Методы фиксации препаратов: Тепловая фиксация. Предметное стекло с нанесенным материалом проводят

2. Приготовление препаратов фиксированных клеток

Методы фиксации препаратов: Тепловая фиксация. Предметное стекло с нанесенным материалом проводят

Фиксированнымисчитают клетки микроорганизмов, вкоторых прерваны жизненные процессы,но полностью сохранена тонкая структура.Для получения фиксированных препаратовважно правильно подготовить предметныестекла. Они должны быть чистыми итщательно обезжиренными.

Для этогостекла, бывшие в употреблении, выдерживают1-2 часа в хромовой смеси (в 1 л воды вносят50 г бихромата калия и 100 г техническойсерной кислоты), после чего ополаскиваюттеплой водой и спиртом. Можно такжекипятить стекла в течение 15 мин.

врастворе соды или мыльной воды. Дляпроверки чистоты стекла на его поверхностьнаносят каплю воды. При достаточномобезжиривании капля растекаетсяравномерно и не собирается в выпуклые,медленно высыхающие пузырьки.

Берутстекла пинцетом или аккуратно за грани,так как пальцы оставляют на поверхностижирные пятна.

Приготовлениефиксированных препаратов ведут вследующей последовательности:

  1. На середину чистого обезжиренного предметного стекла стерильной петлей наносят небольшую каплю воды. В нее вносят исследуемый материал, отобранный по методике, описанной в разделе 1. Полученную суспензию равномерно распределяют по поверхности стекла тонким слоем таким образом, чтобы препарат распределился на площади примерно 2-3 см2.

  2. Полученный мазок высушивают при комнатной температуре на воздухе.

  3. Производят фиксацию мазка. Для этого стекло с высохшим мазком проводят 3-4 раза над пламенем горелки той стороной, где мазок отсутствует.

Цель фиксации:

  • умертвить клетки микроорганизмов и сделать их безопасными (что особенно важно при работе с патогенными микроорганизмами);
  • зафиксировать (закрепить) мазок на стекле (чтобы они не смывались при окрашивании);
  • улучшить окрашивание, поскольку мертвые клетки лучше адсорбируют на своей поверхности различные красители.

Приготовлениефиксированных препаратов из естественныхмест обитания микроорганизмов проводитсятак же, как и из чистых культур. Помимотермической обработки, применяют такжефиксацию химическими веществами:погружают предметное стекло с мазкомв мензурку с 96 %-ным этанолом на 15-20 мин,с ацетоном на 5 мин, со смесью 96 % -ногоэтанола и 40%-ного формалина (соотношение95:5) на 2 мин. и др.

3.Окраска фиксированных препаратов микроорганизмов простым методом

Фиксированныепрепараты нельзя рассмотреть подмикроскопом, так как они являютсябесцветными и пропускают световые лучи.Поэтому их окрашивают, используя простыеили сложные методы. При окрашиваниификсированных мазков простыми методамииспользуют один краситель (фуксин,краска Муромцева, генцианвиолет,метиленовая синь и др.). Последовательностьокрашивания мазка простыми методамиследующая:

  1. На фиксированный препарат наносят несколько капель красителя таким образом, чтобы он покрывал всю поверхность мазка и выдерживают в течение определенного времени. Так, при окраске фуксином на мазок наносят несколько капель красителя и выдерживают его на мазке 2-3 мин.

  2. Краску смывают с мазка слабой струей до бесцветной смывной воды. При этом стекло держат в наклонном положении над лотком.

  3. Мазок подсушивают фильтровальной бумагой, которую осторожно прикладывают к стеклу, и досушивают на воздухе.

  4. На окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают препарат с объективом х90 или х100.

Задание 3. Схематически изобразитьморфологическую структуру бактериальнойклетки:

Задание 4. По памяти зарисовать иподписать основные шаровидные формыбактерий (микрококки, диплококки,тетракокки, сарцины, стрептококки,стафилококки).

Задание 5. По памяти зарисовать иподписать основные палочковидные формыбактерий.

Приложение к лабораторной работе№1

Задание 6. Зарисовать и подписатьрасположение жгутиков у бактерий(монотрихи, лофотрихи, амфитрихи,перитрихи).

