и некоторыми зарубежными фирмами (например, фирмой “ЭББОТТ”). В качестве твердой фазы применяются полистироловые шарики (“ЭББОТТ”) или пробирки (“Изотоп”).

Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп I 125, который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность. Измерение радиоактивной метки, т. е. излучения, проводится на специальных счетчиках — радиоспектрометрах.

Подсчет радиоактивных импульсов как в контрольных, так и исследуемых образцах проводится в единое фиксированное время, обычно в течение 1 минуты. При анализе результатов реакции необходимо учитывать наличие фона радиоактивности, который может влиять на конечный результат реакции.

Причинами повышенного фона могут быть: загрязнение контейнера или гнезда для пробы; неправильная настройка прибора; наличие источника сильного излучения вблизи прибора.

Для подтверждения положительного результата, полученного при первичном скрининге образцов, рекомендуется повторное исследование РИА или в альтернативном тесте. При обнаружении HBsAg необходимо проводить конфирмационный тест.

Таблица 1.Классификация вакцин

Живые Убитые Синтетические Анатоксины
Содержат
Получены путем
Применяются для
Примеры

Список литературы:

Обязательная:

1. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А.,Сидорович И.Г. Иммунология:Учебник.—М.:Медицина,2000.— 432 с : ил.(Учеб. лит. для студ. медвузов).

2. Ковальчук Л.В и др. Иммунология: практикум: учеб. пособие – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012. – 176 с.

3. Поздеев О.К. Медицинская микробиология / под ред. акад. РАМН В.И. Покровского – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2001. – 768 с.

4. Борисов Л.Б. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М. 1997 г.

Дополнительная:

1. Генкель П.А., Микробиология с основами вирусологии. М.,1974 г.

2. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учебник для мед. вузов.- 3-е издание, испр. и доп. – СПб, СпецЛит. 2002. – 591 с.

3. Борисов Л.Б., Смирнова А.М., Медицинская микробиология, вирусология, иммунология, М., Медицина. 1994 г.

4. Тимаков В.Д., Левашов В.С., Борисов Л.Б. Микробиология. М. 1983 г.

Тема №8: КОЛЛОКВИУМ «ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ»

ВОПРОСЫ К КОЛЛОКВИУМУ №1

1. Предмет и задачи иммунологии. История развития иммунологии.

2. Инструктивные и конструктивные теории иммунитета.

3. Оснащение и режим работы иммунологической лаборатории

4. Основные подходы к стандартизации лабораторного иммунологического обследования

5. Объекты исследования в иммунологии (инбредные животные, биологические материалы для исследований, особенности работы с иммунокомпетентными клетками).

6. Иммунологические методы, применяемые в эксперементальных и клинических исследованиях.

7. Понятие об инфекции. Условия возникновения инфекционного процесса. Инфекционная болезнь. Стадии развития. Типы инфекционных заболеваний и их отличительные черты.

8. Роль внешней среды в процессах инфекции и иммунитета. Роль состояния макроорганизма в возникновении инфекции и развитии иммунитета.

9. Патогенность и вирулентность бактерий, единицы измерения. Патогенные, условно-патогенные и непатогенные микроорганизмы.

10. Морфологические и биохимические аспекты вирулентности. Токсины бактерий, их природа и свойства. Анатоксины. Получение, титрование, применение.

11. Принципы специфической профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Вакцины, определение, классификация, применение. Вакцинопрофилактика и вакцинотерапия.

12. Неспецифические факторы зашиты организма. Фагоцитоз. Показатели фагоцитоза.

13. Комплемент, его структура, функции, пути активации, роль в иммунитете.

14. Интерфероны, их характеристика. Способы получения и применение.

15. Антигены. Определение. Понятие о полноценных и неполноценных антигенах. Требования, предъявляемые к антигенам. Понятие об антигенных свойствах микроорганизмов. Антигенная структура бактерий.

16. Серотипирование. Получение, титрование и применение агглютинирующих сывороток. Получение и применение монорецепторных сывороток.

17. Филогенез и онтогенез иммунной системы. Особенности иммунологической реактивности детского возраста.

