Культивирование клеток тканей животных и растений: Центральной ведущей стадией, определяющей успех всего производства в

Культивирование клеток и тканей растений

Культивирование клеток тканей животных и растений: Центральной ведущей стадией, определяющей успех всего производства в

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Культивирование клеток и тканей растений – сравнительно молодая отрасль биотехнологии. Как известно, в природных условиях клетки растений находятся в тканях и органах, защищены от механических воздействий внешней среды.

Кроме того, эти клетки нуждаются во множестве компонентов минеральной и органической природы для метаболизма и роста, поэтому эксперименты культивирования этих клеток in vitrо в прошлом завершались неудачно.

Сначала к минеральным средам добавляли экстракты растений или сыворотку, и лишь в 1922 году Роббинсу удалось на синтетической питательной среде осуществить рост меристемы кончиков корней томатов и кукурузы.

Начало практического культивирования тканевых культур растительного происхождения можно отнести к 1955 г.

Растения являются незаменимым источником получения очень многих практически важных веществ. При этом следует подчеркнуть, что промышленное получение некоторых соединений, например, сердечных гликозидов, флавоноидов, кумаринов, эфирных масел достигается только путем выделения их из растительного сырья.

Между тем возможности получения так называемых “метаболитов интереса” в достаточном количестве зачастую ограничены. Это связано с сокращением ресурсов некоторых ценных дикорастущих растений, принадлежностью многих лекарственных растений к группам эндемов, редким и исчезающим видам.

В связи с этим большой интерес в качестве источника биологически активных веществ представляют культуры растительных клеток.

Использование данных методик – пример слияния высоких технологий, науки и экономически выгодного способа получения лекарственного сырья. Сбор дикорастущего сырья наносит вред экологической обстановке региона и всей планете в целом, а при неправильном сборе может и вовсе привести к вырождению зарослей.

Культивировать целое растение также не практично если в качестве сырья используется, к примеру, только его корневища или корни. Это значит, что вся надземная часть в лучшем случае идёт на корм животным или просто выбрасывается.

Культивирование изолированных клеток и тканей даёт возможность получать именно то сырьё которое необходимо, и кроме того позволяет увеличить количество и качество самих биологически активных веществ.

В самом общем смысле культура клеток и тканей – это искусственное in vitro индицирование делений клеток или выращивание в пересадочной культуре тканей, возникших путём пролиферации клеток изолированных сегментов разных частей растения.

Все объекты, культивируемые in vitro, выращиваются стерильными. Стерилизуются исходные кусочки ткани растений (экспланты), питательная среда, антисептически в специальных боксах стерильным инструментом проводятся манипуляции по выращиванию объектов.

Сосуды в которых культивируются ткани и клетки, закрываются так, чтобы предотвратить инфицирование в течение продолжительного времени.

В культуре тканей лекарственных растений можно выделить три главных направления: получение недифференцированной каллусной массы, создание источников генетического разнообразия форм растений, а так же клеточную селекцию и клональное микроразмножение растений. В природе каллусообразование – естественная реакция на повреждение растений.

В культуре изолированных тканей при помещении экспланта (т. е., фрагмента ткани или органа) на питательную среду его клетки дедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную массу – каллус. В асептических условиях каллус отделяют и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для дальнейшего роста.

В результате получают культуру каллусной ткани, которую можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя её на трансплантаты и пересаживая её на свежую среду. Каллусы легко образуются на эксплантах из различных органов и частей растений: отрезков стебля, листа, корня, проростков семян, фрагментов паренхимы, тканей клубня, органов цветка, плодов, зародышей и т. д.

Культивирование каллусных клеток проводят главным образом двумя способами: на агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках (силикагель, биогели, полиакриламидные гели, пенополиуретан и др.) и в жидкой питательной среде. В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток и даёт начало так называемой суспензионной культуре.

Каллусные клетки в культуре in vitro подвержены значительной генетической изменчивости. Изменчивость геномов может приводить к генетическим изменениям у растений – регенерантов, полученных из культуры каллусных клеток, клеточных суспензий или изолированных протопластов.

Такие растения получили названия сомаклональных вариантов.

Сомаклональные варианты, сохраняя основные свойства прототипа, часто выгодно отличаются от него устойчивостью к болезням, экологическим стрессам, а иногда несколько изменённой биосинтетической способностью и более высокой продуктивностью.

Неотселектированные недифференцированные клетки накапливают, как правило, незначительное, по сравнению с интактным растением, количество веществ специализированного обмена.

Только благодаря правильно разработанной стратегии получения высокопроизводительных штаммов к настоящему времени получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы служить лекарственным сырьем.

Однако для многих культур неоднократные попытки различных исследователей определить условия накопления продуктов, характерных для родительских растений, были неудачными.

Это касается, в частности, индукции морфинановых алкалоидов в культуре ткани Papaver somniferum, винбластина – в Catharanthus roseus, хинолиновых алкалоидов – в Cinchona ledgeriana, дигоксина – Digitalis lanata и др.

Чаще всего в клеточных культурах при длительном культивировании снижается или совсем теряется способность клеток накапливать соединения вторичного метаболизма из-за возникновения малоактивных, но более жизнеспособных вариантов.

Снижение биосинтетического потенциала в культуре in vitro происходит из-за подавления дифференциации клеток и их специализации, т. е.

, в результате потери способности к реализации генетической информации, относящейся ко вторичному обмену.

Важной характеристикой клеточной популяции является ее стабильность в отношении синтеза, транспорта и депонирования метаболитов «интереса». Стабильность может сохраняться в течение всего времени существования популяции. При этом сохраняются и активно работают гены синтеза, системы транспорта и депонирования.

Возможен случай постепенного (в течение нескольких лет) увеличения числа клеток со сниженным синтезом метаболитов. И, наконец, в случае полной нестабильности клетки популяции очень быстро теряют свой биосинтетический потенциал. Вопрос о стабильности и нестабильности тесно связан с изучением биологии клеток разных популяций.

В организме растения синтез метаболитов, их транспорт и отложение в запас находятся под строгим контролем развития.

Часто эти события не только разведены во времени, но и происходят в разных органах растения.

Клетка вне организма обычно не транспортирует метаболиты в соседние клетки или в питательную среду, хотя в ряде случаев это явление наблюдается (биосинтез алкалоидов в клеточных культурах мака).

На выход вторичных продуктов в культурах растительных клеток влияют многие факторы, однако все способы регуляции вторичного метаболизма в культуре in vitro можно разделить на две группы: физиологическая и генетическая регуляции синтеза вторичных метаболитов.

Подбор физических и химических условий культивирования является наиболее простым и часто применяемым подходом для повышения продуктивности. В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния факторов культивирования на рост и метаболизм клеток.

Большое внимание уделяется таким факторам культивирования, как регуляторы роста, минеральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура, а также иммобилизация клеток и обработка элиситорами. Во многих случаях эти работы привели к успеху, однако они выполняются эмпирически и поэтому длительны и трудоемки.

К тому же следует оговориться, что несмотря на эффективность повышения уровня биосинтеза физиологическими методами, добиться количественно значимых изменений в недифференцированных клеточных культурах, сопоставимых с уровнем в интактном растении, лишь за некоторым исключением, не удается.

Стимулирование же синтеза элиситорами носит, к сожалению, временный характер.

Более эффективной в этом плане является генетическая регуляция синтеза вторичного метаболизма в системе in vitro.

С использованием экспериментального мутагенеза стало возможным получение довольно продуктивных штаммов. С помощью этого метода в ИФР РАН был получен мутантный штамм Dioscorea deltoidea DM-0.

5 (мутаген – N- нитрозометилмочевина, доза – 0.

5 ммоль/ч) – сверх продуцент фуростаноловых гликозидов, высокая способность к синтезу – 6-8% в сухой массе клеток – сохранялась в течение длительного времени (около 30 лет).

Следует отметить, что метод индуцированного мутагенеза носит также эмпирический характер и не менее трудоемок, чем физиологические способы регуляции вторичного метаболизма.

Ряд перспективных культур был получен в результате генетической трансформации и других генно-инженерных манипуляций. Особенно следует отметить трансформанты, полученные с помощью плазмид агробактерий (Agrobacterium rhizogenes A.

Tumefaciens), в частности «бородчатых корней», продуктивность которых оказалась достаточно высокой.

Поскольку одной из основных причин снижения уровня биосинтеза в культурах in vitro является дедифференциация ткани, то один из путей повышения синтеза вторичных соединений в клеточных культурах связан с дифференцировкой ткани и органогенезом. Повышение содержания вторичных соединений было отмечено в органогенных культурах видов Senecio, Lichroa ledgeriana.