Монотрихи– бактерии с 1 полярно расположенным жгути­ком
Лофотрихи– бактерии, на одном конце которых имеется пучок жгутиков
Амфитрихи– бактерии, имеющие пучки жгутиков на обоих полюсах бактериальной клетки
Перитрихи– бактерии, жгутики которых расположены по всей поверхности бактериальной клетки, то есть перитрихеально

Приложение к лабораторной работе№1

Задание 7. Зарисовать и подписатьвиды расположения спор в телемикроорганизма.

Терминальное расположение спор.Спора располоагается на полюсе бактерии, и тогда она приобретает форму барабанной палочки.
Центральное расположение спор.Если споры крупные и располагаются в центре клетки, то палочка может приобретать веретенообразную форму
Субтерминальное расположение спор.Спора располагается на конце палочки, и тогда она приобретает форму булавы.

Лабораторнаяработа №3-4

Тема: Морфологическиепризнаки дрожЖей и микроскопическихгрибов. влияние окружающей среды намикроорганизмы. Стерилизация идезинфекция.

Цель:Изучить основные признаки дрожжей имикроскопических грибов. Приготовлениеживых препаратов дрожжей и грибов.Ознакомиться с влиянием окружающейсреды на микроорганизмы, изучить методыи способы стерилизации и дезинфекции.

Оборудование,материалы:Микроскоп; термостат; сухожаровый шкаф;препаровальные иглы и бактериологическиепетли; предметные и покровные стекла;фильтровальная бумага; спиртовка; лотокс рельсами для предметных стекол;разделочные доски, лопатки, обработанныес применением растворов хлорсодержащихпрепаратов; раствор йодисто-калиевогокрахмала; метиленовая синь, пипетки;культуры грибов родов Mucor, Aspergillus,Penicillium, Alternaria; чистая культура дрожжейSaccharomyces cerevisiae.

ХОД ЗАНЯТИЯ:

Источник: https://studfile.net/preview/2300029/page:3/

Приготовление препаратов для микроскопирования

Методы фиксации препаратов: Тепловая фиксация. Предметное стекло с нанесенным материалом проводят

Методика приготовления постоянных микропрепаратов

Как понятно из заголовка отличие временного препарата, который может храниться  относительно не долгий отрезок времени, постоянный препарат может храниться многие годы.

Существуют готовые наборы для изготовления постоянных препаратов,  один из таких наборов изображен ниже.

Конечно, данный набор имеет свои ограничения для изготовления препаратов.

Обязательным  условием для долгосрочного хранения препарата из растительного или животного материала является его фиксация.

 Фиксирующих жидкостей много, самые доступные из  них:  этиловый спирт  и продающийся в аптеках препарат на основе формалина (Формидрон) Состав: 100 мл препарата содержат 10 г раствора формальдегида в пересчете на 37 % формальдегид; вспомогательные вещества: спирт этиловый 96 %, одеколон, вода очищенная.

Препарат ФОРМИДРОН, может быть использован для создания архива биологических объектов, вспомогательные вещества входящие в аптечный препарат, не сколько не мешают  в сохранении объекта. 

ВНИМАНИЕ ФОРМАЛЬДЕГИД ОБЛАДАЕТ РАЗДРАЖАЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ.

Если на дне банки с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его можно растворить, подогрев до 70-80 °С (в вытяжном шкафу! или на открытом воздухе), и использовать для фиксации. 

Спирт-формол по Шафферу – 10%  формалин, который готовят из 1 части  40% формалина и 2-3 частей 96 % спирта. Продолжительность фиксации 24-48 ч. Дальнейшая промывка в воде не требуется, и материал сразу же помещают в 96 % спирт. Выпадение белого осадка никак не сказываеться на свойстве фиксатора.

ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФИКСАТОРАМИ

Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам поэтому необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами.

Фиксация необходима с целью остановки (прекращения) жизнедеятельности клеток. Для этого объект помещают в соответствующий фиксатор  на время от нескольких минут до нескольких часов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПРЕПАРАТА ПОД ПОКРОВНОЕ СТЕКЛО

Большинство используемых в цитологии и гистологии красителей представляет собой водные растворы. Чтобы сделать временный препарат, срез, вынув из водного раствора красителя, промывают и заключают в глицерин. Приготовить постоянный препарат несколько сложнее: необходимо покрыть срезы покровным стеклом, заключив их в прозрачную затвердевающую среду.

