Микроскопы и способы микроскопии: В паразитологических исследованиях применяются методы оптической и

Читать книгу «Медицинская паразитология с энтомологией» онлайн— Виктор Андреев — Страница 4 — MyBook

Микроскопы и способы микроскопии: В паразитологических исследованиях применяются методы оптической и

Болезни, вызываемые патогенными протестами (около 20 видов), называют протозоозами; гельминтами (около 200 видов) – гельминтозами, среди которых выделяют трематодозы, нематодозы, цестодозы; мухами – миазы; клещами – акариозы. Иногда акариозы и энтомозы объединяют в так называемые арахноэнтомозы.

Многие паразитарные болезни связаны с территориями, природные факторы которых отвечают экологическим требованиям возбудителей этих болезней.

Природные факторы могут быть как биотическими (достаточная распространенность животных – хозяев возбудителей), так и абиотическими (температура, влажность, характер почвы).

Правда, распространенность паразитарных болезней в пределах этих территорий зависит также от социально-экономических факторов (условия труда и быта людей, их культура, уровень развития здравоохранения).

Распространение некоторых паразитарных болезней полностью определяется условиями быта людей и соблюдением ими правил гигиены. Это паразитарные болезни, передающиеся преимущественно контактно-бытовым путем (энтеробиоз, гименолепидоз).

Особое место в систематике паразитарных болезней занимают дерматозы, под которыми понимают группу поражений кожи, вызванных животными-паразитами.

Среди них выделяют две подгруппы: эктопаразитов, паразитирующих на поверхности кожи (вши, блохи), и внутрикожных паразитов, внедряющихся в толщу кожи или под кожу и проходящих там свой цикл развития (чесоточный клещ, личинки некоторых червей и мух).

Паразитарные дерматозы, таким образом, бывают поверхностными (эпизоозы), с локализацией патологического процесса в эпидермисе – дерматофилиазы, и глубокими (дерматозозы) – с поражением дермы и, нередко, подкожной клетчатки, что наблюдается при дракункулезе, лейшманиозе, миазах, филяриатозах, цистицеркозе, чесотке, вшивости.

В зависимости от возбудителя и степени поражения кожи клинические проявления паразитарных дерматозов весьма разнообразны (эритема, отек, бугорки, пузыри, узлы, изъязвления) и сопровождаются неприятными субъективными ощущениями (зуд, жжение, боль). В результате сенсибилизации организма продуктами жизнедеятельности паразитов возможны аллергические высыпания, эозинофилия, явления интоксикации (слабость, головная боль, тошнота, рвота, адинамия, судороги).

Лечение, прогноз и профилактика зависят от вида паразитарного дерматоза.

Профилактические и противоэпидемические мероприятия

К профилактическим мероприятиям относятся:

♦ охрана окружающей среды (почвы, водоисточников) от загрязнения испражнениями людей и животных;

♦ благоустройство населенных мест (строительство канализации, водопровода и др.);

♦ санитарный надзор за территорией и водоснабжением населенных мест, за производством, транспортировкой и торговлей пищевыми продуктами;

♦ ветеринарно-санитарный надзор на бойнях, мясокомбинатах, рынках, в животноводческих хозяйствах;

♦ выявление и санация носителей возбудителей паразитарных болезней;

♦ при необходимости – защита людей от нападения членистоногих; санитарная пропаганда знаний по личной профилактике паразитарных болезней.

К противоэпидемическим мероприятиям относятся:

♦ активное выявление больных и носителей возбудителей инвазий;

♦ учет и лечение бальных;

♦ при необходимости госпитализация, диспансерное наблюдение после лечения;

♦ обезвреживание или уничтожение (по показаниям) животных – источников инвазии (грызунов, собак);

♦ широкий круг санитарно-профилактических мер в населенных пунктах.

Методы диагностики паразитарных болезней

В лабораторной диагностике используют макроскопические, микроскопические и иммунологические методы исследования.

https://www.youtube.com/watch?v=NIRCkWaysjE

С помощью макроскопических методов удается обнаружить паразитов на наружных покровах или в фекалиях больного.

Микроскопическими исследованиями выявляют паразитов в мазках крови, тканевой жидкости, кусочках мышц, полученных с помощью биопсии, а также в экскретах (мокроте, фекалиях).