Известно, что физиологическое действие условий in vitro приводит к генетической гетерогенности системы. Речь идет о так называемой сомаклональной изменчивости, которая возникает при длительном культивировании.

На генетической изменчивости клеток в культуре in vitro основана селекция штаммов, обеспечивающая большой выход ценных продуктов вторичного метаболизма растительных клеток.

При клонировании суспензионной культуры клеток паслена были выделены линии, накапливающие больше 3% соланидина, получен штамм клеток руты душистой, содержащей в 20 раз больше алкалоида рутакридона по сравнению с растением.

Биотехнологическое использование клеточных культур в качестве сырья в промышленных масштабах становится реальностью.

В виде примеров можно привести производство шиконина из Lithospermum erythrorhison в Японии (фирма Toshiba) – ценного для косметики, пищевой промышленности и медицины растительного нафтохинонового пигмента. В России производство культуры ткани женьшеня («Биоженьшень») осуществляется на биохимических заводах.

Экстракт, получаемый из биомассы женьшеня, используется в качестве биологически активной добавки к кремам, лосьонам, а в пищевой промышленности – для приготовления тонизирующих напитков. Для получения ценного противоаритмического препарата аймалина на ХПХФО «Здоровье» (Харьков, Украина) организовано опытное производство биомассы культуры тканей Rauwolfia serpentina. Таким образом, возможности, открытые методом культуры тканей, позволили в настоящее время создать биотехнологическое производство принципиально новых видов сырья для получения необходимых соединений.

В лаборатории биохимии и биотехнологии растений также получены значительные результаты по получению культур растительных клеток – продуцентов экдистероидов. В начале 90-х годов были получены каллусные культуры Serratula coronata и Ajuga reptans – продуценты экдистероидов.

Полученные штаммы различались по степени соответствия интактным растениям по количественному составу экдистероидов и соотношению индивидуальных компонентов. Если в клеточных культурах S. Coronata наблюдали заметное снижение уровня биосинтеза по сравнению с интактными растениями (20-100 раз), то ряд каллусных культур A.

Reptans по суммарному содержанию экдистероидов не уступал дикорастущим растениям. Для обеих клеточных культур была отмечена тенденция к снижению уровня синтеза экдистероидов с увеличением продолжительности культивирования, однако были выявлены штаммы и со стабильным уровнем синтеза. Среди длительно культивируемых каллусных культур S. Coronata и A.

Reptans были выявлены штаммы с относительно высоким содержанием 20-гидроксиэкдизона (экдистероида, обладающего высоким тонизирующим и ранозаживляющим действием), из которых в 1999 г. нами были получены суспензионные культуры.

Методы глубинного культивирования клеток высших растений в последние годы привлекают все больший интерес, поскольку этот метод обладает рядом преимуществ перед поверхностным культивированием (каллусными культурами): обеспечение одинаковых условий для всех клеток популяции, увеличение скорости их роста и биосинтетического потенциала, возможность автоматизации процессов.

Культуры клеток высших растений имеют две сферы применения:

1. Изучение биологии клетки, существующей вне организма, обуславливает ведущую роль клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений.

Популяциям растительных клеток присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференцированной активности генов) и физиологические.

При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции идет размножение клеток, фенотип и генотип которых соответствуют данным условиям выращивания, следовательно, популяция эволюционирует.

Все это позволяет считать, что культуры клеток являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока мало изучены. Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения;

2.

Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:

1) Получение биологически активных веществ растительного происхождения:

– традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);

– синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу;

– культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ. В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений других видов.

2) Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3) Получение безвирусных растений.

4) Эмбриокультура и оплодотворение in vitro часто применяются для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша, для получения растений после отдаленной гибридизации. При этом оплодотворенная яйцеклетка вырезается из завязи с небольшой частью ткани перикарпа и помещается на питательную среду. В таких культурах можно также наблюдать стадии развития зародыша.

5) Антерные культуры – культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.

6) Клеточный мутагенез и селекция. Тканевые культуры могут производить регенеранты, фенотипически и генотипически отличающиеся от исходного материала в результате сомаклонального варьирования. При этом в некоторых случаях можно обойтись без мутагенной обработки.

7) Криоконсервация и другие методы сохранения генофонда.

8) Иммобилизация растительных клеток.

9) Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

10) Конструирование клеток путем введения различных клеточных оганелл.

11) Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

12) Изучение системы «хозяин – паразит» с использованием вирусов, бактерий, грибов и насекомых.

Синтез вторичных метаболитов.

Вторичный метаболизм культивируемых клеток привлекает всё больше внимания исследователей, это обусловлено, прежде всего перспективностью промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений специализированного обмена растений. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с возрастающей остротой экологических проблем.

В медицине 25% всех применяемых лекарств содержат соединения растительного происхождения.

Если приплюсовать к этому потребности пищевой промышленности, парфюмерии, сельского хозяйства, то становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения в достаточном количестве.

Как показал почти полувековой опыт исследования вторичных соединений в клеточных культурах растений (с 1940 года), для этого необходимо решение многих фундаментальных проблем биологии культивируемых клеток. растение мутагенез метаболит

Наиболее серьёзной из них является разработка стратегии контроля синтеза вторичных соединений в культивируемых клетках растений. До сих пор неясно, возможна ли разработка единой стратегии или она должна быть специфической для разных классов вторичных соединений, или же индивидуальной для каждого конкретного случая.

Список использованной литературы

1. Артамонов В.И. Биотехнология – агропромышленному комплексу. М.: Наука, 1999. 160 с.

2.

Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦ и Г СО РАН, 1993. 241 с.

3. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. 334 с.

4. Биотехнология / Под ред. А.А. Баева. М.: Наука, 1994. 309 с.

5. Блинов А.Г. Бесклеточные белоксинтезирующие системы // Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990. С. 80-86.

6. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1994 г. 272 с.

7. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1994. 272 с.

8. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1996. 286 с.

9. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений. Алматы: Конжык, 1996. 272 с.

10. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений. М.: Наука, 1991. С. 37-50.

11. Кирай З., Барабаш З. Результаты и перспективы использования биотехнологии в растениеводстве и защите растений // Международный агропромышленный журнал. 1990. №3. С. 7-10.

Размещено на Allbest.ru

Источник: https://revolution.allbest.ru/biology/00402236_0.html

Технологии культивирования клеток животных и растений

Культивирование клеток тканей животных и растений: Центральной ведущей стадией, определяющей успех всего производства в

⇐ ПредыдущаяСтр 16 из 41Следующая ⇒

Биотехнология растений – одно из основных направлений биотехнологии.

Ее основная цель заключается в создании новых сортов растений, штаммов и разновидностей микроорганизмов, использование биологических процессов и организмов в производстве, в частности, для синтеза в промышленных масштабах кормовых белков, биологически активных веществ, аминокислот, в том числе и для нужд медицины.

Речь идет о современной биотехнологии, поскольку сама по себе биотехнология (как технология получения продуктов, содержащих живые организмы) существует довольно давно и является основой сельского хозяйства.

Для нового этапа развития биотехнологии характерно использование в культивировании клеток высших растений и животных клеточных органелл, ферментных и мультиферментных систем, искусственных форм жизни, созданных посредством генной и клеточной инженерии.

Биотехнология растений имеет три основных направления:- технологии, которые основываются на использовании культуры клеток, тканей и организмов растений. – ДНК-технологии – молекулярно-генетические методы анализа растений.- получение трансгенных растений.

Технология рекомбинантных ДНК (ее называют также молекулярным клонированием или генной инженерией) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществлять перенос генетического материала (дезоксирибонуклеиновой кислоты) из одного организма в другой.

