Иммуногистохимические методы исследования.: Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах

ГистоFISH анализ перестроек гена ВCL2 на парафиновых срезах

Иммуногистохимические методы исследования.: Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) – новейший цитогенетический метод исследования, в процессе которого детектируется наличие и локализация специфических ДНК-последовательностей на хромосомах.

Генетические маркеры: транслокации t(14;18)(q32;q21), t(2;18)(p11;q21), t(18;22)(q21;q11) образуются вследствие “слияния” (транслокации) гена BCL2 с различными генами в клетках-предшественницах кроветворной ткани.

В результате этого клетки лимфоидного ростка теряют возможность отвечать на внешние стимулы запуска механизмов апоптоза. Анализ наличия транслокаций является важнейшей диагностической процедурой при фолликулярной лимфоме.

Синонимы русские

Флуоресцентная гибридизация in situ, молекулярная диагностика онкогематологических заболеваний, фолликулярная лимфома

Метод исследования

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

Материал для исследования

Образец ткани в парафиновом блоке

Как правильно подготовиться к исследованию?

Специальной подготовки не требуется. Для исследования используется уже предварительно подготовленный биологический материал (парафиновый блок с образцом биоматериала).

Преимущества исследования

  • Является чувствительным методом для идентификации хромосомных аберраций при количествах лейкозных клеток менее 109 , обеспечивая при этом быстрый анализ большого (>500) числа клеток. Метод обладает высокой точностью для идентификации неизвестных фрагментов хромосомной ДНК.
  • Для исследования могут быть использованы различные биоматериалы – аспираты тонкоугольной аспирационной биопсии, костного мозга, мазки крови, биоптаты, полученные на различных стадиях заболевания;
  • Исследование FISH может быть применено как к метафазным, так и к интерфазным ядрам, то есть к неделящимся клеткам;
  • Позволяет определить даже самые небольшие генетические аномалии, которые нельзя рассмотреть при помощи обычного микроскопа, при использовании соответствующих ДНК-зондов.

Общая информация об исследовании

Анализ с помощью флюоресцентной in situ гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH) – молекулярно‐цитогенетический метод для идентификации генетических аберраций (отклонений от нормы).

Изначально данный метод использовался как исследовательский для выявления наличия или отсутствия специфической ДНК последовательности в хромосомах, но благодаря прогностической и предсказательной ценности был внедрен в клиническую практику.

Метод  основан на использовании флуоресцентно меченых ДНК-зондов, которые представляют собой искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), последовательность которых комплементарна последовательности ДНК исследуемых аберрантных хромосом.

ДНК-зонды различаются по составу  специфичности: для каждой хромосомной аномалии используются свои ДНК-зонды. Также зонды различаются по размеру: одни могут быть направлены к целой хромосоме, другие – к конкретному локусу (фрагменту хромосомы или гена).

После специальной процедуры – денатурации – молекула ДНК приобретает вид одноцепочечной нити. ДНК-зонд гибридизуется  (связывается) с комплементарной ему нуклеотидной последовательностью и может быть обнаружен при помощи флуоресцентного микроскопа. Данное состояние интерпретируется как положительный результат FISH-теста.

При отсутствии аберрантных хромосом несвязанные ДНК-зонды в ходе реакции “отмываются”, что при исследовании с помощью флуоресцентного микроскопа определяется как отсутствие флуоресцентного сигнала (отрицательный результат FISH-теста). Метод позволяет оценить не только наличие флуоресцентного сигнала, но и его интенсивность и локализацию.

Таким образом, FISH-тест – это еще и количественный метод.

FISH имеет широкие возможности в клинической  онкологии для обнаружения хромосомных аномалий в опухолевых клетках. Метод позволяет исследовать генетический состав клетки, как во время митоза, так и в интерфазе. FISH имеет высокую чувствительность – позволяет обнаружить индивидуальные гены, кроме того, в одном препарате могут быть использованы несколько зондов с различными красителями.

FISH-анализ широко применяется при лимфопролиферативных заболеваниях, являясь в ряде случаев определяющим фактором для подтверждения диагноза.

Фолликулярная лимфома (ФЛ) – моноклональная опухоль, развивается из зрелых В-лимфоцитов, происходящих из фолликулярного центра лимфатических узлов.

  Является подтипом неходжкинской  лимфомы, занимает второе место в мире по частоте, составляя в среднем 20 % от всех злокачественных лимфопролиферативных заболеваний взрослых.

Средний возраст заболевших 60 лет, соотношение заболевших мужчин и женщин приблизительно 1:1,7.

Этиология фолликулярной лимфомы до конца не выяснена. Риск развития фолликулярной лимфомы связывают с длительным лечением иммунодепрессантами.

Патологический процесс при фолликулярной лимфоме в большинстве случаев локализуется в лимфатических узлах, характерно безболезненное увеличение лимфоузлов – как периферических, так и висцеральных, реже выявляют поражение селезенки, кольца Пирогова-Вальдейра, ЖКТ, мягких тканей, кожи, причем фолликулярная лимфома кожи является одной из самых частых В-клеточных кожных лимфом.  При поражении костного мозга опухолевые клетки могут определяться и в периферической крови. Другие клинические симптомы, такие как слабость, потливость, снижение веса, анемия, лейкопения и др. редко встречаются в начале заболевания, но могут наблюдаться на более поздних стадиях.

Согласно цитологической  классификации Mann и Berard, предложенной еще в 1892 г.,  выделяют  три типа фолликулярных лимфом. Эта система базируется на подсчете количества центробластов (бластов) в поле зрения при большом увеличении:

  •        тип I – количество бластов менее 5 %,
  •        тип II – количество бластов 5-15 %,
  •        тип III – количество бластов более 15 % (имееет подтипы IIIа и IIIб)

Фолликулярная лимфома I, II и IIIа типов по клиническому течению являются классическими лимфомами, в то время как фолликулярная лимфома IIIб типа (до 10 % всех фолликулярных лимфом) отличается агрессивным течением.

Факторами риска при ФЛ являются: мужской пол, пожилой возраст, большая масса опухоли, интоксикационный синдром, инфильтрация костного мозга, повышение лактатдегидрогеназы (ЛДГ) выше 700 Ед/л или повышение уровня р2-микроглобулина.