Можно, ополоснув срезы дистиллированной водой, капнуть на них разогретый раствор желатины. Но большую сохранность и лучшее качество препаратов можно получить, заключив их в канадский бальзам (прозрачную смолу пихты с показателем преломления n= 1,535).

Поскольку канадский бальзам не смешивается с водой, но растворим в ксилоле  (толуоле, бензоле), создается необходимость провести препарат по «проводке» для срезов, но в направлении, противоположном тому, в которое стекла велись для удаления парафина и подготовке к окраске. При этом нужно помнить, что даже незначительное присутствие воды в срезе сделает препарат мутным, непригодным для изучения.

Поэтому переносить срезы по проводке от воды к толуолу надо медленно, погружая стекло в стаканчик со спиртом или толуолом на 2—3 мин. Схема проведения срезов может быть следующей:      

дистиллированная вода — ополоснуть, 

спирт 70%-ный — 2 мин, 

96%-ный — 2 мин, 

100%-ный —3 мин, 

Ксилол I — 2 мин, 

Ксилол II — 3—5 мин. 

Надо иметь в виду, что некоторые красители легко вымываются из препаратов как в воде, так и в спиртах.

Поэтому в некоторых случаях приходится избегать промывки препаратов и проведения через спирты низких концентраций.

Чтобы достигнуть обезвоживания, приходится препараты осторожно промокать фильтровальной бумагой, опуская их сразу в 96%- или 100%-ный спирт, можно заменять этиловые спирты ацетоном или изоамиловым спиртом.

Итак, задача, которая стоит при подготовке препарата для монтирования его под покровное стекло, состоит в том, чтобы, не вымыв красителя, добиться полного обезвоживания среза. Достигается это проводкой по спиртам возрастающей крепости, вплоть до 100%.

Обработка срезов ксилолом имеет двоякое значение: с одной стороны, в нем достигается просветление препарата, усиливается его прозрачность (краситель при этом из препарата не вымывается), с другой стороны, создаются благоприятные условия для дальнейшего пропитывания среза канадским бальзамом, который растворим в ксилоле.

Само заключение среза под покровное стекло осуществляется быстро, пока на препарате не испарился ксилол. Капля бальзама наносится на покровное стекло (оно должно быть чистым и сухим), и покровное стекло быстро перевертывается над срезом. Можно капать бальзам на предметное стекло на поверхность среза и быстро покрывать его покровным стеклом.

Канадский бальзам должен иметь консистенцию растительного масла (или гуще). Через 1—2 дня бальзам застывает.

Вместо канадского бальзама можно использовать синтетическую среду на основе полистирола.

Для этого берут 25г бесцветного полистирола, 5 мл дибутилфталата (пластификатор может быть любой) и доливают ксилолом до 100 мл. Раствор должен иметь консистенцию меда.  Заключение  среза под покровное стекло не отличается, от выше описанного.

Несомненным плюсом синтетического бальзама это инертность и более лучшая сохранность красителей.