Никакого единого, универсального набора методик здесь не существует, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят так: из организма – донора нужных генов – экстрагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (расщепляют, разрезают) и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирующий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция “клонирующий вектор–встроенная ДНК”). Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки). Получают специфический белковый продукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена. Предпосылками к созданию технологии рекомбинантных ДНК послужили многие открытия в области молекулярной биологии, энзимологии нуклеиновых кислот и молекулярной генетики бактериальных вирусов и внехромосомных элементов бактерий (плазмид). Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью целого арсенала ферментов – обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложнейшего процесса.Вводя в геном растений чужеродные гены и обеспечивая их экспрессию, можно относительно быстро создавать новые сорта растений. Уже получены трансгенные растения, устойчивые к неблагоприятным условиям окружающей среды, к насекомым-вредителям, вирусам, гербицидам, окислительному и солевому стрессам. Выведены культуры с необычной окраской цветков, растения, имеющие более высокую пищевую ценность, растения с измененным вкусом плодов и т.д. Некоторые растения удалось модифицировать так, что они стали своеобразными фабриками по крупномасштабному синтезу ценных белков, например антител. Многочисленные трансгенные растения с измененными свойствами и повышенной пищевой ценностью прошли успешную проверку в лабораторных, а некоторые из них – в полевых условиях. К настоящему времени на рынок поступило лишь небольшое число генетически модифицированных растений, однако можно с уверенностью сказать, что в будущем они займут на нем достойное место.Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (трансгеназа) основана на введении клонированного гена в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого с помощью микроинъекции вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши, имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных

Отделение биомассы.

Первым этапом в процессе очистки целевого продукта является разделение культуральной жидкости и клеточной биомассы — сепарация. В некоторых случаях сепарации предшествует специальная обработка реакционной смеси, способствующая более эффективному отделению биомассы и стабилизации выделяемого продукта. Применяются различные методы сепарации.

1.Флотация. Метод используется в том случае,если клетки продуцента в силу низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях содержимого биореактора.

Особые устройства (флотаторы) различной конструкции удаляют образующуюся при культивировании пену вместе с прилипшими к пузырькам газа клетками. Повышение эффективности отбора биомассы достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя механическим путем.

Достоинствами метода является его экономичность, высокая производительность и возможность использования в непрерывных процессах.

2.Фильтрация. Различны применяемые в настоящее время фильтрующие системы (барабанные, ленточные, тарельчатые фильтры, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы,

мембранные фильтры) основаны на одинаковом принципе – задержке биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Недостатком способа является налипание клеток на фильтре, слой которых снижает скорость протока жидкости в процессе фильтрования.

Для фильтров непрерывного действия предусматриваются систем автоматической очистки от биомассы, забивающей поры

3. Центрифугирование.

Данный способ требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование, поэтому он применяется если: а) суспензия фильтруется слишком медленно; б) возникает необходимость максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся в ней частиц; в) требуется обеспечить непрерывный процесс сепарации, когда фильтры рассчитаны на периодическое действие. Центрифугирование и фильтрация в некоторых биотехнологических процессах осуществляется в комбинации.

⇐ Предыдущая11121314151617181920Следующая ⇒

Date: 2016-11-17; view: 220; Нарушение авторских прав

Источник: https://mydocx.ru/12-120756.html

5. Культивирование животных и растительных клеток

Культивирование клеток тканей животных и растений: Центральной ведущей стадией, определяющей успех всего производства в

Особенностикультивирования животных клеток

Животныеклетки используются для культивированиявирусов, при производстве вакцин, дляполучения интерферона и т.д.

Суспензиюотдельных клеток получают обработкойразмельченной ткани эмбрионапищеварительным ферментом трипсином.Если клеткам в такой суспензии датьосесть на плоскую поверхность в сосудес питательной средой, то клетки становятсяплоскими и делятся, образуя монослой.В обычной методике культивированияпользуются цилиндрическими бутылями,которые медленно вращаются вокруг своейдлинной оси.

Рост клеток и выход биомассыможно увеличить, добавив к суспензииноситель – микроскопические гранулыиз инертного синтетического полимера,на которых клетки закрепляются. Делениеклеток млекопитающих происходит примернораз в сутки (для сравнения – клеткидрожжей делятся каждые 1,5-2 ч, а бактериальныеклетки – каждые 20-60 мин).

Клеткимлекопитающих нуждаются в многочисленныхпитательных веществах, поэтому впитательную среду следует добавлятьсмесь аминокислот, пуринов и пиримидиновдля синтеза белков и нуклеиновых кислот,глюкозу в качестве источника углеродаи энергии, витамины и минеральные солидля поддержания необходимого осмотическогодавления и значения рН, близкого к 7,2.

Среда также должна содержать небольшиеконцентрации антибиотиков для подавленияроста бактерий и 5-20 % сыворотки (из кровичеловека или из плода крупного рогатогоскота). Для оптимального роста температурукультуры необходимо поддерживать около37 ºС, так как ниже 36 ºС клетки либо делятсякрайне медленно, либо не делятся вовсе;при температуре выше 38 ºС погибают.

Большинство культур клеток млекопитающих,в том числе и клеток человека, удаетсясохранять неопределенно долгое времязамороженными в специальной среде при- 180 ºС.

Особенностикультивирования растительных клеток

Культивированиерастительных клеток в крупных масштабахбыло освоено в 1976 г. японскимиисследователями, которым удалосьполучить растительную биомассу в объеме20 м3.Получение массы растительных клетокобходится намного дороже, чем равноеколичество бактериальных или дрожжевыхклеток.

Поэтому ученые стараются избежатьразрушения клеток с целью извлеченияиз них полезных для человека соединений.В связи с этим, растительные клеткииммобилизуют внутри пористых полимеров.Доказано, что в таком состоянии клеткиудается поддержать жизнеспособными втечение нескольких сотен дней.

Проблемойостается извлечение метаболитов в томслучае, когда они синтезируются внутриклеток, а не выделяются в среду.

Культурырастительных клеток применяют длясинтеза различных веществ: алкалоидови других вторичных метаболитов,фитогормонов (регуляторов роста растений)и т.д.

Использованиерастительных клеток является перспективнымнаправлением биотехнологии, так какклетки, растущие в культуре, способнысинтезировать вещества, которые необнаруживаются в целом растении.

Процессыбиотехнологических производствразнообразны, но все они имеют пятьобщих основных стадий, которые могутразличаться в зависимости от целевогопродукта и способа его получения.

Основные стадии следующие: приготовлениепитательной среды; получение посевногоматериала; культивирование микроорганизмов;выделение целевого продукта; очисткацелевого продукта.

Общая биотехнологическаясхема производства продуктов микробногосинтеза приведена на рис.3.

6.Приготовлениепитательной среды

Задачаспециалиста, оптимизирующего составсреды для конкретного вида микроорганизма,- выбрать такие источники углерода,азота, фосфора и других веществ, которыенаиболее оправданы в экономическом иэкологическом отношениях.

Принципсоставления питательных сред.Каждый конкретный вид микроорганизмов,используемых в биотехнологии, строгоизбирателен к питательным веществам.Потребность микроорганизма в тех илииных соединениях определяетсяфизиологическими особенностями данноговида микроба, но во всех случаях средадолжна быть водным раствором этихвеществ и обеспечивать в определенномколичестве их приток в клетку.

Всамом приближенном виде физиологическиепотребности микроорганизма в питательныхвеществах можно выявить, определивхимический состав микробной клетки.

Однако в этом случае не учитываютсяколичество и состав метаболитов,удаленных клеткой во внешнюю среду, ито обстоятельство, что состав клеточноговещества микроорганизма зависит отсостава среды обитания и варьирует вдостаточно широких пределах.

Но все же,первоначальную ориентировку в выбореоптимального состава питательной среды,исходя из состава клеточного веществамикроба, сделать можно.

Важнейшимусловием приготовления питательныхсред является соблюдение правиласептики.Для обеззараживания питательных средприменяют, как известно, химическоевоздействие (дезинфекцию), воздействиетемпературы и других физических факторов(ультразвука, ультрафиолетовых лучей,ультрафильтрации).

Каждый из этих методоввесьма избирателен. В биотехнологиишироко применяют термические методыобеззараживания питательных сред(автоклавирование, стерилизацию,кипячение и др.).

Споры микроорганизмовболее устойчивы к высокой температуре,поэтому именно споры бактерий являютсялимитирующим фактором, определяющимтемпературные режимы стерилизациисред.

Длястерилизации воздуха в случае аэробныхпроцессов культивирования используютфильтрование и ультрафиолетовоеоблучение.

Получениепосевного материала

Поддержаниечистой культуры штамма-продуцента -ключевая задача любого биотехнологическогопроизводства. Культурымикроорганизмов-продуцентов заводыполучают из коллекций в пробирках наагаризованных питательных средах илив ампулах.

Чистая культура микроорганизмаможет постоянно или по мере необходимостииспользоваться в производстве. Придлительном хранении чистых культурмогут происходить случайные нерегулируемыемутации.

Для избежания мутаций следуетне только соблюдать правила храненияи поддержания исходной культуры, но ипериодически проводить пересев культурыи проверку ее однородности как поморфологическим, так и по физиологическимпризнакам.