В 30-50 % случаев происходит трансформация фолликулярной лимфомы. Наиболее часто она трансформируется в диффузную В-крупноклеточную лимфому, реже возникает опухоль, напоминающая лимфому Беркитта, ассоциированную с транслокацией c-MYC.

Согласно последней классификации ВОЗ (2016 г)  в качестве отдельной нозологической формы выделена фолликулярная лимфома детского типа (ФЛДТ). Данное наименование специально присвоено этим опухолям, чтобы отличать их от подобных новообразований, которые могут встречаться  у взрослых.

ФЛДТ имеют нодулярный характер поражения с экспансией фолликулов с высокой пролиферативной активностью, в которых выявляются бластоподобные клетки центров фолликулов, а не классические бласты. В ряде случаев у пациентов с лимфомами этого типа не обнаруживается перестройка гена Bcl-2, но определяется некоторый уровень экспрессии белка Bcl-2.

В клетках не определяется также перестройка генов Bcl-6 и MYC.

Также согласно новой классификации ВОЗ (2016 г) принято выделять ФЛ дуоденального типа.

Данная опухоль, имеющая признаки ФЛ низкой степени злокачественности, отличается от других ФЛ желудочно-кишечного тракта.

Она имеет ряд признаков, сходных с таковыми при фолликулярной неоплазии in situ и напоминающих экстранодальную лимфому из клеток маргинальной зоны лимфоидной ткани, ассоциированную со слизистой оболочкой.

Опухолевые клетки фолликулярной лимфомы экспрессируют антигены CD20, CD79а, РАХ-5, CD10, белки Bcl-2, Bcl-6. Уровень экспрессии CD10 и Bcl-6 может быть различным.

Фолликулярная лимфома ассоциируется с хромосомной транслокацией гена Bcl-2.

Эта хромосомная транслокация приводит к  гиперэкспрессии белка  Bcl-2, что препятствует программируемой клеточной гибели (апоптозу) и повышает выживаемость опухолевых клеток.

Для чего используется исследование?

  • Для уточнения диагноза при подозрении на злокачественное заболевание крови, в том числе при Ph-отрицательных комплексных кариотипах, когда присутствует ген BCR/ABL, определяемый только методом FISH;
  • Для повторного консультирования при подозрении на наличие злокачественного заболевания крови;
  • Для выбора тактики лечения и прогноза заболевания, которые зависят от хромосомного состава опухоли;
  • Чтобы определить наличие или отсутствие конкретной хромосомной аберрации.

Когда назначается исследование?

  • При подозрении на наличие злокачественного заболевания крови, для выбора тактики лечения и оценки прогноза, который зависит от хромосомного состава опухоли;
  • Для подтверждения диагноза при наличии клинических предпосылок: клиническая картина заболевания, изменения гемограммы, наличие специфических синдромов – гиперпластический, геморрагический, анемический и др.);
  • У больных с  фолликулярной лимфомой (ФЛ) для выявления лимфомы высокой степени злокачественности с транслокациями MYC и BCL2 и/или BCL6;
  • Для контроля “минимальной остаточной болезни” после химиотерапии или пересадки костного мозга.

Референсные значения:

Отсутствие аберрантных хромосом в исследуемом образце.

Около 90 % фолликулярные лимфом характеризуются t(14;18) (q32; q21) транслокацией, затрагивающей ген тяжелой цени иммуноглобулина на 14 хромосоме и Bcl-2 ген на 18 хромосоме.

Транслокация встречается также в 20 % случаев  В-крупноклеточных диффузных лимфом и в 1—2 % случаев хронического лимфолейкоза.

Выявление гиперэкспрессии белка Bcl-2 на сегодняшний день является обязательным диагностическим признаком и используется  для дифференциального диагноза фолликулярных лимфом.

В 15 % случаев фолликулярной лимфомы. встречается транслокация 3q27.

Фолликулярная лимфома с трисомией по хромосоме 3 и транслокацией 3q27-29 является заболеванием с высоким риском и относится к подгруппе фолликулярных лимфом с маргинальной дифференцировкой.

К группе высокого риска трансформации также относится фолликулярная лимфома с плазмоцитарной дифференцировкой (“плазмоцитомоподобная лимфома”).

Кто назначает исследование?

Гематолог, онколог

[02-043] Клинический анализ крови: общий анализ, лейкоцитарная формула, СОЭ (с обязательной микроскопией мазка крови)

[02-027] Ретикулоциты

[12-077] Морфологическое исследование трепанобиоптата костного мозга

[16-012] Цитогенетический анализ клеток костного мозга (кариотип)

[07-009] anti-HCV, антитела

[20-067] Иммунологическое обследование первичное

[18-127] FISH анализ перестроек гена BCL-6 (der(3)(q27))

Литература:

1.     Иммуногистохимические методы: Руководство / Ed. by George L. Kumar, Lars Rudbeck.:

DAKO / Пер. с англ. под ред. Г.А.Франка и П.Г.Малькова. – М., 2011. – 224 с.

2.     Wan TS, Ma ES. Molecular cytogenetics: an indispensable tool for cancer diagnosis. Chang Gung Med J. 2012. Mar-Apr: 35(2): 96-110. Review. PubMed PMID: 22537925.

3.     М. Ж. Алексанян, Е. А. Асеева, А. И. Удовиченко, Е. В. Домрачева. Цитогенетические исследования в гематологии. Организационные аспекты. Гематология и трансфузиология, 2012, т. 57, № 4. С.23 – 27.

4.     Фолликулярная  лимфома у взрослых. Клинические рекомендации. Национальное гематологическое общество Российское профессиональное общество онкогематологов. 2016г.

5.     Поддубная И.В. Неходжкинские лимфомы. “Клиническая онкогематология”, издание 2-е, Руководство для врачей под ред. проф. Волковой М.А., Москва, Медицина, 2007, стр. 724-770.

Источник: https://helix.ru/kb/item/12-124

Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии ( Коллектив авторов, 2014)

Иммуногистохимические методы исследования.: Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах

При взятии материала для ИГХ-исследования следует строго соблюдать все требования, которые предъявляются к этой процедуре при обычном патоморфологическом исследовании. Материал не должен подсыхать перед погружением в фиксирующую среду, его не следует промывать гипотоническими средами (например, водой).