Среди иммунологических методов в диагностике протозойних болезней и гельминтозов чаще всего используют серологические и аллергические реакции.

Микроскопы и способы микроскопии

В паразитологических исследованиях применяются методы оптической и электронной микроскопии с помощью световых и электронных микроскопов.

Световой микроскоп. Оптический прибор, позволяющий получить обратное изображение изучаемого объекта и рассмотреть мелкие детали его строения, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза.

Разрешающая способность микроскопа дает раздельное изображение двух близких друг другу линий. Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм или 100 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм.

В лабораториях обычно используют световые микроскопы, на которых микропрепараты рассматриваются с использованием естественного или искусственного света. Наиболее распространены световые биологические микроскопы: БИОЛАМ, МИКМЕД, МБР (микроскоп биологический рабочий).

В микроскопе выделяют две системы: оптическую и механическую.

К оптической системе относят объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель).

Объектив – одна из важнейших частей микроскопа, поскольку он определяет полезное увеличение объекта.

Объектив состоит из металлического цилиндра с вмонтированными в него линзами, число которых может быть различным. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами.

В учебных целях используют сухие объективы х8, х40 и иммерсионный объектив х90. Качество объектива определяет его разрешающая способность.

Окуляр устроен намного проще объектива. Он состоит из 2–3 линз, вмонтированных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диафрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изображение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя служит непосредственно для наблюдения.

Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляры не выявляют новых деталей строения, объекта. Таким образом, окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом.

Для определения общего увеличения микроскопа следует умножить увеличение объектива на увеличение окуляра.

Осветительное устройство состоит из зеркала или электроосветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предметным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света.

Зеркало служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало.

Электроосветитель устанавливается под конденсором в гнездо подставки.

Конденсор состоит из 2–3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При его подъеме или опускании с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от зеркала на объект.

Ирисовая диафрагма расположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива, и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединять, полностью закрыв нижнюю линзу конденсора, то разводить, увеличивая поток света.

Кольцо с матовым стеклом, или светофильтром, уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости.

Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, револьвера, винта грубой наводки, предметного столика, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора.

Подставка – это основание микроскопа.

Коробка с микрометренным механизмом, построенным на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно.

Микровинт служит для незначительного перемещения тубу-содержателя, а, следовательно, и объектива, на расстояния, измеряемые микрометрами.

Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2 мкм.

Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается вращать микровинт в одну сторону не более чем на половину оборота.

Тубус, или трубка – цилиндр, в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять.

Тубусодержатель несет тубус и револьвер.

Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера.

Винт грубой наводки используют для значительного перемещения тубусодержателя, а следовательно, и объектива, с целью фокусировки объекта при малом увеличении.

Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике есть две пружинистые клеммы-зажимы, закрепляющие препарат.

Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма. Его можно поднять или опустить с помощью винта, который вращает зубчатое колесо, входящее в пазы рейки с гребенчатой нарезкой.

При микроскопии иммерсионным объективом (от позднелат.

immersio – погружение) с увеличением х90 обязательным условием является его погружение в кедровое, персиковое или (при их отсутствии) в вазелиновое масло, так как показатели преломления света у них близки предметному стеклу, на котором делают препараты (мазки).

В этом случае падающий на препарат пучок света не рассеивается и, не меняя своего направления, попадает в иммерсионный объектив. Разрешающая способность иммерсионного микроскопа находится в пределах 0,2 мкм при максимальном увеличении объекта, которое может достигать 1350.

При использовании иммерсионного объектива вначале центрируют оптическую часть микроскопа. Если тубус микроскопа раздвижной, то его устанавливают на длину 160 мм, затем поднимают конденсор до уровня предметного столика, открывают диафрагму, устанавливают объектив х8 и с помощью плского зеркала освещают поле зрения.

На предметное стекло с окрашенным препаратом наносят каплю масла, в которую под контролем зрения осторожно погружают объектив, затем, постепенно поднимая тубус и глядя в окуляр, вначале макро-, а потом микровинтом добиваются четкого изображения объекта.

Закончив работу, поднимают тубус, снимают препарат, с фронтальной линзы объектива салфеткой удаляют масло и, отведя тубус в сторону, опускают к предметному столику.

Люминесцентная микроскопия. Метод основан на способности некоторых клеток и красителей светиться при попадании на них ультрафиолетовых и других коротковолновых лучей света.