Посевнымматериалом (инокулятом)называют чистую культуру микроорганизма,которую получают путем ее последовательногопересева из пробирки в колбу, а затем ваппараты увеличивающегося объема доколичества, необходимого для промышленногопроизводства. Сначала чистую культуруразмножают в лаборатории, затем в цехечистых культур и инокуляции, далеенаправляют на культивирование.Приготовление посевного материаласостоит из следующих стадий:

1.Получение культуры микроорганизма вмикробиологической лаборатории завода.

2.Выращивание микроорганизмов в маломпосевном аппарате.

3.Выращивание микроорганизмов в большомпосевном аппарате.

4.Накопление культуры микроорганизмовв малом ферментере.

Передачучистых культур из одного аппарата вдругой осуществляют в конце логарифмическойфазы роста. Качество полученногопосевного материала контролируют путеммикроскопирования.

Вбиотехнологии широко применяютсяплесневые грибы, дрожжи, актиномицеты(грамположительныебактерии, не образующие спор), бактериии водоросли в виде чистых и смешанныхкультур.

В традиционных процессахферментации предпочтение обычно отдаетсясмешанным культурам, а в большинствесовременных ферментационных процессов– монокультурам (чистым культурам),выращиваемых в асептических условиях.

Большинство используемых сегоднякультур получено из природных источников,однако затем эти культуры были улучшеныили путем выращивания в условиях,характерных для данного процесса (дляповышения выхода биомассы и первичныхметаболитов), или с помощью мутагенезаили генетической инженерии (дляпроизводства вторичных метаболитов).

Ферментация(культивирование)

Этосамый важный и продолжительный этапбиотехнологического производства.

Ферментация представляет собойсовокупность последовательных операцийот внесения в заранее приготовленнуюи термостатированную питательную средупосевного материала до завершенияпроцессов роста и биосинтеза вследствиеисчерпывания питательных веществ среды.

Существует два основных типа ферментаций:получение биомассы микроорганизмов иполучение ценных веществ (метаболитов),возникающих в ходе роста или на последующихстадиях развития культуры.

Какговорилось ранее (п.1), для выращиваниялюбой культуры необходимы: жизнеспособныйпосевной материал; источники энергиии углерода; питательные вещества длясинтеза биомассы; отсутствие ингибиторовроста; соответствующие физико-химическиеусловия.

Наоптимальной питательной среде приблагоприятных значениях рН и температуры,при условии подачи требуемого количествавоздуха в среду микроорганизмы быстроначинают расти и размножаться, обеспечиваянакопление биомассы продуцента ибиологически ценных метаболитов вкультуральной жидкости. Способыферментации мы рассматривали ранее вразделе 4.

Длякультивирования микроорганизмов впромышленных масштабах применяютферментеры(или ферментаторы)– реакционные емкости, в которых приопределенных условиях находятсямикроорганизмы.

Основное назначениеферментатора – своевременно обеспечитьмикробные клетки необходимыми питательнымивеществами и кислородом (при необходимости)и отвести продукты обмена веществ,создать однородный состав среды приусловии слабого потока культуральнойжидкости (при непрерывном культивировании).

Для поддержания кислородного режимаферментатор снабжается устройствомподвода воздуха, для лучшего перемешиваниясреды – мешалками различной конструкции.Для поддержания температуры средыпредусмотрены системы охлаждения.

Источник: https://studfile.net/preview/3218013/page:4/

Культуры клеток и тканей растений и животных

Культивирование клеток тканей животных и растений: Центральной ведущей стадией, определяющей успех всего производства в

Несмотря на успехи, достигнутые в области использования различных микроорганизмов, микробная биотехнология имеет целый ряд существенных недостатков.

Прежде всего это невозможность получения целых классов жизненно важных для человека соединений, таких как алкалоиды, стероиды, многие полифенолы и терпеноиды, поскольку в природных сообществах микроорганизмов не найдены продуценты этих веществ.

По той же причине ограничены и возможности биотрансформационных процессов с участием микроорганизмов.

Другим объектом биотехнологического производства, помимо одноклеточных микроорганизмов могут выступать специально культивируемые клетки и ткани высших растений и животных. Эта область биотехнологии стала развиваться относительно недавно, последние 30-40 лет. Однако идеи и первые попытки их реализации возникли еще в конце XIX века.

В конце XIX – начале XX в. немецкие ученые X. Фехтинг (1892), С. Рехингер (1893), Дж. Хаберландт (1902) сделали первую неудачную попытку стимуляции роста растительных тканей и органов, помещенных на фильтро­вальную бумагу, пропитанную сахарозой. Несмотря на отсутствие положительного результата, их работы представляют большой инте­рес.

В них были высказаны идеи, которые намного опередили раз­витие науки того времени и которые нашли свое подтверждение несколько десятилетий спустя. Так, Фехтинг предположил, что полярность присуща не только организму или органу растения, но и самой клетке. Рехингер определил минимальный размер сег­мента, образующего каллус.

Согласно его исследованиям, в кусочках ткани тоньше 1,5-2,0 мм клетки не делились. Хаберланд впервые четко сформулировал идеи о возможности культивирования in vitro изолированных клеток растений и о тотипотентности кле­ток, т. е. способности любой соматической клетки полностью реализовывать свой потенциал развития.

Иначе говоря, о способнос­ти каждой растительной клетки давать начало целому организму.

Первые успехи были получены в 1922 г. американским ученым В.Роббинсом и немецким ученым В. Котте. Независимо друг от друга они показали возможность выращивания меристем кончи­ков корней томатов и кукурузы на синтетической питательной среде. Считается, что их работы легли в основу метода культуры изолированных корней растения.

В 1907г. Р.Гаррисон открыл новый путь изучения живой клетки многоклеточных организмов, показав, что клетки зачатка нервной системы зародыша лягушки в капле лимфы остаются живы­ми, дифференцируются, из них вырастают нервные волокна.

Этим было положено начало созданию метода культуры животных клеток, который, главным образом благодаря работам Карреля, послужил мощ­ным толчком к дальнейшему развитию цитологии и биотехнологии. Метод культуры клеток используется и развивается в самых раз­личных направлениях.

С его помощью был, прежде всего, получен очень важный результат; было доказано, что, подобно бактериям и простейшим, клетки многоклеточных организмов могут развивать­ся в культуре в течение неопределенно долгого времени.

Каррелевская культура клеток сердца эмбриона курицы поддерживалась путем пересевов в питательной среде, содержащей эмбриональный экстракт и плазму крови, с 1912 по 1946 г, за что ученый был удостоен Нобелевской премии.

Дальнейшие успехи в разработке метода культур клеток были обуслов-лены, главным образом, созданием и усовершенствованием питательных сред, содержащих необходимые для жизни клеток ве­щества. Настоящее развитие метода культуры тканей и клеток высших растений началось в 1932 г. с работ французского ученого Р.

Готре и американского исследователя Ф.Уайта. Они показали, что при периодической пересадке на свежую питательную среду кончики корней могут расти неограниченно долго. Кроме того, ими были разработаны методы культивирования новых объектов: тканей древесных растений камбиального происхождения, каллусных тканей запасающей паренхимы (Р.

Готре), а также тканей расти­тельных опухолей (Ф.Уайт). С этого момента начинаются массо­вые исследования по разработке новых питательных сред, вклю­чающих даже такие неконтролируемые компоненты, как березо­вый сок или эндосперм кокоса, и по введению в культуру новых объектов. К 1959г.

насчитывалось уже 142 вида высших растений, выращиваемых в стерильной культуре.

В 1955 г. после открытия Ф. Скугом и С. Миллером нового клас­са фитогормонов – цитокининов – оказалось, что при совмест­ном их действии с другим классом фитогормонов – ауксинами – появилась возможность стиму-лировать деление клеток, поддер­живать рост каллусной ткани, индуцировать морфогенез в конт­ролируемых условиях.

Основы использования клеток человека и животных в биотехнологии были заложены в 1949 г, когда группе американских ученых удалось вы­растить вирус полиомиелита в культивируемых клетках кожи и мышц человеческого зародыша. Теперь уже не представляет проб­лемы производство в ферментерах клеточных культур, содержащих вирус.

Существуют клетки, которые используют для выращивания: вирусов во всем мире. Это клетки HeLa (карцинома шайки матки человека), BHK-2I (почка эмбрионов хомяка) и Vero (почка зе­леной мартышки).

Благодаря применению метода клеточных культур вирусы стали выделять в чистом виде, что позволило усовершен­ствовать методы диагностики вирусных заболеваний и самое главное – получить вакцины, такие, например, как против ящура, оспы, кори, полиомиелита.