Фрагменты материала не должны быть слишком крупными, поскольку большие размеры фиксируемых кусочков не позволяют добиться равномерности фиксации и хорошей сохранности центральных областей объекта, что в последующем проявляется различными артефактами.

Фрагменты тонкостенных полых органов и пленочные препараты необходимо фиксировать в расправленном состоянии. Лучше всего для этого использовать восковые пластины. Фрагменты картона и плотной бумаги менее пригодны.

При планировании исследования костной ткани следует ограничиться минимальными размерами объекта, поскольку крупные фрагменты костной ткани невозможно хорошо декальцинировать в тех декальцинаторах, которые пригодны для ИГХ (см. Приложение 1).

Патогистологический материал, включая операционные биопсии, желательно фиксировать в нейтральном формалине (параформальдегиде) или цинк-формалине, который по времени фиксации и обеспечению способности препаратов к восприятию обзорных окрасок полностью подобен обычному формалину. Простой (не нейтрализованный) формалин, приготовленный из концентрированного формальдегида 1: 9, использовать нежелательно.

В научных исследованиях, когда требуются максимально высокое качество гистологического препарата и хорошая сохранность антигенов, следует помимо цинк-формалина использовать и другие фиксаторы, предназначенные для применения в ИГХ (см. Приложение 1).

При проведении экспериментальных исследований в отдельных случаях может понадобиться перфузионная фиксация (способ, когда фиксирующая жидкость вводится через артериальное русло).

Обычно после применения альдегидных фиксаторов наступает перекрестная сшивка белковых молекул, что ведет к ухудшению выявляемости антигенов и вызывает необходимость их протеолитического или теплового демаскирования.

Наш опыт показывает, что применение «мягкой» фиксации (фиксация в этанол-формальдегиде при концентрации последнего 0,5 – 1,0 % в течение 12 – 24 ч и фиксация в цинк-этанол-формальдегиде до 24 ч) не приводит к существенному ослаблению иммуноцитохимической реакции на белки промежуточных филаментов, α-актин, коллаген IV типа, ламинин, фибронектин (Коржевский Д. Э. [и др.], 2001), белки PCNA (Коржевский Д. Э., 2000), Bcl-2 (Коржевский Д. Э. [и др.], 2002), CD31 (Коржевский Д. Э. [и др.], 2006б), CD68 (Коржевский Д. Э., 2001), ядерный белок NeuN (Коржевский Д. Э. [и др.], 2005) и не требует демаскирования антигена.

Коагулирующие фиксаторы (спирты и различные спиртовые композиции) дают лучшие результаты при фиксации белков и гликопротеидов с большой молекулярной массой.

Так, оптимальной фиксацией для определения виментина является жидкость Карнуа (один из коагулирующих фиксаторов). При фиксации нервной ткани предпочтительна непродолжительная (до 24 ч) фиксация в цинк-этанол-формальдегиде (Коржевский Д. Э. [и др.

], 2006а), который не только хорошо сохраняет многие антигены, но и дает возможность получить отличные результаты при окраске по Нисслю. Для фиксации небольших пептидов (инсулина и др.

), малых молекул и гаптенов (например, моноаминов) рекомендуется использовать альдегидные фиксаторы, поскольку в коагулирующих фиксирующих средах возможно частичное растворение либо диффузия низкомолекулярных антигенов.

После окончания фиксации остатки фиксирующих веществ необходимо удалить из материала, тщательно промыв его в дистиллированной воде (после формалина и цинк-формалина) или этаноле (после коагулирующих фиксаторов и спиртовых смесей). Заливка должна быть осуществлена в течение 2 – 5 сут после завершения фиксации.

Это обеспечивает максимальную сохранность антигенов и их хорошую выявляемость в препаратах.

При использовании архивного материала, длительно фиксировавшегося в формальдегидных фиксаторах либо хранившегося в 80 % этаноле, тепловое демаскирование следует проводить обязательно для всех типов антигенов, которые при этом не подвергаются разрушению, и использовать вторичные системы детекции высокой чувствительности.

Степень «жесткости» альдегидной фиксации и пригодность архивного материала для ИГХ-исследования удобно контролировать, используя тест-реакцию с моноклональными антителами к виметину (клон V9). Антитела клона V9 выявляют чувствительный к перефиксации эпитоп этого белка ПФ. Поскольку клетки, содержащие виментин (фибробласты, эндотелиоциты, менингоциты и др.

), присутствуют в любом гистологическом объекте, за редким исключением, отрицательные результаты пробной ИГХ-реакции на виментин будут указывать на малую пригодность материала для ИГХ в целом. При обезвоживании материала не следует применять изопропанол, который делает объекты хрупкими и плохо поддающимися резке на микротоме.

В качестве промежуточных сред могут быть использованы: хлороформ, петролейный эфир, ортоксилол, метилсалицилат, метилбензоат, неоптическое кедровое масло, пихтовое масло, терпинеол. Заливку можно проводить, используя парафин любых коммерческих марок, лучше известных производителей, как отечественных, так и зарубежных.

При этом не следует применять парафин с высокой температурой плавления (58 – 60 °C). При заливке не рекомендуется использовать температуры выше 60 °C.

Заливка в целлоидин и целлоидин-парафин нежелательна, так как приводит к развитию неспецифической фоновой окраски в ходе выявления пероксидазы диаминобензидином. В случае необходимости применения целлоидина перед постановкой реакций его следует удалить из срезов жидкостью Никифорова (спирт-эфиром).

Изготовление срезов для ИГХ-исследования следует проводить на надежных ротационных и санных микротомах, обеспечивающих точную подачу и необходимый диапазон толщины срезов (3 – 7 мкм).

Более толстые срезы могут потребовать модификации протоколов ИГХ-обработки и изменения времени демаскирования антигенов. Кроме того, толстые срезы плохо удерживаются на предметных стеклах даже при использовании специальных адгезивов.

Срезы должны быть хорошо расправлены. Отсутствие складок позволяет обеспечить лучшее прилипание к предметному стеклу.

Для того чтобы избежать неспецифической фоновой реакции при наклейке срезов на предметные стекла, не следует использовать в качестве адгезивов яичный альбумин и сыворотку крови.