18. Понятие об иммунитете. Общебиологическое значение иммунитета. Виды иммунитета.

19. Иммуноглобулины, структура и функция. Механизм взаимодействия антитела и антигена.

20. Специфичность антител. Их классификация по методу специфичности. Полные и неполные антитела.

21. Моноклональные антитела. Получение, применение

22. Структура и функция иммунной системы.

23. Кооперация иммунокомпетентных клеток в иммунном ответе. Иммунный ответ, его типы. Иммунокомпетентные клетки (Т – и В – лимфоциты, макрофаги), их кооперация в иммунном ответе.

24. Антителогенез. Первичный и вторичный иммунный ответ. Клонально-селекционная теория Бернета.

25. Иммунологическая память.

26. Иммунологическая толерантность.

27. Серодиагностика инфекционных заболеваний. Принципы и критерии.

28. Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение.

29. Реакция преципитации. Механизм, компоненты. Способы постановки. Применение.

30. Нагрузочные серологические реакции. Реакция непрямой гемагглютинации. Компоненты. Применение.

31. РСК. Реакции иммунного лизиса (гемолиз, бактериолиз).

32. РИФ. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение.

33. ИФА. Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг, механизм, компоненты, применение.

34. Реакция нейтрализации токсина антитоксином. Механизм. Способы постановки, применение.

35. Антитоксический иммунитет, активный и пассивный. Антимикробные и антитоксические сыворотки. Получение, титрование, применение.

36. Понятие об аллергии. Типы аллергических реакций, Аллергены.

37. Гиперчувствительность немедленного типа. Механизм реакции. Атопия. Анафилаксия.

38. Гиперчувствительность замедленного типа. Механизм реакции. Кожные аллергические пробы.

39. Трансплантационный иммунитет. Антигены гистосовместимости и их значение. Методы подавления трансплантационного иммунитета.

40. Серопрофилактика, серотерапия. Осложнения, их предупреждения. Анафилактический шок. Сывороточная болезнь.

41. Т-зависимая гиперчувствительность замедленного типа. Значение в патогенезе и диагностике инфекционных заболеваний. Аллергические пробы, их сущность, применение.

42. Особенности противоопухолевого иммунитета.

43. Особенности противовирусного иммунитета.

44. Особенности антибактериального иммунитета.

45. Особенности противоглистного иммунитета.

46. Особенности антипротозойного иммунитета.

47. Вирусная гемагглютинация и её торможение. Практическое применение. Методические подходы к серодиагностике вирусных инфекций.

48. Особенности биологического метода диагностики инфекционных заболеваний

49. Серологические методы лабораторной диагностики инфекционных болезней, достоинства и недостатки

50. Вакциопрофилактика и вакцинотерапия. Состав и классификация вакцин.

51. Живые вакцины, получение и применение.

52. Инактивированные вакцины, получение и применение.

53. Синтетические и полусинтетические вакцины, получение и применение.

54. Ассоциированные вакцины.

55. Календарь профилактических прививок.

56. Сывороточные иммунные препараты.

57. Иммуномодуляторы.

Предыдущая20212223242526272829303132333435Следующая

Дата добавления: 2015-02-10; просмотров: 42448; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

ПОСМОТРЕТЬ ЁЩЕ:

Источник: https://helpiks.org/2-53915.html

Иммуноблоттинг на ВИЧ – что это, для чего, когда нужен, результаты

Иммунный блоттинг.: В настоящее время для подтверждения специфичности первично­го

Иммуноблоттинг на ВИЧ – это один из методов диагностики инфекции иммунодефицита. Подчеркнем – один из методов. Да, это высокоточный метод, но в большинстве случаев он применяется как “истина в последней инстанции”.

Диагностические процедуры чаще всего начинаются с ИФА. В случае сомнений в результатах может быть назначена процедура иммунного блоттинга. В любом случае иммуноблоттинг входит в диагностическую цепочку диагностики ВИЧ.

Метод сложный и дорогостоящий. По этой причине его применение обосновано в условиях неопределенности – то ли ставить диагноз, то ли он ложный.