Культуры клеток, тканей или органов широко использовались и используются сейчас в научных исследованиях. Они являются методом сохранения жизнеспособности или выращивания вне организма от­дельных клеток, а также организованных структур (ткани, ор­ганы, эмбрионы) сохраняющих свою дифференцировку.

С того вре­мени, как ученые нашли способ выделения чистых клеточных ли­ний, метод культуры клеток стал идеальным способом изучения строения и свойств живых клеток.

Культуры клеток, получаемые современными методами, представляют собой гомогенные популяции генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях.

Культивируемые клетки дают возможность изучать прижизнен­ное (витальное) состояние клеток методом микроскопии. На жи­вотном или растении можно определить состояние клеток организма только в конце эксперимента, удалив клетки из организма животного.

С помощью культур клеток изучают межтканевые и межклеточные взаимодействия, дифференцировку, рост, деление клеток, их вирусную трансформацию, особенности обмена веществ в живых клетках, потребности их в питании, методы клонирования и хранения, чувствительность к различным веществам, в том числе лекарст­вам, ядам. Культуры клеток обеспечивают реальные значения ско­рости включения и метаболизма исследуемых соединений в клетках, поскольку отсутствует метаболизм этих веществ печенью, запаса­ние их в мышцах, экскретирование почками. На клетках культур делают различные операции: удаляют части клетки, вводят в нее вирусы, проводят генетические эксперименты. Органные культуры используются при изучении закономерностей развития зачатков ор­ганов в норме и в эксперименте, при совместном культивировании органов от разных особей одного или нескольких видов, а также для изучения способов сохранения жизнеспособности изолирован­ных органов и тканей, предназначенных для пересадки (трансплан­тации).

Культуры клеток животных и человека могут служить и уже служат идеальным источником различных биологически активных веществ: ферментов, антигенов, онкогенных и моноклональных антител, гор­монов, инсулина, интерферона.

Многие из этих препаратов, например, половые гормоны, инсулин, интерферон, антитела, получаемые от животных, или генноинженерными методами из микроорганизмов не обладают достаточной специфичностью или алергенны, поэтому малоэффективны для человека.

Однако попытки получения полезных веществ с помощью культур клеток часто заканчиваются неудачей. Многие клетки животных и особенно человеческие плохо размножают­ся в культуральной среде, а если и растут, то в большинстве случаев теряют способность к синтезу специфического продукта.

Поэтому основным направлением исследований в настоящее время является разработка методов культивирования, позволяющих клеткам сохранять и усиливать ценные специфические функции, в течение длительного времени выращивания.

Одними из самых эффективных методов получения стабильных, долго живущих и относительно неприхотливых к условиям культивироввания клеточных культур является их трансформация (обработка некоторыми химическими реактивами или инфицирование их онковирусами) или получение гибридных клеток (гибридом) путем слияния их с некоторыми опухолевыми клетками.

В отличие от вышесказанного, промышленная реализация возможностей культивирования клеток и тканей растений достигла в настоящее время гораздо больших результатов.

Во многих странах запущены промышленные производства лекарственных веществ, красителей, витаминов, основанные на различных способах культивирования растительных клеток.

Начало было положено японскими фирмами, запустивших в начале 80-х годов ХХ века промышленное производство красителя шиконина и убихинона-10. В СССР было налажено промышленное производство биомассы клеток женьшеня.

Использование культур клеток и тканей как источника сырья для производства различных первичных и вторичных метаболитов имеет целый ряд преимуществ, по сравнению с традиционно используемыми источниками (дикие и культурные растения и животные, живые люди-доноры и органы, извлекаемые из трупов).

1.Возможность круглогодичного выращивания необходимого количества биомассы клеток и тканей.

2.Независимость от климатических и географических факторов.

3. Быстрота накопления целевого продукта (многие растения и животные растут и развиваются в течение десятков лет (женьшень)).

4. Стандартность и более высокое качество сырья.

5. Освобождение земельных площадей, техники и людей, занятых в сельском хозяйстве.

6. Возможность автоматизации и механизации технологических процессов, снижение доли ручного труда.

7. Освобождение страны от импорта сырья.

8. Сохранение редких и исчезающих видов животных и растений, улучшение экологической обстановки.

Существует 3 основных направления создания новых технологий на основе культивируемых клеток и тканей растений.

Первое из них – использование результатов исследования биологии растительной клетки и методов клеточной и генной инженерии для генетического изменения клетки и получения на ее основе нового растения.

Второе – получение ценных биологически активных веществ растительного происхождения в промышленных масштабах путем культивирования клеток и тканей растений. Третье –использование культур клеток и тканей для быстрого микроклонального размножения и оздоровления растений.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/4_8348_kulturi-kletok-i-tkaney-rasteniy-i-zhivotnih.html

Культивирование растительных клеток

Культивирование клеток тканей животных и растений: Центральной ведущей стадией, определяющей успех всего производства в

В 1922 году В. Роббинс и Котте независимо друг от друга показали возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы корня томатов и кукурузы.

Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений. В 30-60-е годы ХХ века благодаря работам большого числа ученых (Ф. Уайт, Р.

Готре и других) число видов растений, клетки и ткани которых выращивали in vitro, превысило 150.

Были описаны составы питательных сред, определены потребности культур в витаминах и стимуляторах роста, разработаны методы получения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а также культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки.

С использованием изолированных протопластов были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью полиэтиленгликоля и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий.

С помощью метода культуры меристем были получены безвирусные экономически важные растения с высоким коэффициентом размножения.

В настоящее время активно продолжается разработка методов глубинного культивирования клеток, слияния изолированных протопластов и т. д. Такие исследования привели к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных, лекарственных, декоративных и других растений.

11.1. Методы создания клеточных культур растений

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань, представляет один из типов клеточной дифференцировки, присущей высшему растению.

Для растения каллус является тканью, возникающей при исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей непродолжительное время. Эта ткань защищает травмированное место, накапливает питательные вещества для анатомической регенерации или генерации утраченного органа.

Значительно реже культивируют клетки опухолей растений различного происхождения. Культуры опухолевых клеток независимо от способа культивирования на уровне морфологии мало отличаются от культур каллусных клеток.

Важным физиологическим отличием между ними является гормононезависимость опухолевых клеток, позволяющая им делиться и расти на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Однако опухолевые клетки лишены способности давать начало нормально организованным структурам.

Для получения культивируемых каллусных клеток in vitro фрагменты тканей разных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий.

Клетки специализированных тканей, эксплантированных на питательную среду, должны дедифференцироваться, то есть потерять структуры, характерные для их специфической функции в растении, и вернуться к состоянию делящейся клетки.

Часто эксплант, используемый для получения каллуса, включает ткани, клетки которых различно дифференцированы.

В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех типов РНК, исчезают тканеспецифические белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и каллусной ткани. Это свидетельствует об изменении активности генов и белкового аппарата клеток при де- дифференцировке.

Образование каллуса не во всех случаях связано с травматическим воздействием. Каллус может возникнуть в результате пролиферации внутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза. Растущий каллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности.

Первичный каллус, возникший на эксплантах через 4-6 недель (в зависимости от скорости роста клеток), переносится на свежую питательную среду (субкультивируется).

Различно дифференцированные клетки (в том числе и меристематические) переходят in vitro к сложному процессу дедифференциации, теряют присущую им структурную организацию и специфические функции и индуцируются к делению, образуя первичный каллус. В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями.

Основными компонентами питательных сред для культуры клеток и тканей растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста. Иногда в состав питательных сред включают комплексные органические добавки (гидролизат казеина или смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, экстракты из разных органов растений).

11.2. Методы выращивания культуры каллусных тканей

11.2.1. Поверхностное культивирование

Культура каллусных тканей выращивается поверхностным способом на полужидкой агаризованной среде (концентрация агара – 0,6-1 %), среде с применением других желирующих полимеров либо на мостиках из фильтровальной бумаги или дисках из пенополиуретана, погруженных в жидкую питательную среду.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым или красным; пигментированным полностью или зонально.

Как правило, в длительной пересадочной культуре каллусные ткани теряют пигментацию и становятся более рыхлыми.

Каллусные клетки, выращиваемые поверхностным способом, часто применяют для сохранения в растущем состоянии коллекций разных штаммов, линий, мутантов, для регенерации растений, из них также получают суспензии клеток, культивируемых в жидкой питательной среде.