Обычно расправленные на дистиллированной воде срезы толщиной до 5 мкм хорошо приклеиваются к ничем не обработанным предметным стеклам импортного производства (например, к стеклам фирм «Shandon» (США) и «Menzel» (Германия)).

При необходимости обычные предметные стекла для улучшения прилипания срезов могут быть обработаны специальными адгезивами (см. Приложение 2).

При расправлении и сушке срезов нежелательно применять высокие температуры (выше 48 °C). Оптимальным является просушивание срезов в суховоздушном термостате с вентиляцией при 40 °C в течение 3 дней.

Более продолжительное пребывание срезов в термостате может способствовать лучшему их приклеиванию к предметным стеклам.

При необходимости работы с препаратами на следующий день после изготовления срезов желательно использовать стекла с адгезивным покрытием, нанесенным в заводских условиях.

Потеря срезов во время проведения теплового демаскирования и длительной инкубации с антителами, когда нельзя изготовить новые срезы (весь блок уже порезан), ставит вопрос о принципиальной возможности улучшения прилипания срезов к предметному стеклу на этапе, когда срезы уже находятся на нем.

Эту проблему можно попытаться решить, прогревая предметные стекла со срезами в течение ночи (перед проведением ИГХ-реакции) в термостате при 60 – 65 °C.

При использовании такого способа достигаемое иногда улучшение приклеивания срезов сопровождается некоторой потерей иммунореактивности, вызванной действием на срезы высокой температуры.

Удаление парафина из срезов и их регидратацию перед иммуногистохимическим исследованием проводят так же, как и перед обычной окраской.

При этом следует проверять спирты на загрязнение ксилолом, поскольку остатки ксилола, как и плохо удаленный парафин, могут приводить к понижению чувствительности реакции.

Заменители ксилола следует использовать с осторожностью, поскольку они медленнее отмываются в спиртах и быстрее загрязняют их, чем ксилол.

Коржевский Д. Э. Использование моноклональных антител к ядерному белку PCNA для выявления пролиферирующих клеток в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2000. – Т. 118, № 5. – С. 68 – 70.

Коржевский Д. Э. Макрофаги сосудистого сплетения конечного мозга эмбриона человека // Морфология. – 2001. – Т. 119, № 1. – С. 20 – 23.

Коржевский Д. Э., Гилерович Е. Г., Зинькова Н. Н. [и др.]. Иммуногистохимическое выявление нейронов головного мозга с помощью селективного маркера NeuN // Морфология. – 2005. – Т. 128, № 5. – С. 76 – 78.

Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Отеллин В. А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях // Морфология. – 2006а. – Т. 129, № 1. – С. 85 – 86.

Коржевский Д. Э., Отеллин В. А. Морфологические основы формирования гематоликворного барьера сосудистого сплетения головного мозга в пренатальном онтогенезе человека // Журн. эволюционной биохимии и физиологии. – 2001. – Т. 37, № 2. – С. 150 – 153.

Коржевский Д. Э., Отеллин В. А., Неокесарийский А. А. [и др.]. Организация и цитохимические особенности барьерных структур плаценты человека // Морфология. – 2006б. – Т. 129, № 3. – С. 63 – 64.

Коржевский Д. Э., Талантова О. Е., Павлова Н. Г. Экспрессия белка bcl-2 в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2002. – Т. 122, № 5. – С. 31 – 34.

Источник: https://kartaslov.ru/%D0%BA%D0%BD%D0%B8%D0%B3%D0%B8/%D0%9A%D0%BE%D0%BB%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D0%B8%D0%B2_%D0%B0%D0%B2%D1%82%D0%BE%D1%80%D0%BE%D0%B2_%D0%A2%D0%B5%D0%BE%D1%80%D0%B5%D1%82%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B5_%D0%BE%D1%81%D0%BD%D0%BE%D0%B2%D1%8B_%D0%B8_%D0%BF%D1%80%D0%B0%D0%BA%D1%82%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%B5_%D0%BF%D1%80%D0%B8%D0%BC%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%B5_%D0%BC%D0%B5%D1%82%D0%BE%D0%B4%D0%BE%D0%B2/7

Иммуногистохимические методы исследования нервной системы

Иммуногистохимические методы исследования.: Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах

Иммуногистохимия – это комплекс методов исследования тканей, основанный на способности иммунной системы позвоночных (главным образом, млекопитающих и птиц) вырабатывать специфические белки – антитела, способные избирательно связываться с конкретными веществами (антигенами). В организме антитела используются, главным образом, для идентификации и нейтрализации патогенов.

Особенность работы иммунной системы такова, что в теории антитела могут быть выработаны против практически любых химических соединений. Чем крупнее молекула антигена, тем быстрее и лучше будут вырабатываться антитела.

Таким образом можно выработать антитела против интересующего вещества, выделить их из общей сыворотки и использовать для обнаружения этого вещества в клетках и тканях самых разных организмов.

Методы иммуногистохимических исследований не новы. Начало им было положено в 30-е годы ХХ века, когда удалось получить меченные красителем антитела, которые реагировали с соответствующими антигенами и окрашивали их.

В начале 40-х годов были получены антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой. Исследования проводились с использованием обычного флуоресцентного микроскопа.

Появление же конфокального микроскопа значительно расширило возможности этого метода и позволив анализировать трехмерное строение интересующих структур.

Антитела представляют собой гликопротеины, которые выделяют в особую группу иммуноглобулинов. Молекулы антител состоят из пары одинаковых тяжелых и пары одинаковых же легких полипептидных цепей. Соответственно, каждая молекула антител содержит два одинаковых антигенсвязывающих участка, распознающих соответствующий антиген и связывающийся с ним.

Антитела вырабатываются В-лимфоцитами, при этом каждая отдельная линия В-лимфоцитов производит лишь один тип антител, распознающих один определенный эпитоп.

Вследствие этого антитела принято делить на моноклональные (произведенные одной единственной линией клеток и распознающие один-единственный эпитоп) и поликлональные (произведенные лимфоцитами различных линий и распознающих, предположительно, различные эпитопы, предположительно одного антигена).

Моноклональные антитела более специфичные, чем поликлональные, однако производство их обходится существенно дороже. Поэтому чаще всего для исследовательских целей используют поликлональные антитела.