Этапы приготовления постоянного микропрепарата 
1Изучаемый объект помещают  в раствор 1части ФОРМИДРОНА  с 2 частями воды на несколько дней. Для мазков это время ограничивается 15 минутами и формидрон разводить не следует.В случае использования этилового спирта время фиксации составляет 15-20 мин.
2После фиксации  объект  следует отмыть от фиксатора, для этого его помещают на несколько часов в проточную воду. Для удержания объекта при отмывке удобно поместить его  в ситечко-шарик для заваривания чая. Исследуемый объект переносят в батарею спиртов с целью удаления воды.Мазки ополаскивают в проточной воде в течение 3-5 минут. Струя воды должна быть не сильной, мазок сушат.
3Далее если необходимо препарат может быть окрашен одним из доступных  вам красителей.
4После окраски препарат готовят к заключению в монтирующую среду.Приготовить батарею ( ряд флаконов ) растворов спиртов возрастающей крепости  для удаления воды.  Возможно использовать как этиловый спирт (антисептический раствор) так и Изопропиловый спирт (ИПС) который можно приобрести в магазинах специализирующихся на продаже радиодеталей.Последовательно наливаем в лабораторные стаканчики этанол или изопропанол в концентрациях 50%, 70%, 96%, 99%.Объект помещают в  стаканчик,  начиная с 50% этанолом на 10 минут. Затем перемещают объект в стаканчики с все более высокой концентрацией спирта, выдерживая в каждом по 10 минут. В процессе такого перемещения этанол будет плавно вытягивать воду из объекта. Помещать объекты сразу в концентрированный этанол нельзя, так как в этом случае, быстро выходящая из клеток вода может повредить клеточные оболочкиДля мазков столь долгое пребывание в спиртах не требуется , достаточно 30-60 секунд, так как некоторые красители могут вымываться из мазка.
5Если Вы хотите заключить препарат  в канадский бальзам, обезвоженный материал переносят в уайт-спирит или ксилол  на 5-6 часов,  Канадский бальзам можно заменить на раствор канифоли  в  уайт-спирите(ксилоле), по консистенции напоминающий сироп.
6Если препарат заключается в глицерин-желатиновую смесь, то объект переносят не уайт-спирит, а в глицерин на несколько часов ( глицерин, аптечный)Заключение объекта в глицерин-желатин. Последний приготовляется следующим образом. Чистый желатин (7 г) размачивают в течение 2—3 ч в 42 см3 дистиллированной воды, добавляют 50 г глицерина и 0,5 г кристаллической карболовой кислоты. Все вместе нагревается при помешивании на водяной бане, фильтруется и охлаждается. При появлении осадка тщательно профильтровать через стекловату. Готовый «глицерин-желатин» хранить в герметичном сосуде. При комнатной температуре глицерин-желатин застывает.Небольшой кусочек глицерин-желатина иглой или скальпелем переносят на предметное стекло. Последнее слегка нагревают на пламени спиртовки, глицерин-желатин расплавляется. В него из глицерина переносится объект и покрывается покровным стеклом.Мазок заключают  следующим образом, кусочек глицерин-желатина помещают на покровное стекло Последнее слегка нагревают на спиртовке, глицерин-желатин расплавляется, объект покрывается покровным стеклом.Пространство между предметным и покровным стеклом заполняется монтирующей средой, которая, закрепляет покровное и предметное стекла и консервирует объект. Самым главным требованием к монтирующей среде является соответствие ее коэффициента преломления света к аналогичному показателю стекла. 
7Заключение объекта в канифоль или канадский бальзамНа покровное стекло по центру наносят каплю или, если стекло длинное, две капли жидкого раствора канифоли. Покровное стекло помещают каплей вниз  и слегка прижимаютКрая покровного стекла не следует вытирать ватой или марлей, смоченной ксилолом, так как при этом часть смолы может растечься по чистой поверхности покровного стекла. Засыхая, она образует неровности, которые мешают наблюдению под микроскопом и от которых очень трудно избавиться.В результате неполного обезвоживания в окрашенных заключенных препаратах часто образуются непрозрачные или мутные зоны. Под микроскопом в таком участке среза и над ним обнаруживаются многочисленные мелкие капельки воды, окраска сильно выцветает. Чтобы избавиться от этого, снимают покровное стекло, смывают ксилолом синтетическую смолу или бальзам, обезвоживают срез в 100%-ном спирте, ацетоне или изопропиловом спирте, просветляют в смеси ксилола с обезвоживающим агентом и в 2-3 сменах свежего ксилола и вновь заключают.Синтетическая монтирующая среда на основе полистирола.Полистирол (бесцветный)-25г.(можно использовать пищевые стаканчики)Дибутилфталат-5мл (любой доступный пластификатор, если не добавлять, полистирол трескается после высыхания)Ксилол до 100 мл.Растворение происходит в течение нескольких дней, раствор должен иметь консистенцию меда.

Источник: http://labx.narod.ru/documents/micropreparaty.html

Методы определения нематод

Методы фиксации препаратов: Тепловая фиксация. Предметное стекло с нанесенным материалом проводят

Опытные нематологи могут определить род нематоды при малом увеличении микроскопа, просматривая чашки с суспензией нематод.

Для определения же вида в большинстве случаев требуется исследование под микроскопом при очень сильном увеличении с применением определенных рабочих приемов, таких как обездвиживание, умерщвление, фиксация и приготовление препаратов нематод.