11.2.2. Суспензионное культивирование

Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными (глубинными) культурами. Существуют определенные проблемы получения культуры, состоящей преимущественно из отдельных клеток или небольших их агрегатов. Для решения этих проблем используют методы получения клеточной суспензии применительно к растительным клеткам.

Выращивание клеточных суспензий в жидкой питательной среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием каллусных клеток поверхностным способом.

Суспензионные культуры удобнее для проведения биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов и связи их с событиями клеточного цикла, экспрессии и репрессии определенных генов, изолирования и характеристик мутантов.

Суспензионную культуру можно получить из фрагментов органа растения (диски паренхимы и др.), хотя этот путь более трудоемкий и требует большего времени. Клетки экспланта должны при этом образовывать первичный каллус, и только после этого поверхностные каллусные клетки, попавшие в жидкую среду и размножившиеся в ней, дадут начало линии, способной расти в суспензии.

Обычно для получения культуры клеток используется культура каллусной ткани. Для получения культуры клеток берется наиболее жизнеспособная (пролиферирующая) часть каллусной ткани, а ее количество в расчете на единицу объема питательной среды должно быть в 15-20 раз больше, чем при серийном культивировании на агаре.

При этом может использоваться питательная среда того же состава, что и для поверхностного культивирования.

Образование первичной суспензии растительных клеток может быть результатом трех процессов:

– распада каллусной ткани на клетки и небольшие клеточные агрегаты в момент внесения в жидкую питательную среду;

– отделения клеток и клеточных агрегатов с поверхности кусочков ткани в течение первых субкультивирований;

– деления и роста клеток и распада разрастающихся клеточных агрегатов на более мелкие агрегаты и клетки.

Первичную суспензию перед субкультивированием разделяют на фракции по скорости седиментации, используя специальный цилиндр (берут верхнюю фракцию), либо фильтруют через 1-2 слоя марли, нейлоновые или металлические сита, чтобы избавиться от крупных плотных кусков каллусной ткани, остатков экспланта и очень крупных агрегатов.

Для глубинного культивирования растительных клеток применяют методы, разработанные для микробиологических целей. Используют закрытые или открытые системы в периодическом или проточном режимах. Однако при глубинном выращивании растительных клеток принцип турбидостата практически не применяется.

Одной из причин этого является разрушения части клеток при отводе их к оптическому прибору.

Выращивание суспензии клеток растений в установках непрерывного культивирования по принципу хемостата применяется как для изучения метаболизма клеток, стабильно поддерживающихся в разных фазах клеточного цикла, так и при промышленном выращивании клеточной биомассы с целью получения экономически важных продуктов.

Наиболее изученным и распространенным режимом глубинного культивирования клеточных суспензий в настоящее время является закрытая периодическая система.

В этом случае для аэрации и перемешивания суспензии используют роллеры, качалки (обычно круговые), ферментеры с механическими и магнитными мешалками или ферментеры барботажного типа, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком. Критериями роста в цикле выращивания служит увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы.

Модельная ростовая кривая имеет типичную S-образную форму, на которой различают: I – лаг-фазу; II – экспоненциальную фазу; III – фазу линейного роста; IV -замедленного роста; V – стационарную фаза; VI – фазу отмирания (рис. 11).

Рис. 11. Кривая роста клеточных суспензий в закрытой периодической системе

В латентной фазе (лаг-фазе) видимого роста инокулята не наблюдается. При этом наблюдается высокая интенсивность дыхания, максимальные значения энергетического уровня, интенсивный синтез ДНК, РНК, белков и других компонентов клетки, но низкий митотический уровень.

Длительность фазы зависит от количества и физиологического состояния инокулята и условий культивирования. Экспоненциальная фаза характеризуется максимальными скоростью роста и величинами митотической активности, а также преобладанием мелких клеток меристематического типа.

На протяжении линейной фазы скорость роста постоянна. Фаза замедленного роста связана с субстратным лимитированием и ингибированием продуктами обмена. Для стационарной фазы характерна малая скорость деградации клеток, которая уравновешивается делением клеток.

В фазе отмирания клеток удельная скорость роста принимает отрицательное значение.

Форма реальных ростовых кривых может значительно отличаться продолжительностью фаз от модельной.

Процессы ростового цикла зависят от вида растения, количества внесенного материала и условий культивирования (состав питательной среды, температура, начальное значение рН, состав газовой фазы, скорость перемешивания).

Первичный и вторичный метаболизм культивируемых клеток растений видоспецифичен, зависит от типа дифференцировки исходных клеток растения и регулируется условиями выращивания.

Генетическая изменчивость клеток как следствие их культивирования вне организма приводит к возникновению из первичной каллусной ткани генетически и фенотипически различающихся линий клеток. Это позволяет отобрать или экспериментально создать линии, сохраняющие биосинтетические системы, характерные для исходного растения, и линии, синтезирующие принципиально новые вещества.

11.3. Культивирование отдельных клеток

Источником отдельных клеток являются клеточные суспензии в жидкой питательной среде, мацерация (мацерация – размягчаю; разъединение клеток в результате растворения межклеточного вещества) тканей растений, изолированные протопласты после восстановления ими клеточной стенки. Причем изолированные протопласты являются идеальными отдельными клетками.

Культивирование отдельных клеток позволяет получать клоны и исследовать генетическую и физиологическую стабильность или изменчивость при выращивании клонового материала. Отдельные клетки важны для клоновой селекции мутантных, гибридных, трансформированных линий. Обычно в эти клетки вводят маркерные гены или создают маркерные признаки для обеспечения селективных условий отбора.

Мацерированные клетки ткани растения являются хорошей моделью для сравнительного изучения физиологических процессов в ткани и отдельной клетке.

Вместе с тем при культивировании этих клеток на среде, стимулирующей деление клеток, они дифференцируются и образуют колонии каллусных клеток.

Для получения отдельных мацерированных клеток используют специальные мацерирующие ферментативные препараты.

Отдельные клетки также могут быть получены из суспензий с использованием микроманипулятора, проточного цитофлуюориметра или путем последовательных разбавлений.

Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, причем объем среды должен быть минимальным. Однако даже при соблюдении всех этих условий процент разделившихся клеток остается очень низким. Более эффективны методы «кормящего слоя» или «ткани-няньки». Для создания «кормящего слоя» берут суспензию клеток того же вида растения.

Клеточная суспензия должна находиться в ранней стадии ростового цикла. Каллусная культура, служащая «тканью-нянькой», также должна быть в стадии активного роста.

При достижении колонией, выросшей из отдельной клетки, размера 0,5-1 мм, она может быть перенесена для дальнейшего выращивания на агаризованную питательную среду непосредственно либо на фильтр, помещенный на поверхность питательного агара.

Использование «кормящего слоя», «ткани- няньки» или минимального объема среды, в которую помещается отдельная клетка, связано с явлением, называемым «действие фактора кондиционирования». Несмотря на многочисленные попытки определить природу веществ, индуцирующих деление отдельной клетки и механизм действия фактора кондиционирования, данный вопрос окончательно не решен.

11.4. Протопласты растительных клеток

11.4.1. Методы выделения растительных протопластов

Протопласты растений – это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, несущие внутриклеточные органоиды, характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм и выполнять биосинтез и трансформацию энергии. Впервые выделение растительных протопластов было осуществлено в 1892 году Дж. Клеркером.

Наиболее простыми, хотя длительными и трудоемкими методами получения растительных протопластов являются механические.

При этом фрагмент растительной ткани вносят в концентрированный раствор сахарозы, выдерживают до тех пор, пока протопласты не сожмутся и не отойдут от клеточных стенок, а затем аккуратно рассекают эпидермис, и протопласты выходят в среду.

Однако при применении даже модифицированных механических методов можно получить только ограниченное число протопластов.

Принципиально отличный метод получения изолированных протопластов – энзиматический, при котором для удаления клеточной стенки используют ферменты.

В сравнении с механическим методом ферментативное выделение протопластов имеет определенные преимущества.

В этом случае сравнительно быстро и одновременно можно получать большое количество протопластов, которые не подвергнуты сильному осмотическому сжатию. При этом клетки становятся более интактными.

Для удаления клеточной стенки используются ферментные препараты трех типов: целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы – чаще всего грибного или бактериального происхождения.

В результате обработки тканей ферментными препаратами образуется смесь, содержащая протопласты, обломки разрушенных клеток и целые клетки.

Чтобы отделить протопласты от примесей, суспензию фильтруют через нейлоновые фильтры, а затем подвергают центрифугированию в мягких условиях.