Сами по себе антитела не окрашены и не обладают способностью к флуоресценции. Существует несколько различных способов визуализации в иммуногистохимии, основывающихся на присоединении флуоресцентной или хромогенной метки к молекулам антител. Метка пришивается непосредственно на антитела, выработанные против конкретного антигена.

Существует другой способ – так называемый непрямой иммуногистохимический метод. Он более чувствителен и гибок в работе. Заключается он в использовании двух различных антител: первичных и вторичных. Первичные антитела вырабатываются против конкретного антигена, который необходимо детектировать. Это – чистые, ни с чем не конъюгированные антитела.

Вторичные же антитела вырабатываются против белков организма, из которого были получены первичные антитела. К ним и присоединяются молекулы-метки. В ходе реакции вторичные антитела находят прикрепленные к антигену первичные антитела и связываются с ними. Для выполнения метода образец сначала инкубируют с первичными антителами, а затем с вторичными.

Данная методика не только более чувствительна, но также позволяет использовать с одними и теми же первичными антителами различные метки для различных ситуаций. Вторичные антитела с одним типом метки можно использовать с различными первичными антителами.

Следует лишь учитывать, что первичные антитела должны быть произведены в животных того вида, против которого выработаны вторичные антитела.

Один и тот же объект можно маркировать антителами против нескольких различных антигенов. Количество их, в теории, ограничено лишь количеством видов животных-хозяев, против которых вырабатываются вторичные антитела и спектральными характеристиками красителей.

Следует помнить, что если первичные антитела против различных веществ были выработаны в животных одного и того же вида (например, в кроликах), то использовать их в одном эксперименте невозможно.

Связано это с тем, что при дальнейших обработках, одни и те же вторичные антитела свяжутся со всеми первичными антителами и понять, какие вещества в итоге будут выявлены, станет невозможным.

Кроме того, не следует использовать в одном эксперименте различные вторичные антитела с флуоресцентными метками, имеющими одинаковые или очень схожие спектры поглощения/эмиссии – это может привести к сложности или даже полной невозможности качественного разделения флуоресцентных сигналов.

Метка флуоресцентными антителами хорошо сочетается с большинством часто используемых флуоресцентных методик, таких как мечение фибриллярного актина фаллоидином или окраска ядер красителем DAPI. Кроме того, можно комбинировать методы флуоресцентной иммуногистохимии с хромогенными методами детекции, используемыми при РНК-гибридизации in situ.

Поскольку антитела – довольно крупные молекулы (IgG имеет молекулярную массу около 150 кДа), иногда может возникнуть проблема доставки их внутрь клеток, да и вообще внутрь организма. Для решения этой проблемы обычно используют две группы подходов.

Первая группа подходов заключается в незначительном повреждении мембран исследуемого образца с использованием детергентов. Обычно для этих целей используется Triton X-100 в концентрации от 0,05% до 5%. Наиболее часто используемая концентрация – 0,1%.

В некоторых случаях, при работе с организмами, имеющими плотную кутикулу, такими как нематоды или членистоногие, необходимо механическое повреждение кутикулы. Повреждения можно нанести механически, например скальпелем, либо непродолжительным воздействием ультразвука.

Также в некоторых случаях можно применять предварительную ферментативную обработку объектов с использованием протеаз, хитиназ или коллагеназ.

Альтернативная группа подходов заключается в уменьшении размера самих молекул антител.

Тяжелые цепи имеют так называемый шарнирный участок, по которому при помощи фермента папаина можно разрезать молекулу антитела на три фрагмента: два Fab-фрагмента (непосредственно антиген-связывающие фрагменты – fragment antigen binding) и один Fc-фрагмент (фрагмент способный к кристаллизации – fragment crystallizable).

Fab-фрагменты гораздо легче проникают внутрь клеток. Такой вариант чаще всего используется при нефлуоресцентной детекции, когда вместо молекулы флюорофора к фрагменту антитела пришивается фермент щелочная фосфатаза. Данный вариант детекции используется главным образом при проведении РНК-гибридизации in situ.

Источник: https://www.zin.ru/projects/neuromorphology/methods/immuno.html

способ иммуногистохимического окрашивания криостатных срезов тканей в условиях интраоперационной диагностики

Иммуногистохимические методы исследования.: Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах

Изобретение относится к области медицины. Осуществляют одновременную инкубацию тканевых срезов со смесью первичных и вторичных антител. Первоначально на тканевые срезы наносят первичные антитела, а через 15 секунд инкубации, не промывая буфером, наносят вторичные антитела.

Затем проводят совместную инкубацию в течение 4 минут. Раствор субстрат-хромогена для инкубации готовят непосредственно перед его нанесением, промывку срезов осуществляют раствором буфера и дистиллированной водой, нагретыми до температуры 37°С.

Способ позволяет быстро и точно установить гистогенез опухоли, выявить опухолевые клетки в краях резекции. 6 ил., 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммуногистохимическим исследованиям, и может быть использовано при иммунофенотипировании опухолей в условиях интраоперационной диагностики.

В настоящее время иммуногистохимические методы исследования являются неотъемлемой частью в диагностике опухолей.

При исследовании тканей иммуногистохимическое заключение, с одной стороны, подтверждает морфологический диагноз, с другой стороны, при неясной морфологической картине помогает патологу определить гистогенез опухоли.

Иммуногистохимия (ИГХ) – метод идентификации антигенных структур тканей. Это одна из самых современных методик дифференциальной диагностики онкологических заболеваний, позволяющая определить гистогенез опухоли на молекулярном уровне.

Утрата морфологических особенностей клеток в различных типах опухолей, особенно при метастазировании и недифференцированных новообразованиях мелкоклеточного и полиморфно-клеточного характера, не позволяет провести дифференциальную диагностику опухолей, используя только морфологические методы. Важнейший метод уточняющей диагностики – иммуногистохимический. Он позволяет определить иммунофенотип опухоли, исследовать ее биологические свойства, определить молекулярно-биологические факторы прогноза.

При некоторых патологических состояниях, особенно опухолях, бывает трудно и даже невозможно с помощью гисто- или цитологических окрасок определить тип ткани, ее происхождение. Подобные трудности возникают и при установлении вида возбудителя инфекции.

Между тем, точная верификация процесса имеет большое значение для диагностики, выбора тактики лечения и прогнозирования заболевания. Поэтому целесообразно использовать различные дополнительные методы исследования.