Обездвиживание

Идентификацию нематод рекомендуется проводить на живых экземплярах, чьи морфологические и структурные особенности устанавливаются с большей достоверностью, чем у умерщвленных или фиксированных особей. Однако большая подвижность некоторых видов затрудняет наблюдения, поэтому нематод следует обездвиживать.

1. Нематод помещают в раствор дихлорэтилового эфира (2 капли на 50 мл воды) и вскоре они полностью теряют подвижность. При замене раствора чистой водой нематоды приобретают прежнюю активность.

2. Осторожное кратковременное нагревание до 45—50 °С вызывает у нематод тепловое оцепенение. Техника выполнения этого приема заключается в следующем. Предметное стекло, на котором находится капля с нематодами, многократно быстро проводят через пламя горелки либо кратковременно нагревают на водяной бане. Слишком сильное нагревание ведет к структурным изменениям тела нематоды.

Умерщвление

Длительное хранение нематод и, в частности, связанная с этим фиксация предусматривают их умерщвление.

Обычно его проводят путем теплового воздействия, многократно проводя предметное стекло с нанесенными на него нематодами через пламя маленькой бунзеновской горелки. Суспензии относительно большого объема помещают в термостаты при 60—70 °С.

Время экспозиции зависит от объема данной суспензии: после достижения температуры умерщвления (60 °С) оно должно составлять не более нескольких минут.

Для умерщвления нематод можно применять химикаты, например раствор Люголя (2 г йодида калия, 1 г йода и 100 мл дистиллированной воды), разведенный в соотношении 1 1000. К суспензии, содержащей нематод, добавляют одну или несколько капель такого разбавленного раствора.

Фиксация

Чтобы сохранить в течение длительного срока нематод, предназначенных для использования в качестве сравнительного, диагностического или коллекционного материала, их фиксируют.

Фиксацию, которая следует непосредственно за умерщвлением нематод с целью подавления сразу же начинающихся процессов разложения, можно проводить с помощью различных фиксирующих растворов, которые одновременно служат и средой для хранения.

Ниже приведены прописи некоторых фиксирующих растворов.

Фиксирующий раствор ФА (мл): формалин (40%-ный) — 10, ледяная уксусная кислота — 10, дистиллированная вода — 80.

Фиксирующий раствор ФАА (мл): этиловый спирт (96%-ный) — 10, формалин (40%-ный) — 3, ледяная уксусная кислота — 0,5, дистиллированная вода — 20.

Стандартный фиксирующий раствор (мл): этиловый спирт (50%-ный) — 100, формалин (40%-ный) — 10, ледяная уксусная кислота — 10.

Фиксирующий раствор ТФД (мл): триэтаноламин — 2, формалин (40%-ный) — 7, дистиллированная вода — 91.

Примечание. Перед перенесением в фиксирующий раствор нематод следует умертвить, иначе они сморщиваются и деформируются.

Приготовление временных препаратов нематод

Приготовление временного препарата может понадобиться при определении видов нематод. С помощью очень острой иглы, тщательно заточенной бамбуковой щепки или тонкой пипетки одну или несколько особей переносят в каплю фиксирующего раствора в середине предметного стекла.

По краю капли располагают несколько коротких волокон стекловаты, диаметр которых примерно равен диаметру исследуемых нематод. Затем на каплю накладывают покровное стекло так, чтобы не образовалось пузырьков воздуха. Объем капли должен быть достаточным для заполнения пространства между предметным и покровным стеклами.

Избыток жидкости удаляют с помощью фильтровальной бумаги или другого гигроскопического материала. Если нематоды равномерно распределились в центре зоны, закрытой покровным стеклом (контроль под стереомикроскопом), можно приступать к временной герметизации препарата.

Используя тонкую кисточку, края покровного стекла запечатывают, например лаком для ногтей. Тщательная заделка (под стереомикроскопом при небольшом увеличении) предупреждает улетучивание среды и обеспечивает возможность хранения препарата в течение нескольких дней.

Если препарат нужен всего лишь на несколько часов, то для его герметизации края покровного стекла перед наложением на каплю достаточно смазать жиром или покрыть парафином (погружение в вазелин или расплавленный парафин).

Приготовление постоянных препаратов нематод

Для приготовления сравнительного и диагностического материала, а также для учебных целей необходимы постоянные препараты фитопатогенных нематод.