Источником получения протопластов, помимо фрагментов растительных тканей, являются клеточные суспензии и каллусные культуры. Выделение протопластов достаточно легко выполнимая и технически хорошо отработанная процедура, однако сложность заключается в получении жизнеспособных протопластов и их дальнейшем культивировании.

Успех процесса зависит от многих факторов – состава и качества ферментов, рН среды, выбора осмотического раствора, состояния растительного материала, а также применяемых методов получения и культивирования протопластов.

Для стабильного получения большого количества протопластов важны стандартные условия выращивания исходных растений или клеток, определение оптимального для выделения протопластов возраста растения или органа, температуры, освещения, питания.

Для получения протопластов из суспензионных клеточных культур наилучшей является поздняя логарифмическая фаза роста, когда клеточные стенки лучше всего поддаются ферментативному разрушению, а протопласты наиболее жизнеспособны.

11.4.2. Культивирование растительных протопластов

Для культивирования протопластов можно использовать метод жидких капель, при котором суспензия протопластов (в виде капель в жидкой среде) помещается в пластиковые чашки Петри.

Метод обеспечивает хороший газообмен и диффузию в раствор экскретируемых продуктов и позволяет добавлять свежий раствор в нужной концентрации.

Однако в этом случае протопласты агрегируются в центре каждой капли и образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений. Метод также неудобен, если требуется исследовать развитие индивидуальной колонии протопластов.

Другой распространенный метод – метод агаровой культуры, при котором определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем аналогичной среды, содержащей 1 % агар-агара, расплавленного и охлажденного до 45°С. Чашки заклеивают пленкой (парафильмом) и культивируют при 28°С.

Протопласты фиксированы в одном положении и отдалены один от другого. Этот метод имеет важное преимущество, позволяя наблюдать все этапы развития конкретного протопласта: формирование клеточной стенки, деление клеток, рост и развитие растения.

Недостаток этого метода заключается в том, что возможно некоторое повреждение протопластов при смешивании с теплым агар-агаром.

Одним из вариантов данной методики является использование «кормящих» протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или гамма-излучения, которые смешиваются с жизнеспособными протопластами.

Причем доза облучения выбирается такой, чтобы клетки утратили способность к клеточному делению, но поддерживали и стимулировали рост других клеток.

Этот метод позволяет культивировать суспензию протопластов более низкой концентрации, чем та, что обычно необходима для их роста.

Похожим является метод совместных культур, используемый для трудно культивируемых протопластов. Такие протопласты культивируются совместно с протопластами, отличающимися быстрым ростом. Успех культивирования основан на активных веществах, которые выделяются быстрорастущими видами.

Удобным вариантом метода жидких капель является культивирование в малом объеме (до 1 мкл) единичных протопластов (микроизоляция). В микрокаплях соотношение объема клетки к объему питательной среды такое же, как в культуре плотностью около1000 кл/мл.

По питательным потребностям изолированные протопласты сходны с целыми клетками. Поэтому питательные среды подобны таковым для клеточных культур.

Поскольку центральная проблема при культивировании растительных объектов на искусственных питательных средах – создание определенной буферной емкости смеси, то обычно используют сопряженные пары солей, в которые объединяют химически и физиологически кислые и щелочные соли.

К основным сопряженным парам относятся соли, содержащие азот и фосфор. Среды содержат железо в хелатной форме и сахарозу как источник углерода. Для индукции деления протопластов эффективно добавлять в среду цитокинины. Температура культивирования является видоспецифичной и варьирует в широких пределах.

Температурный режим должен строго выдерживаться, так как протопласты чувствительны даже к незначительным отклонениям от оптимальной температуры. Оптимальные значения освещенности могут варьировать от абсолютной темноты до яркого света. Существенным фактором культивирования является плотность засева протопластов.

При низкой плотности протопласты часто не делятся, в то время как при очень высокой возникают затруднения на поздних этапах культивирования из-за появления в ростовой среде токсичных продуктов обмена. Оптимальная плотность протопластов в культуре составляет103 -105 кл/мл.

Таким образом, используя разнообразные методы, учитывая характерные особенности исходного материала и соблюдая все условия, можно осуществить культивирование растительных протопластов, добиваясь получения целого растения из единичных протопластов. Разработка техники культивирования растительных клеток, получения и культивирования растительных протопластов послужила основой для создания методов биологического конструирования растений с заданными свойствами.

Источник: https://lifelib.info/microbiology/growth/12.html

КУЛЬТУ́РА КЛЕ́ТОК И ТКА́НЕЙ

Культивирование клеток тканей животных и растений: Центральной ведущей стадией, определяющей успех всего производства в

Авторы: О. П. Кисурина-Евгеньева

КУЛЬТУ́РА КЛЕ́ТОК И ТКА́НЕЙ, клет­ки, ку­соч­ки тка­ней или за­чат­ков ор­га­нов, вы­ра­щен­ные вне ор­га­низ­ма (in vitro). В ос­но­ве вы­ра­щи­ва­ния кле­ток и тка­ней ле­жит стро­гое со­блю­де­ние сте­риль­но­сти и ис­поль­зо­ва­ние спец. пи­тат.

сред, обес­пе­чи­ваю­щих под­дер­жа­ние жиз­не­дея­тель­но­сти куль­ти­ви­руе­мых кле­ток и мак­сималь­но сход­ных со сре­дой, с ко­то­рой клет­ки взаи­мо­дей­ст­ву­ют в ор­га­низ­ме. Ме­тод по­лу­че­ния К. к. и т. яв­ля­ет­ся од­ним из важ­ней­ших в экс­пе­рим. био­ло­гии. К. к. и т.

мо­гут быть за­мо­ро­же­ны и со­хра­нять­ся дли­тель­ное вре­мя при темп-ре жид­ко­го азо­та (–196 °C). Ос­но­во­по­ла­гаю­щий экс­пе­ри­мент по куль­ти­ви­ро­ва­нию кле­ток жи­вот­ных про­вёл амер. учё­ный Р. Гар­ри­сон в 1907, по­мес­тив ку­со­чек за­чат­ка нерв­ной сис­те­мы за­ро­ды­ша ля­гуш­ки в сгу­сток лим­фы.

Клет­ки за­чат­ка ос­та­ва­лись жи­вы­ми неск. не­дель, из них вы­рас­та­ли нерв­ные во­лок­на. Со вре­ме­нем ме­тод был усо­вер­шен­ст­во­ван А. Кар­ре­лем (Фран­ция), М. Бер­ро­узом (США), А. А. Мак­си­мо­вым (Рос­сия) и др. учё­ны­ми, ис­поль­зо­вав­ши­ми в ка­че­ст­ве пи­тат. сре­ды плаз­му кро­ви и вы­тяж­ку из тка­ней за­ро­ды­ша.

В даль­ней­шем ус­пе­хи в по­лу­че­нии К. к. и т. бы­ли свя­за­ны с раз­ра­бот­кой сред оп­ре­де­лён­но­го хи­мич. со­ста­ва для куль­ти­ви­ро­ва­ния разл. ти­пов кле­ток.

Обыч­но они со­дер­жат со­ли, ами­но­кис­ло­ты, ви­та­ми­ны, глю­ко­зу, фак­то­ры рос­та, ан­ти­био­ти­ки, пре­ду­пре­ж­даю­щие за­ра­же­ние куль­ту­ры бак­те­рия­ми и мик­ро­ско­пич. гри­ба­ми. На­ча­ло соз­да­нию ме­то­да К. к. и т. у рас­те­ний (на ку­соч­ке фло­эмы мор­ко­ви) по­ло­же­но Ф. Стю­ар­дом (США) в 1958.