Иммуноблоттинг – что это

Иммуноблоттинг – это методика лабораторных исследований сыворотки крови, позволяющая выявить наличие в крови специфических белковых соединений (антител).

Название метода происходит от английского Blot (пятно). В нашей медицине принят термин “блоттинг”. Поскольку метод относится к сложной теме из молекулярной биологии, подробно его рассматривать не будем. Остановимся только на моментах, которые необходимы для понимания диагностической цепочки.

Справочно. Основным в иммуноблоттинге является выделение необходимых белков из сыворотки крови, нанесение их на носитель с последующим анализом. Чтобы выделенные белки увидеть, их, например, окрашивают в какой-либо цвет (отсюда и пятно).

Метод диагностики иммуноблоттинг применяется для определения различных заболеваний. В диагностике ВИЧ он проявил себя эффективно.

Как проводится

Для проведения иммунного блоттинга используют электрофорез исследуемых белковых структур в полиакриламидном геле.

После того, как произойдет разделение изучаемых антигенов по молекулярному весу, полученный материал переносят на нитроцеллюлозные или PVDF мембраны.

На мембране остается спектр белков, характерный для исследуемого заболевания.

После этого на мембрану наносят сыворотку крови пациента. В случае, если сыворотка содержит необходимые антитела, происходит реакция связывания типа антиген-антитело.

Связывание происходит строго по соответствующим полоскам антигенов на мембране. За счет этого становится возможна визуализация образовавшихся комплексов антиген-антитело.

При положительном анализе иммунного блоттинга появляются видимые полосы на определенных участках мембраны.

Также многие современные методики исследования иммуноблоттинга проводятся при помощи ИФА (иммуноферментный анализ) или иммуноокрашивания.

Для каждого конкретного исследования применяют специфичные к исследуемому белку антитела. За счет этого иммунный блоттинг относится к высокоточным исследованиям с низким уровнем погрешности.

Справочно. Иммуноблоттинг на ВИЧ используется для выявления в крови антител к вирусу иммунодефицита человека.

В некоторых лабораториях вместо классического иммуноблоттинга применяют линейную методику, относящуюся к непрямым иммунологическим исследованиям, позволяющим провести качественную оценку наличия аутоантител класса IgG.

Ифа и иммуноблоттинг на вич

Иммуноферментный анализ (ИФА) относится к лабораторным иммунологическим методам качественной или количественной диагностики в анализе крови специфических соединений (низкомолекулярные соединения, макромолекулы, вирусы).

В основе иммуноферментного анализа лежит реакция антиген-антитело.

При выявлении в анализе указанного комплекса (антиген-антитело) его отмечают с помощью специального фермента.

Иммуноферментный анализ достаточно прост в использовании и отличается высокой точностью. В связи с этим, при диагностике инфекции его применяют в первую очередь.

Однако, согласно протоколам диагностики, такой серьезный диагноз на основании результатов одного ИФА не выставляется. Для подтверждения требуется обязательное проведение иммуноблоттинга на ВИЧ.

Справочно. Это связано с тем, что иммунный блоттинг отличается максимальной точностью. При получении нескольких положительных результатов иммуноблоттинга вероятность диагностической ошибки сводится к нулю.

Следует отметить, что в отличие от ИФА, иммунный блоттинг относится к сложным и весьма дорогостоящим методикам диагностики, поэтому он применяется только после получения 2 положительных анализов ИФА.

Анализ на ВИЧ. Обозначение.

В отличие от ИФА, иммунный блоттинг не дает ложноположительных результатов при наличии у пациента антител к Эпштейн-Барр вирусу, ревматоидному фактору, главным комплексам гистосовместимости HLA, при беременности.

В каких случаях назначается анализ

Анализ на ВИЧ назначается:

  • при выявлении у пациента генитального герпеса, гонореи, сифилиса и других заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП);
  • после незащищенного полового контакта с непроверенным партнером;
  • после нанесения татуировок или татуажа, выполнения пирсинга или проведения инъекционных косметологических процедур в нелицензированных заведениях;
  • после контактов с кровью инфицированного человека;
  • после использования игл, бритв, лезвий или хирургических инструментов, загрязненных биологическим материалом ВИЧ-инфицированного пациента;
  • при плановом обследовании перед получением гражданства, вида на жительство, при прохождении комиссии в военкомате, при прохождении профилактического осмотра перед поступлением в медицинский университет, при плановых профосмотрах (военные, хирурги);
  • при планировании беременности;
  • во время вынашивания ребенка;
  • при выявлении у пациента симптомов ВИЧ инфекции.