Одним из них является иммуногистохимический метод, принцип которого заключается в том, что на гисто- или цитологические препараты наносят растворы с антителами к искомым антигенам – опухолевым, вирусным, микробным, аутоантигенам и др. Антигены при обычных гистологических окрасках тканей не видны. Антитела в сыворотках несут на себе метку: либо флуорохром, т.е.

краситель, светящийся в темном поле (иначе говоря, дающий флуоресценцию), либо красящий фермент. Если искомый антиген есть в исследуемых тканях, то возникший комплекс антиген-антитело плюс маркер точно укажут его наличие, локализацию, интенсивность окрашивания, помогут определить вид опухоли, изучить ее свойства. Наиболее распространен иммуноферментный метод.

Антитела красящей сыворотки несут не флуорохром, а фермент – пероксидазу хрена, реже другой энзим, например щелочную фосфатазу. Существует несколько вариантов указанного метода. Наиболее часто используют два из них – пероксидазно-анти-пероксидазный (PAP-method, ПАП-метод) и метод авидин-биотинового комплекса (ABC-method, АВС-метод) (Immunocytochemistry.

A Practical Approach. Ed. bу J.E.Beesley. Department of Pharmacology, Wellcome Research Laboratories, Beckenham, Kent / Oxford University Press, 1993, 248; Dodson A., Campbell F., Biotin inclusions: a Potential Pitfall in immunohistochemistry (letter). Histopathology, 1999; 34; 178-179; UK NEOAS Immunocytochemistry News. J. Cell. Pathol.

2001; 5:189; Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Под ред. С.В.Петрова, Н.Т.Райхлина. Казань «Титул», 2004, 451; Diagnostic Immunohistochemistry/Td. by D.Dabbs. Churchill Livingstone, 2006, 828). При ПАП-методе энзимное, т.е.

пероксидазное, антитело связывается с первичным антителом, уже находящимся на антигене, посредством еще одного антитела-мостика. Последний как бы развернут к связываемым звеньям так, чтобы своими короткими иммуноглобулиновыми цепями связать их длинные цепи. Таким образом, имеется 3 слоя субстанций: антиген со связанным антителом в ткани, антитело-мост и ПАП-комплекс, в котором молекулы пероксидазы располагаются между двумя короткими цепями двух связанных антител, несущих энзим.

Использование высококачественных реагентов, упрощение и автоматизация иммуногистохимических исследований сделали данный метод необходимым инструментом для решения диагностических вопросов, встающих перед патологами.

Известен способ окраски хрящевой и костной ткани (патент РФ № 2033610, 20.04.

1995) путем воздействия красителями на гистологический срез, промывки в дистиллированной воде, обезвоживания, просветления и заключения в бальзам, отличающийся тем, что дополнительно поэтапно осуществляют докрашивание 0,1%-ным альциановым синим, приготовленным на буфере с рН 4,4 в течение 20-45 мин при 37°С в термостате и эозином, при этом докрашивание эозином осуществляют при комнатной температуре. К недостаткам данного метода относится его продолжительность, что затрудняет использование его для интраоперационной диагностики.

Известен способ иммуногистохимической детекции протеинов на парафиновых гистологических срезах (патент РФ № 2098825, 10.12.

1997), включающий их депарафинизацию, дегидратацию, блокирование эндогенной пероксидазы и затем неспецифической сорбции иммуноглобулинов, обработку гистологических срезов первичными антителами с последующей инкубацией их вторичными антителами, проявлением пероксидазной активности, окраской и детекцией протеинов по наличию коричневого окрашивания, отличающийся тем, что перед обработкой гистологических срезов первичными антителами в их раствор дополнительно вводят полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации в растворе 5%.

Известно, что иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов тканей занимает в среднем 4-5 часов (в зависимости от характеристик применяемых реагентов).

Окраска криостатных срезов исключает длительные этапы депарафинизации, дегидратации, демаскировки антигенов, регидратации, что значительно ускоряет процедуру.

Тем не менее, оставшиеся этапы обработки ткани занимают в среднем 75-80 минут, что не пригодны для интраоперационной диагностики.

Peter Ruck (Peter Ruck. EnVision for rapid immunostaining in intraoperative frozen section diagnosis.

Institute of Pathology, University of Tubingen, Germany, 2001 Institute of Pathology, University of Tubingen, Germany, 2001) предложил протокол иммуногистохимического окрашивания криостатных срезов: способ окраски «Быстрая интраоперационная иммуногистохимическая диагностика на замороженных срезах», позволяющий получить результат через 12-13 минут.

Таблица 1
«Пошаговое» описание методики P.Ruck: способ-прототип
Этапы иммуногистохимического окрашиванияВремя инкубацииТемпература, °С
1. Фиксация криостатных тканевых срезов в ацетоне и высушивание срезов1 мин 15 сКомнатная 25°С
2.

Инкубация с первичными антителами

3 мин37°С
3. Промывка буфером (Трис-буфер, рН 7,4) 10 с25°С
4. Инкубация с вторичными антителами (EnVision complex Dual Link) 3 мин37°С
5. Промывка буфером (Трис-буфер, рН 7,4) 10 с25°С
6.

Инкубация с субстрат-хромогеном

3 мин37°С
7. Промывка водопроводной водой10 с 25°С
8. Промывка дистиллированной водой 5 с25°С
9. Контрастирование гематоксилином Майера 15 с25°С
10.

Промывка водопроводной водой

30 с42°С
11. Заключение в бальзам30 с25°С

Иммуногистохимическое окрашивание серийных криостатных срезов тканей производилось пероксидазным методом, используя моно- и поликлональные антитела и систему визуализации EnVision (DAKO). Рабочие концентрации первичных антител в 4-10 раз превышали концентрации, рекомендуемые прилагаемыми инструкциями.

Для разведения первичных антител использовали растворитель антител, редуцирующий фоновое окрашивание (DAKO). Все этапы окрашивания проходили на нагревательном столике при температуре 37°С. Суммарное время реакции (без микроскопии и оценки полученных результатов): 12 мин 05 с.

Учитывая время, необходимое для приготовления криостатных срезов, для микроскопии и оценки полученных результатов суммарное время колеблется в пределах 20-22 минут.