Фиксированных нематод помещают в очень маленькую каплю смеси глицерин-желатина (30 мл желатина, по 6 мл глицерина и дистиллированной воды, по 2 мл молочной кислоты и фенола) на предметном стекле и хранят в непроницаемом для пыли месте до затвердевания (1—2 нед). После этого на предметное стекло наносят более крупную каплю жидкого желатина и накрывают препарат покровным стеклом. Еще через 10—20 дней края покровного стекла запечатывают каким-нибудь герметиком (например, лаком для ногтей) и снабжают препарат этикеткой.

Хорошей средой для постоянных препаратов нематод является чистый глицерин. Предпосылкой сохранности служит полная пропитка нематод глицерином. Чтобы избежать съеживания и деформации паразитов, необходимо соблюдать тщательность в работе.

Умерщвленных нематод сначала хранят не менее 12—24 ч в маленьких чашечках (часовые стекла, блок-чашки), заполненных фиксирующим раствором состава 10 мл 40%-ного формалина, 10 мл ледяной уксусной кислоты + 80 мл дистиллированной воды.

Затем фиксирующий раствор почти полностью отсасывают с помощью пипетки и добавляют 3—4 мл глицериноспиртовой смеси (2 мл глицерина, 8 мл 95%-ного спирта, 90 мл дистиллированной воды). Чашечку с нематодами помещают во второй сосуд и хранят в термостате при 50 °С, предохраняя от проникновения пыли.

Вследствие постепенного испарения воды и спирта нематоды оказываются в конце концов в чистом глицерине, однако испарение должно происходить не слишком быстро, иначе нематоды могут сморщиться. Сморщивание нередко устраняют путем повторного добавления вышеуказанной спиртовой смеси.

После этого следует вновь выждать процесс испарения, но оно должно идти в более медленном темпе. Для полного обезвоживания сосуд, содержащий нематоды, через несколько дней помещают на 48 ч в эксикатор, заполненный хлоридом кальция или другими гигроскопическими веществами.

Далее нематод, находящихся теперь уже в чистом глицерине, переносят на предметное стекло в маленькую каплю глицерина. По периметру покровного стекла раскладывают волокна стекловаты, диаметр которых приблизительно соответствует диаметру нематод.

Для заделки препарата края покровного стекла смазывают каким-либо герметизирующим материалом, например лаком для ногтей. Приготовление препарата завершается этикетированием.

Срезы вульвы для определения галлообразующих и цистообразующих нематод

У галло- и цистообразующих нематод, относящихся к родам Meloidogyne, Heterodera и Globodera, рисунок кутикулы вульвоанальной области взрослых самок служит важным признаком при точном определении вида.

В качестве исходного материала для дифференциации видов Meloidogyne используют покрытую галлами растительную ткань, не менее суток фиксированную в 5%-ном растворе формалина. Из этой ткани с помощью скальпеля и иглы извлекают грушевидных самок.

Затем под микроскопом, используя острый скальпель или лезвие бритвы, отделяют заднюю часть тела самки, осторожно удаляют внутренности, кладут вогнутой стороной на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

Средой для заливки может служить капля лактофенола.

Цисты хранят в капле глицерина. В дальнейшем с помощью острого скальпеля или лезвия бритвы отрезают под стереомикроскопом задний конец, удаляют внутренности и рассматривают препарат как в плане, так и с нижней стороны. Если циста имеет очень темную кутикулу, может потребоваться и продольный срез через воронку вульвы.

, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Источник: https://www.activestudy.info/metody-opredeleniya-nematod/

Препараты для световой микроскопии

Методы фиксации препаратов: Тепловая фиксация. Предметное стекло с нанесенным материалом проводят

Препараты для световой микроскопии.

Наиболее распространенными и доступными для повседневной практики являются наблюдения микроорганизмов в световой микроскоп. При приготовлении препаратов руководствуются определенными правилами работы с изучаемыми образцами.

Препарат помещают на предметное стекло толщиной не более 1,4 мм. Толстое стекло не позволяет хорошо сфокусировать изображение и не годится для работы с иммерсионным объективом, имеющим очень короткое фокусное расстояние. Толщина покровного стекла не должна превышать 0,17 мм.

Стекла должны быть тщательно очищены, обезжирены и высушены.