Симптомы ВИЧ на первых стадиях не специфичны. Заболевание может проявляться слабостью, постоянной сонливостью, вялостью, периодической лихорадкой, мышечными и суставными болями, хроническими тонзиллитами, увеличением лимфатических узлов, сыпью неясной этиологии.

В редких случаях возможны постоянные головные боли, частая потеря сознания, снижение памяти, развитие энцефалопатии.

Прогрессирует инфекция медленно, поэтому подобная неспецифическая симптоматика может наблюдаться на протяжении от 3 до 7 (и более) лет.

В дальнейшем симптомы проявляются в виде оппортунистических инфекций (сопутствующие инфекционные заболевания, развивающиеся на фоне снижения иммунитета из-за прогрессирующего ВИЧ).

Максимальная эффективность лечения достигается на стадии неспецифических проявлений. Поэтому, при наличии факторов риска заражения (инъекционная наркомания, частые незащищенные половые контакты с непроверенными половыми партнерами и т.д.) требуется регулярно проверяться на ВИЧ.

Иммуноблоттинг на ВИЧ – где сдать

Анализ на иммуноблоттинг можно пройти в центре СПИДа или частных лабораториях. По желанию пациента обследование может быть проведено анонимно.

Антитела к вирусу иммунодефицита человека появляются в крови зараженного человека уже через 2 недели после заражения.

Однако, для получения максимально точных результатов следует провести 2-3 теста на ВИЧ инфекцию. Чаще всего проводят обследование на 6 и 12 неделе после предполагаемого заражения.

Может быть проведено экстренное обследование (при возможности назначения ранней постконтактной профилактики).

Вероятность выявления положительного иммуноблоттинга на ВИЧ во многом зависит от времени, прошедшего от момента заражения.

Справочно. Через месяц после заражения анализ положителен у 60% пациентов, спустя 45 дней – у 80%, через 3 месяца антитела выявляются практически у 100% инфицированных.

В связи с этим, перед обследованием на ВИЧ требуется проконсультироваться с врачом СПИД-центра. Консультации проводятся анонимно. Специалист расскажет о том, как может передаваться вирус, как предохраняться от заражения, рассчитает срок, когда лучше пройти обследование и сколько раз необходимо сделать анализ.

Также по показаниям может быть назначена ранняя профилактика.

Результат иммуноблоттинга должен трактоваться исключительно специалистом. Самостоятельное назначение обследования в частном центре и расшифровка результатов «по интернету» может привести к диагностическим ошибкам и тяжелейшим последствиям для здоровья.

В СПИД-центре после анализа проводится послетестовая консультация. При выявлении положительного иммуноблоттинга врач назначает дополнительные обследования, на основании результатов которых пациенту подбирается комплексная антиретровирусная терапия.

Как проводится анализ на ВИЧ

Справочно. Согласно официальным протоколам диагностики ВИЧ-инфекции, в первую очередь проводится скрининговое исследование при помощи методики ИФА. Дальнейшая диагностика зависит от результатов первого исследования.

Если ИФА не выявил антител к ВИЧ и вирусных антигенов, обследуемому выдается отрицательный результат. Дальнейшее обследование не выполняется.

Исключение могут составлять случаи, при которых пациент не уверен в точных сроках предполагаемого инфицирования. Для уточнения может быть рекомендовано повторное прохождение теста через 6-12 недель (для исключения ложноотрицательных результатов).

При получении сомнительных или положительных результатов пациент получает направление на дальнейшее обследование в СПИД-центре. После этого проводится еще 1-2 анализа методом ИФА.

При получении двух положительных или сомнительных результатов проводится иммуноблоттинг на ВИЧ инфекцию.