Для куль­ти­ви­ро­ва­ния кле­ток жи­вот­ных и че­ло­ве­ка мо­гут быть ис­поль­зо­ва­ны клет­ки раз­но­го про­ис­хо­ж­де­ния: эпи­те­ли­аль­ные (пе­чень, лёг­кие, мо­лоч­ная же­ле­за, ко­жа, мо­че­вой пу­зырь, поч­ка), со­еди­ни­тель­нот­кан­ные (фиб­роб­ла­сты), ске­лет­ные (кость и хря­щи), мы­шеч­ные (ске­лет­ные, сер­деч­ная и глад­кие мыш­цы), нерв­ной сис­те­мы (гли­аль­ные клет­ки и ней­ро­ны), же­ле­зи­стые клет­ки, сек­ре­ти­рую­щие гор­мо­ны (над­по­чеч­ни­ки, ги­по­физ, клет­ки ост­ров­ков Лан­гер­ган­са), ме­ла­но­ци­ты и разл. ти­пы опу­хо­левых кле­ток. Вы­де­ля­ют 2 на­прав­ле­ния их куль­ти­ви­ро­ва­ния: куль­ту­ра кле­ток и ор­ган­ная куль­ту­ра (куль­ту­ра ор­га­нов и тка­ней). Для по­лу­че­ния куль­ту­ры кле­ток – ге­не­ти­че­ски од­но­род­ной бы­ст­ро про­ли­фе­ри­рую­щей по­пу­ля­ции – ку­соч­ки тка­ни (обыч­но ок. 1 мм3) из­вле­ка­ют из ор­га­низ­ма, об­ра­ба­ты­ва­ют со­от­вет­ст­вую­щи­ми фер­мен­та­ми (для раз­ру­ше­ния меж­кле­точ­ных кон­так­тов) и об­ра­зую­щую­ся сус­пен­зию по­ме­ща­ют в пи­тат. сре­ду. Куль­ту­ры, по­лу­чен­ные из эм­брио­наль­ных тка­ней, ха­рак­те­ри­зу­ют­ся луч­шей вы­жи­вае­мо­стью и бо­лее ак­тив­ным рос­том (из-за низ­ко­го уров­ня диф­фе­рен­ци­ров­ки и на­ли­чия ство­ло­вых кле­ток-пред­ше­ст­вен­ни­ков в эм­брио­нах) по срав­не­нию с со­от­вет­ст­вую­щи­ми тка­ня­ми, взя­ты­ми из взрос­ло­го ор­га­низ­ма. Нор­маль­ные тка­ни да­ют на­ча­ло куль­ту­рам с ог­ра­ни­чен­ным вре­ме­нем жиз­ни (т. н. пре­дел Хейф­ли­ка), то­гда как куль­ту­ры, по­лу­чен­ные из опу­хо­лей, спо­соб­ны про­ли­фе­ри­ро­вать не­ог­ра­ни­чен­но дол­гое вре­мя. Од­на­ко да­же в куль­ту­ре нор­маль­ных кле­ток не­ко­то­рые клет­ки спон­тан­но им­мор­та­ли­зу­ют­ся, т. е. ста­но­вят­ся бес­смерт­ны­ми. Они вы­жи­ва­ют и да­ют на­ча­ло кле­точ­ным ли­ни­ям с не­ог­ра­ни­чен­ным сро­ком жиз­ни. Ис­ход­но кле­точ­ная ли­ния мо­жет быть по­лу­че­на из по­пу­ля­ции кле­ток или из отд. клет­ки. В по­след­нем слу­чае ли­нию на­зы­ва­ют кло­но­вой, или кло­ном. При дли­тель­ном куль­ти­ви­ро­ва­нии под воз­дей­ст­ви­ем разл. фак­то­ров свой­ст­ва нор­маль­ных кле­ток из­ме­ня­ют­ся, про­ис­хо­дит транс­фор­ма­ция, осн. при­зна­ка­ми ко­то­рой яв­ля­ют­ся на­ру­ше­ния мор­фо­ло­гии кле­ток, из­ме­не­ние чис­ла хро­мо­сом (ане­у­п­лои­дия). При вы­со­кой сте­пе­ни транс­фор­ма­ции вве­де­ние та­ких кле­ток жи­вот­но­му мо­жет вы­зы­вать об­ра­зо­ва­ние опу­хо­ли. В ор­ган­ной куль­ту­ре со­хра­ня­ют­ся струк­тур­ная ор­га­низа­ция тка­ни, меж­кле­точ­ные взаи­мо­дей­ст­вия, под­дер­жи­ва­ет­ся гис­то­ло­гич. и био­хи­мич. диф­фе­рен­ци­ров­ка. Тка­ни, за­ви­си­мые от гор­мо­нов, со­хра­ня­ют чув­ст­ви­тель­ность к ним и ха­рак­тер­ные от­ве­ты, же­ле­зи­стые клет­ки про­дол­жа­ют сек­ре­ти­ро­вать спе­ци­фич. гор­мо­ны и т. д. Та­кие куль­ту­ры вы­ра­щи­ва­ют в куль­ту­раль­ном со­су­де на пло­ти­ках (бу­маж­ных, мил­ли­по­ро­вых) или на ме­тал­лич. сет­ке, пла­ваю­щих на по­верх­но­сти пи­тат. сре­ды.

У рас­те­ний куль­ти­ви­ро­ва­ние кле­ток ос­но­ва­но в об­щем на тех же прин­ци­пах, что и у жи­вот­ных. Раз­ли­чия же в спо­собах куль­ти­ви­ро­ва­ния оп­ре­де­ля­ют­ся струк­тур­ны­ми и био­ло­гич. осо­бен­но­стя­ми кле­ток рас­те­ний. Боль­шин­ст­во кле­ток рас­тит.

тка­ней об­ла­да­ют то­ти­по­тент­но­стью: из од­ной та­кой клет­ки при оп­ре­де­лён­ных ус­ло­ви­ях мо­жет раз­вить­ся пол­но­цен­ное рас­те­ние. Для по­лу­че­ния куль­ту­ры рас­тит. кле­ток ис­поль­зу­ет­ся ку­со­чек лю­бой тка­ни (напр.

, кал­лу­са) или ор­га­на (кор­ня, стеб­ля, лис­та), в ко­то­ром при­сут­ст­ву­ют жи­вые клет­ки. Его по­ме­ща­ют на пи­тат. сре­ду, со­дер­жа­щую ми­нер. со­ли, ви­та­ми­ны, уг­ле­во­ды и фи­то­гор­мо­ны (ча­ще все­го ци­то­ки­ны и аук­си­ны). Рас­тит.

куль­ту­ры под­дер­жи­ва­ют при темп-рах от 22 до 27 °C, в тем­но­те или при ос­ве­ще­нии.

К. к. и т. на­хо­дят ши­ро­кое при­ме­не­ние в раз­ных об­лас­тях био­ло­гии и ме­ди­ци­ны. Куль­ти­ви­ро­ва­ние со­ма­тич. кле­ток (все клет­ки ор­га­нов и тка­ней за ис­клю­че­ни­ем по­ло­вых) вне ор­га­низ­ма оп­ре­де­ли­ло воз­мож­ность раз­ви­тия но­вых спо­со­бов изу­че­ния ге­не­ти­ки выс­ших ор­га­низ­мов с ис­поль­зо­ва­ни­ем, на­ря­ду с ме­то­да­ми клас­сич.

ге­не­ти­ки, ме­то­дов мо­ле­ку­ляр­ной био­логии. Наи­боль­шее раз­ви­тие по­лу­чи­ла мо­ле­ку­ляр­ная ге­не­ти­ка со­ма­тич. кле­ток мле­ко­пи­таю­щих, что свя­за­но с по­явив­шей­ся воз­мож­но­стью по­ста­нов­ки пря­мых экс­пе­ри­мен­тов с клет­ка­ми че­ло­ве­ка. К. к. и т. ис­поль­зу­ют при ре­ше­нии та­ких об­ще­био­ло­гич.

про­блем, как вы­яс­не­ние ме­ха­низ­мов экс­прес­сии ге­нов, ран­не­го эм­брио­наль­но­го раз­ви­тия, диф­фе­рен­ци­ров­ки и про­ли­фе­ра­ции, взаи­мо­дей­ст­вия яд­ра и ци­то­плаз­мы, кле­ток со сре­дой, адап­та­ции к разл. хи­мич. и фи­зич. воз­дей­ст­ви­ям, ста­ре­ния, зло­ка­чест­вен­ной транс­фор­ма­ции и др., её при­ме­ня­ют для ди­аг­но­сти­ки и ле­че­ния на­следств.

за­бо­ле­ва­ний. В ка­че­ст­ве тест-объ­ек­тов кле­точ­ные куль­ту­ры яв­ля­ют­ся аль­тер­на­ти­вой ис­поль­зо­ва­нию жи­вот­ных при ис­пы­та­нии но­вых фар­ма­ко­ло­гич. средств. Они не­об­хо­ди­мы при по­лу­че­нии транс­ген­ных рас­те­ний, кло­наль­но­го раз­мно­же­ния.

Важ­ную роль кле­точ­ные куль­ту­ры иг­ра­ют в био­тех­но­ло­гии при соз­да­нии гиб­ри­дов, про­из-ве вак­цин и био­ло­ги­че­ски ак­тив­ных ве­ществ. См. так­же Кле­точ­ная ин­же­не­рия.

Источник: https://bigenc.ru/biology/text/2120981

Medic-studio
Добавить комментарий