Препараты живых микроорганизмов представляют собой каплю жидкости с микробными клетками, заключенную между предметным и покровным стеклами. При работе с ними иммерсионные системы не используют. Отработанные препараты выдерживают в дезинфицирующем растворе. Существует несколько видов препаратов живых клеток.

Препарат «раздавленная капля» готовят, нанося небольшую каплю воды на предметное стекло и размешивая в ней микробные клетки, выросшие на твердой среде. Если культура росла на жидкой среде, на предметное стекло наносят каплю среды с клетками. Затем эту каплю накрывают покровным стеклом.

Если покровное стекло плавает на поверхности капли, то избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Для приготовления препарата «микро-культура» на участок предметного стекла, равный по площади покровному стеклу, наносят расплавленную твердую среду. После застывания среды в центр квадрата помещают суспензию клеток микроорганизма.

Стекло инкубируют во влажной камере в термостате, а перед микроскопированием накрывают квадрат среды с выросшей микрокультурой покровным стеклом. Препарат «висячая капля» отличается тем, что каплю суспензии клеток наносят на покровное стекло, которое помещают каплей вниз на специальное предметное стекло с лункой. Капля оказывается свободно висящей в пространстве лунки.

Для препарата «отпечаток» чистое покровное стекло прикладывают к поверхности колонии и слегка прижимают его пинцетом. Снятое без сдвига покровное стекло помещают отпечатком вниз в каплю воды на предметном стекле.

Препараты живых клеток позволяют изучать естественную форму и сочетания микроорганизмов, а также характер их движения. Недостатками таких препаратов являются их недолговечность и невозможность достижения большого увеличения.

Работать с иммерсионными объективами и повысить контрастность изображения позволяет процедура приготовления фиксированного окрашенного препарата — специальная обработка, включающая несколько обязательных стадий.

Для приготовления мазка небольшую каплю клеточной суспензии равномерно распределяют по поверхности обезжиренного предметного стекла. После этого мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. Затем проводят фиксацию препарата.

Эта процедура убивает микроорганизмы, делая их более восприимчивыми к окраске, и прикрепляет клетки к стеклу. Препарат становится безопасным для исследователя, что важно при работе с патогенными микроорганизмами. Различают термическую и химическую фиксацию.

Термическая фиксация — это самый простой и распространенный способ, при котором предметное стекло мазком вверх трижды проводят через пламя горелки. После остывания стекла препарат готов к окрашиванию. Более редкая обработка различными химическими веществами применяется при изучении тонкого строения клеток.

В зависимости от целей исследования используют различные виды окраски. Простое окрашивание позволяет лучше рассмотреть форму клетки и определить ее размеры, так как прокрашивается вся клетка.

В этом случае чаще всего пользуются такими красителями, как фуксин или метиленовая синь, наливая его раствор прямо на мазок и выдерживая 3—5 мин. Дифференциальное окрашивание применяют для выявления структур и включений клетки. При этом используют краситель (или последовательно несколько красителей), окрашивающий определенную клеточную структуру. Иногда сложные способы дифференциальной окраски могут включать дополнительные процедуры.

Например, при окраске эндоспор препарат нагревают с красителем, окраска на кислотоустойчивость и по Граму предполагает обработку кислотой или спиртом и т.д. После окрашивания препарат многократно промывают водой и высушивают на воздухе или промокают фильтровальной бумагой. На мазок помещают каплю иммерсионного масла и микроскопируют препарат с иммерсионным объективом.

В правильно окрашенном препарате фон остается неокрашенным. Иногда применяют негативные красители, не проникающие внутрь клетки и окрашивающие только поле зрения. Так, для выявления капсул используют обычную разбавленную тушь. Капсулы при этом остаются неокрашенными и хорошо видны на темно-сером фоне. Фиксированные окрашенные препараты можно хранить длительное время.

Источник: http://imkvl.ru/preparaty-dlya-svetovoj-mikroskopii.html

Подготовка предметных и покровных стекол

Методы фиксации препаратов: Тепловая фиксация. Предметное стекло с нанесенным материалом проводят

Предметные и покровные стекла, употребляемые для приго­товления препаратов, должны быть чистыми и хорошо обезжирен­ными. Это может быть достигнуто разными способами.