В дальнейшем врач назначает количественную ПЦР диагностику для определения активности вируса и вирусной нагрузки. Может быть назначена также вирусологическая диагностика, позволяющая идентифицировать тип вируса (ВИЧ1 или ВИЧ2).

Как подготовится к обследованию

Для исследования сыворотки на ВИЧ методом иммуноблоттинга используется венозная кровь.

Забор крови проводится натощак. За два дня до исследования рекомендовано исключить употребление спиртных напитков. Утром перед забором крови не рекомендовано курить.

Также за 1-2 дня до исследования рекомендовано исключить тяжелые физические нагрузки и стрессы.

Иммуноблоттинг – цена

Цена на исследование крови на ВИЧ методом ИФА начинается от 500-700 рублей (цена в частных лабораториях).

Иммуноблоттинг проводят преимущественно в СПИД-центрах по направлению иммунолога. Обследование в специализированных центрах проводится бесплатно.

Тесты для диагностики ВИЧ

Для диагностики ВИЧ существуют тест системы 3-го поколения (без антигенов) и 4-го поколения (с антигенами).

Тест системы первых двух поколений больше не производятся и считаются устаревшими.

На территории Российской Федерации используют только тест-системы четвертого поколения.

Старые тест системы уже не используются, поэтому при правильном прохождении обследования (двукратное ИФА и иммуноблоттинг) вероятность получения ложных результатом сводится к нулю.

Иммуноблоттинг – расшифровка результатов

При получении отрицательных результатов дальнейшее обследование не требуется.

Отрицательные результаты говорят о том, что в крови пациента отсутствуют антитела к двум или трем специфическим гликопротеинам вирусной оболочки ВИЧ (GP41, 120 и 160).

Пациентам с сомнительными результатами исследования рекомендовано повторное обследование через две недели или через 3, 6 и 12 месяцев. Срок повторного обследования определяются иммунологом из СПИД-центра.

Справочно. Получение положительного иммуноблоттинга на ВИЧ означает, что в крови пациента были обнаружены антитела к двум или трем специфическим гликопротеинам вирусной оболочки ВИЧ (GP41, 120 и 160).

Иммуноблоттинг при беременности

Справочно. Беременность может приводить к получению ложноположительных результатов ИФА. Такая ситуация наблюдается достаточно редко, однако, ее необходимо учитывать при трактовке результатов анализа.

В связи с этим, беременным при получении сомнительного или положительного анализа назначают повторный тест ИФА через 2-3 недели.

После этого, при получении повторного сомнительного или положительного результата, назначается иммунный блоттинг на ВИЧ.

При получении отрицательного иммунного блоттинга – ВИЧ исключается. При получении положительных результатов пациентке назначается дополнительное обследование (определение вирусной нагрузки, ПЦР, вирусологическая диагностика, определение уровня СD клеток).

В дальнейшем, в зависимости от сроков беременности и результатов дополнительного обследования назначается профилактика передачи вируса плоду. Вся профилактика назначается согласно протоколам ВААРТ.

Для профилактики заражения плода используются специальные препараты, разрешенные для лечения беременных.

У новорожденных, рожденных от матерей с ВИЧ, кровь исследуют методом ПЦР. Выбор метода связан с тем, что методы иммунного блоттинга и ИФА у таких детей не информативны до 18-ти месяцев жизни.

Методики иммунного блоттинга и ИФА у таких новорожденных могут давать ложноположительные результаты из-за выявления материнских антител.

Своевременно начатая профилактика уменьшает риск заражения ребенка. Поэтому для беременных крайне важна своевременная диагностика ВИЧ. В идеале обследование стоит пройти обоим половым партнерам еще на этапе планирования беременности.

Типичные ошибки при диагностике ВИЧ

Основная ошибка – это слишком раннее прохождение тестов (в период «серологического окна» когда в крови еще нет антител).

Внимание. Также к ошибкам относится самоназначение и обследование в частной лаборатории. Без иммунолога сложно подсчитать возможный период «серологического окна» и правильно трактовать результаты обследования.

Еще необходимо учитывать вероятность получения ложноположительных результатов ИФА у беременных и пациентов с вирусом Эпштейн-Барр.