Данный способ принят нами за прототип. Главный недостаток прототипа состоит в том, что длительность выполнения исследования превышает 12 мин.

В то время как одной из главных задач морфологического метода исследования является прижизненная диагностика патологических процессов по биопсийному и операционному материалу и, прежде всего, диагностика по криостатным срезам непосредственно в ходе оперативного вмешательства.

Интраоперационная морфологическая диагностика является очень сложной задачей даже для опытных специалистов, поскольку она происходит в условиях дефицита времени (12-15 минут) и опирается исключительно на форму тканевых структур, размеры клеток и т.д., что не исключает эвристических ошибок.

Вместе с тем от первичного морфологического диагноза зависит тактика хирургического лечения, определение возможности органосохраняющей операции, определение уровня иссечения тканей и т.д.

В связи с этим высокоактуальным является внедрение в интраоперационнную морфологическую диагностику методики иммуногистохимического исследования тканей, позволяющей более быстро и точно определить гистогенез опухоли, ее злокачественный потенциал, выявить микрометастазы, оценить состояние края резекции, наличие в краях резекции опухолевых клеток и т.д.

Задачей данного изобретения является повышение эффективности интраоперационной диагностики за счет ускорения иммуногистохимической окраски тканевых криостатных срезов для дальнейшего микроскопического исследования.

Поставленная задача достигается тем, что осуществляют все необходимые этапы окрашивания: фиксацию срезов в ацетоне, воздействие первичных и вторичных антител на антигенные структуры ткани, промывку в Трис-буфере рН 7,4 и инкубацию с субстрат-хромогеном, промывку дистиллированной водой, контрастирование гематоксилином и заключение в бальзам. Но инкубация тканевых срезов со смесью первичных и вторичных антител проводится одновременно, для чего сначала на срезы наносят первичные антитела, а через 15 секунд инкубации (не промывая буфером) наносят вторичные антитела; для инкубации с субстрат-хромогеном используют свежеприготовленный раствор субстрат-хромогена непосредственно перед его нанесением; промывку осуществляют раствором буфера и дистиллированной водой, нагретыми до температуры 37°С. Все вышеперечисленные приемы позволяют существенно сократить время иммуногистохимической реакции. Таким образом, предлагаемый нами отход от стандартной методики вызван необходимостью максимально сократить время исследования опухолевой ткани в момент операции, когда хирурги вынуждены прервать операцию и ждать у операционного стола результатов иммуноморфологического исследования, определяющих дальнейшую тактику оперативного лечения.

Иммуногистохимическое окрашивание предоставляет уникальную возможность для оценки биологического потенциала опухолевых клеток: темп роста, прогноз течения опухолевого процесса, реакция на химиотерапию и гормональное лечение. Имеется высокая степень достоверности при ИГХ в определении фенотипа опухоли, а в ряде случаев ИГХ устраняет необходимость применения других более дорогостоящих и продолжительных по времени диагностических мероприятий.

Заявляемая методика позволяет использовать довольно широкий спектр антител.

Нами были использованы маркеры: Cytokeratin (АЕ1/АЕ3), Cytokeratin 7 (OV-TL 12/30), Vimentin (V9), PLAP (8A9), LCA (2B11+PD7/26), S-100, Melanosom (HMB45), Synaptophysin(SY38), CD30 (Ber-H2), Ki-67 (MIB-1), р63 (4A4), Cytokeratin 34bE12 (34bE12), CA-125 (Ov185:1), PSA (ER-PR8), Galectin-3 (9C4), p504S (13H4), p53 (DO-7) (DAKO).

Первая серия наших исследований была посвящена интраоперационному изучению соответствующих тканей разработанной нами методикой быстрого иммуногистохимического окрашивания криостатных срезов тканей.

Во второй серии исследований было проведено послеоперационное иммуногистохимическое изучение соответствующих тканей на парафиновых срезах по стандартной методике с теми же маркерами и реагентами визуализации.

Сравнительный анализ результатов окрашивания показал полное совпадение иммунофенотипических признаков опухолевых клеток, обнаруженных как на криостатных, так и на парафиновых срезах.

Вариабельной была лишь интенсивность окраски.

В результате проведенного исследования разработанная нами методика иммунофенотипирования на криостатых тканях имеет продолжительность в 7-8 минут. Детали протокола представлены в таблице 2.

Таблица 2
«Пошаговое» описание заявляемой методики иммуногистохимического окрашивания криостатных срезов тканей в условиях интраоперационной диагностики
Этапы иммуногистохимического окрашивания Время инкубацииТемпература, °С
1. Фиксация криостатных срезов в ацетоне 50 сКомнатная

25°С

2. Высушивание срезов 10 с37°С
3. Инкубация со смесью первичных и вторичных антител (EnVision complex)4 мин37°С
4. Промывка буфером (Трис-буфер рН 7,4)10 с 37°С
5. Инкубация с субстрат-хромогеном 1 мин37°С
6. Промывка дистиллированной водой10 с 37°С
7. Контрастирование гематоксилином Майера 15 с25°С
8. Промывка водопроводной водой15 с 42°С
9. 3аключение в бальзам 15 с25°С

Суммарное время реакции: 7 мин 05 с.

Новыми приемами, в отличие от методики P.Ruck, являются:

1. Повышение температуры высушивания до 37°С, за счет чего сокращается время высушивания после фиксации в ацетоне.

2. Устранение этапа промывки буферным раствором после инкубации с первичными антителами за счет одновременной инкубации тканевых срезов со смесью первичных и вторичных антител (т.е. пункты № 2 и № 4 методики P.Ruck объединены в один пункт, а пункт № 3 методики P.Ruck отменен). Т.о. сокращается время инкубации с первичными и вторичными антителами.

3. Первоначально наносят первичные антитела на тканевые срезы, а через 15 секунд инкубации (не промывая буфером) наносят вторичные антитела. Общее время инкубации на этом этапе – 4 мин.

4. Использование свежеприготовленного раствора субстрат-хромогена непосредственно перед его нанесением, за счет чего сокращается время инкубации с субстрат-хромогеном с 3 мин до 1 мин.

5. Использование раствора буфера и дистиллированной воды, нагретых до температуры 37°С, за счет чего сокращается время промывки тканевых срезов после инкубации.