Стекла кипятят 15 мин в 1% растворе соды (или мыльной воде), спо­ласкивают водой, кладут в слабую хлористоводородную кислоту и хорошо промывают водой. Или же сначала выдерживают стекла 2 ч в концентрированной серной кислоте, затем моют их в воде, кипятят в щелочи, вновь промывают водой.

Стекла можно также обрабатывать жидкостью следующего состава (по Цетт­нову): Kalii bichromici 20 г, Acidi sulfurici crudi 20 г, воды 200 мл. После 10 мин кипячения в этой смеси стекла про­мывают 5 мин в слабом растворе щелочи, а затем промывают во­дой и, наконец, спиртом.

Хранят стекла в сосудах (банках) с притертыми пробками в смеси равных количеств спирта и эфира или в 96% спирте, либо промытыми и вытертыми досуха.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии

Исследование микроорганизмов в живом состоянии применя­ется главным образом для изучения формы и подвижности бакте­рий, реже при реакции агглютинации. Для этих целей готовят препараты “раздавленная капля” и “висячая капля” (рис. 5).

Препарат “раздавленная капля”. При приготовлении «раздавленной» капли жидкость с исследуемым материалом наносят на пред­метное стекло и сверху накладывают покровное. Капли мате­риала надо брать такой величины, чтобы они заполняли все пространство между покровным и предметным стеклом и не вы­ступали за края покровного.

Препарат “висячая капля”. Для “висячей” капли необходимо иметь предметное стекло с луночкой. На покровное стекло предварительно наносят каплю жидкости с исследуемой культурой микроорганизмов.

Затем на по­кровное стекло накладывают предметное стекло, с луночкой посередине, края которой предварительно смазаны вазелином. Предметное стекло слегка прижимают к покровному, в резуль­тате чего оба стекла склеиваются. После этого препарат пере­вертывают покровным стеклом кверху.

Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

Для предотвращения быстрого высыхания препараты рекомендуется помещать во влажную камеру (чашку Петри), на дно которой положено 2-3 влажных кружка фильтровальной бу­маги, покрытых двумя сухими.

При изучении препаратов «раздавленная» и «висячая капля» под световым мик­роскопом край капли сначала отыскивают со слабым увеличением и при суженой диафрагме, а потом исследуют препарат при по­мощи более сильного увеличения. Более удобными для их микроскопического изучения представляются такие виды микроскопии, как темнопольная, фазово-контрастная и аноптральная.

Препараты фиксированных окрашенных клеток. Приготовление мазка и фиксация препарата

Исследование бактерий в окрашенном препарате дает воз­можность не только изучить их морфологию, но и получить представление о некоторых деталях их химического строения. Это достигается применением специальных методов.

Техника приготовления препаратов. В зависимости от характера исследуемого материала при его заборе используют бактериологическую петлю, пастеровскую пипетку или иглу. Петлю делают из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см, закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку.

Конец проволоки сгибают в виде плотно замкнутой петли размером 1×1,5 или 2×3 мм. Петлю держат как карандаш. Рабочую часть петли прожигают в пламени горелки в вертикальном положении, сначала конец петли, затем постепенно всю металлическую часть. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки.

Пробирку с изучаемой культурой микроорганизмов держат между указательным и большим пальцами левой руки. Бактериологическую петлю берут правой рукой и прожигают ее в пламени горелки. Не выпуская петли из правой руки, мизинцем прижимают пробку к ладони и вынимают из пробирки. Во время манипуляции с пробиркой пробка находится в руке.

Прожигают пробку и горло пробирки в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки, чтобы горячая петля не убила выросшую культуру. Захватывают петлей культуру и выводят ее из пробирки, не касаясь стенок. Держа петлю с культурой, закрывают пробирку пробкой над пламенем горелки. Ставят пробирку в штатив.

Из жидких культур ка­плю материала наносят на предметное стекло бактериальной петлей и равномерно распределяют по центру предметного стекла. Из культуры микроорганизмов на плотной среде бактериальной петлей делают забор микробной массы и размешивают в заранее нанесенной на предметное стекло капле водопроводной воды.

Остатки культуры на петле, сжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, равномерно растертым и небольшим. Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/5_160746_podgotovka-predmetnih-i-pokrovnih-stekol.html

Medic-studio
Добавить комментарий