Для исключения ошибок, обследование рекомендовано проходить в СПИД-центре под контролем иммунолога.

Источник: https://testanaliz.ru/immunoblotting-na-vich

Иммунный блоттинг в диагностике ВИЧ

Иммунный блоттинг.: В настоящее время для подтверждения специфичности первично­го

Иммунный блоттинг (иммуноблот, Western Blot, вестерн-блот) – сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим переносом на нитроцеллюлозную полоску (стрип) антигенов вируса.

В этом красивом ученом названии «blot» переводится скорее всего как «клякса», а «western» – как « западная» отражает направление распространения этой «кляксы» по бумаге слева направо, то есть на географической карте это соответствует направлению с запада на восток.».

Суть метода «иммунный блот» заключается в том, что иммуноферментную реакцию проводят не со смесью антигенов, а с антигенами ВИЧ, предварительно распределенными методом иммунофореза по фракциям, располагающимся согласно молекулярному весу по поверхности нитроцеллюлозной мембраны.

В результате основные белки ВИЧ, носители антигенных детерминант, распределяются по поверхности в виде отдельных полос, которые и проявляются при проведении иммуноферментной реакции.

Иммуноблот включает в себя несколько стадий:

Подготовка стрипа.

Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу.

Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на “промокашку” избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.

Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется – делается видимым.

Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

  • Полоска А – Положительный контроль

  • Полоска В – Слабоположительный контроль

  • Полоска С – Отрицательный контроль

  • Полоска D – Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)

В настоящее время иммунный блоттинг (иммуноблот) является основным методом для подтверждения наличия вирусспецифических антител в исследуемой сыворотке. В некоторых случаях ВИЧ-инфекции, до развития сероконверсии, специфические антитела более эффективно выявляются методом иммунного блоттинга, чем ИФА.

При исследовании методом иммунного блоттинга обнаружено, что чаще всего в сыворотках больных СПИДом выявляются антитела к gp 41, причем обнаружение р24 у лиц, обследуемых с профилактической целью, требует дополнительных исследований на наличие у них ВИЧ-инфекции.

Тест-системы для иммунного блоттинга на основе рекомбинантных белков, полученных путем генной инженерии, оказались более специфичными, чем обычные системы на основе очищенного вирусного лизата.

При использовании рекомбинантного антигена формируется не диффузная, а четко выраженная узкая полоска антигена, легко доступная для учета и оценки.

Сыворотки лиц, инфицированных ВИЧ-1, обнаруживают антитела к следующим основным белкам и гликопротеидам – структурным белкам оболочки (env) – gp160, gp120, gp41; ядра (gag) – p17, p24, p55, а также ферментов вируса (pol) – p31, p51, p66. Для ВИЧ-2 типичны антитела к env – gp140, gp105, gp36; gag – p16, p25, p56; pol – p68.

Среди лабораторных методов, необходимых для установления специфичности реакции, наибольшее признание имеет обнаружение антител к белкам оболочки ВИЧ-1- gp41, gp120, gp160, и ВИЧ-2 – gp36, gp105, gp140.

ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеидам ВИЧ.

Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (гп 160, гп 120, гп 41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, используя набор другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, рекомендуется наблюдение в течение 6 месяцев (исследования через 3 месяца).

Наличие положительной реакции с антигеном p24 может указывать на период сероконверсии, так как антитела именно к этому белку иногда появляются первыми.

В этом случае рекомендуется, в зависимости от клинических и эпидемиологических данных, повторить исследование с образцом сыворотки, взятым как минимум через 2 недели, и это является как раз тем случаем, когда при ВИЧ-инфекции необходимо исследование парных сывороток.

Положительные реакции с белками gag и pol без наличия реакции с белками env могут отражать стадию ранней сероконверсии, а также может указывать на ВИЧ-2 инфекцию или на неспецифическую реакцию. Лиц с такими результатами после тестирования на ВИЧ-2 повторно исследуют через 3 месяца (в течение 6 месяцев).

Источник: http://www.eurolab-portal.ru/aids/2878/2888/35439/

Medic-studio
Добавить комментарий