6. После инкубации с гематоксилином сокращается время промывки водой на 15 с и время заключения в бальзам на 15 с.

Сравнительный анализ с прототипом показал, что заявляемый способ имеет новые существенные отличия от известных; в результате время выполнения иммуногистохимической реакции на замороженных срезах сокращается на 5 мин, что в условиях интраоперационной диагностики имеет существенное значение. Это позволяет сделать вывод о соответствии критериям «новизна», «существенные отличия» и «промышленная применимость».

Подробное описание способа и примеры его практического выполнения.

Изучают серийные криостатные срезы тканей, окрашенные гематоксилином и эозином, и производят иммуногистохимическое окрашивание пероксидазным методом, используя моно- и поликлональные антитела и систему визуализации EnVision (DAKO, Дания).

Выбор системы визуализации определен ее высокой чувствительностью и двухшаговой процедурой окраски, занимающей меньше времени, чем ABC-метод. Рабочие концентрации первичных антител соответствуют рекомендациям прилагаемых инструкций или превышают их в 2-10 раз.

Для разведения первичных антител используют растворитель антител, редуцирующий фоновое окрашивание (DAKO). Все этапы окрашивания проводят на нагревательном столике при температуре 37°С.

На криостатный тканевый срез, фиксированный в ацетоне в течение 50 секунд первоначально наносят первичные, а через 15 секунд инкубации (не промывая буфером) вторичные антитела и инкубируют 4 минуты при температуре 37°С с последующим окрашиванием субстрат-хромогеном и контрастированием гематоксилином. Раствор субстрат-хромогена готовят непосредственно перед его нанесением. Для промывки тканевых срезов используют раствор буфера и дистиллированную воду, нагретые до температуры 37°С.

Примеры работы с тканью предстательной железы:

Пример 1. Пациент Д. Иммуногистохимическое окрашивание криостатного среза ткани карциномы предстательной железы с антителами к высокомолекулярным цитокератинам, clone 34 Е12, увеличение ×10 (фиг.1).

На рисунке видна положительная мембранная окраска (коричневая) базальных клеток неопухолевых желез с антителами к высокомолекулярным цитокератинам, clone 34 Е12 и отрицательная окраска с этими же антителами в участке опухолевых желез, что является иммуноморфологическим диагностическим признаком аденокарциномы предстательной железы. Время исследования – 7 минут.

Пример 2. Пациент С. Иммуногистохимическое окрашивание криостатного среза ткани предстательной железы с антителами к высокомолекулярным цитокератинам, clone 34 E12, увеличение ×20 (фиг.2).

На рисунке видна положительная мембранная окраска (коричневая) базальных клеток неопухолевых желез с антителами к высокомолекулярным цитокератинам, clone 34 Е12. Участков аденокарциномы в исследованном материале нет.

Время исследования – 7 минут 4 с.

Пример 3. Пациент А. Иммуногистохимическое окрашивание криостатного среза ткани карциномы предстательной железы с антителами к p504S (clone 13Н4), увеличение ×40 (фиг.3). На рисунке видна положительная цитоплазматическая окраска (коричневая) части опухолевых клеток с антителами к p504S (clone 13Н4), что является признаком малигнизации. Время исследования – 7 минут 6 с.

Пример 4. Пациент И. Иммуногистохимическое окрашивание криостатного среза ткани опухоли яичника с антителами к СА-125 (clone Ov185:1), увеличение ×20 (фиг.4). На рисунке видна положительная цитоплазматическая окраска (коричневая) опухолевых клеток с антителами к СА-125 (clone Ov185:1), что свидетельствует о происхождении опухоли из ткани яичника. Время исследования – 7 минут 5 с.

Пример 5. Пациент А. Иммуногистохимическое окрашивание криостатного среза ткани опухоли легкого с антителами к цитокератину 7 (clone OV-TL 12/30), увеличение ×20 (фиг.5). На рисунке видна положительная мембранная окраска (коричневая) опухолевых клеток с антителами к цитокератину 7 (clone OV-TL 12/30). Время исследования – 7 минут.

Пример 6. Пациент Р. Иммуногистохимическое окрашивание криостатного среза ткани опухоли толстой кишки с антителами к цитокератину (clone АЕ1/АЕ3), увеличение ×20 (фиг.6). На рисунке видна положительная цитоплазматическая окраска (коричневая) опухолевых клеток с антителами к панцитокератину (clone АЕ1/АЕ3). Время исследования – 7 минут 6 с.

Наши исследования выполнены на операционном материале Краевой клинической больницы № 1 им. проф. С.В.Очаповского г.Краснодара.

Исследовали удаленные части легких, бронхобиоптаты, биоптаты опухолей средостения, ткани краев резекции предстательной железы, ткани опухоли предстательной железы, ткани опухолей кишечника, яичников, щитовидной железы, полученные от 73 пациентов, находившихся на лечении с октября 2007 г. по март 2009 г. Результаты и качество иммуногистохимической окраски криостатных и парафиновых срезов тканей были идентичны во всех случаях.

Таким образом, в результате проведенных исследований нами разработан быстрый метод иммуногистохимической окраски на криостатных срезах, позволяющий сократить процедуру окрашивания в среднем до 7-8 минут, что делает актуальным его широкое использование при интраоперационной диагностике.

Формула изобретения

Способ иммуногистохимического окрашивания криостатных срезов тканей в условиях интраоперационной диагностики путем фиксации срезов в ацетоне, воздействия первичных и вторичных антител на тканевый срез, промывки в Трис-буфере рН 7,4 и инкубации с субстрат-хромогеном, промывки дистиллированной водой, контрастирования гематоксилином и заключения в бальзам, отличающийся тем, что осуществляют одновременную инкубацию тканевых срезов со смесью первичных и вторичных антител, для чего первоначально на тканевые срезы наносят первичные антитела, а через 15 с инкубации, не промывая буфером, наносят вторичные антитела и проводят совместную инкубацию в течение 4 мин, раствор субстрат-хромогена для инкубации готовят непосредственно перед его нанесением, промывку срезов осуществляют раствором буфера и дистиллированной водой, нагретыми до температуры 37°С.

Источник: http://www.freepatent.ru/patents/2419798

Medic-studio
Добавить комментарий