Люминесцентные микроскопы представляют собой обычные световые микроскопы, снабженные ярким источником света и набором светофильтров, которые выделяют коротковолновую часть спектра, возбуждающую люминесценцию.

Между зеркалом микроскопа и источником света устанавливается сине-фиолетовый светофильтр (УФС-3, ФС-1 и пр.). На окуляр надевают желтый светофильтр (ЖС-3 или ЖС-18).

Различают собственную (первичную) и наведенную (вторичную) флюоресценцию. Так как большая часть протистов не обладает собственной флюоресценцией, то они обрабатываются красителями, способными флюоресцировать (вторичная люминесценция).

Люминесцентная микроскопия отличается целым рядом преимуществ: дает цветное изображение и значительную контрастность; позволяет обнаружить живые и погибшие микроорганизмы; прозрачные и непрозрачные объекты; установить локализацию паразитов в пораженных клетках организма.

Электронная микроскопия. При электронной микроскопии вместо света используется поток электронов в безвоздушной среде, на пути которых находится анод. Источником электронов является электронная пушка (вольфрамовая проволока, разогреваемая до 2500–2900 °C).

Оптические линзы заменены электромагнитами. Между вольфрамовой нитью и анодом возникает электрическое поле в 30 000 -50 000 В, что сообщает электронам большую скорость, и они, проходя через отверстие в аноде, попадают в первую электромагнитную линзу (конденсор).

Электронные лучи по выходе из конденсора собираются в плоскости исследуемого объекта. Они отклоняются под разными углами за счет различной толщины и плотности препарата и попадают в объективную электромагнитную линзу, снабженную диафрагмой.

Электроны, мало отклонившиеся при встрече с объектом, проходят через диафрагму, а отклонившиеся под большим углом, задерживаются, благодаря чему обеспечивается контрастность изображения.

Линза объектива дает промежуточное увеличение изображения, которое рассматривается через смотровое окно.

Проекционная линза может увеличивать изображение во много раз, оно проецируется на флюоресцирующий экран и фотографируется.

В зависимости от целей исследования используют мощность от 20 до 100 000 Вт. Разрешающая способность электронных микроскопов равна 3–4 ангстрема (10 Å = 1 нм). Для биологических объектов разрешение обычно составляет 1–2 нм.

В электронном микроскопе протисты и гельминты идентифицируют по тонким деталям их ультраструктуры: получают микрофотографии.

Для этого содержащий их материал наносят на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой пленкой, и паразитов контрастируют 1 %-ным уранилацетатом и лимонно-кислым свинцом.

Покрывая протистов и гельминты, эти вещества создают вокруг них темный фон, а проникая вглубь между структурными компонентами, способствуют выявлению деталей их структуры. Конфигурация паразитов отчетливо отпечатывается на матрицах-репликах высохших пленок пластмассы, раствором которых они заливаются.

Диагностика протозойных болезней основана, главным образом, на глубоком знании морфологической структуры патогенных протистов, способах приготовления, фиксации и окраски мазков-препаратов. Результаты микроскопии в значительной степени зависят от выбора патологического материала, его характера, времени взятия от начала заболевания, срока исследования от момента его получения.

Источник: https://MyBook.ru/author/sergej-pavlovich-3/medicinskaya-parazitologiya-s-entomologiej/read/?page=4

Микроскоп и микроскопические методы исследования

Микроскопы и способы микроскопии: В паразитологических исследованиях применяются методы оптической и

Для обнаружения и исследования микроорганизмов применяют микроскопы. Световые микроскопы предназначены для изучения микроорганизмов, которые имеют размеры не менее 0,2 мкм (бактерии, простейшие и т. п.

) a электронные для изучения более мелких микроорганизмов (вирусы) и мельчайших структур бактерий.
Современные световые микроскопы – это сложные оптические приборы, обращение с которыми требует определенных знаний, навыков и большой аккуратности.

Световые микроскопы подразделяются на студенческие, рабочие, лабораторные и исследовательские, различающиеся по конструкции и комплектации оптикой.

Отечественные микроскопы (Биолам”, “Бимам”, “Микмед”) имеют обозначения, указывающие, к какой группе они относятся (С – студенческие, Р – рабочие, Л – лабораторные, И – исследовательские), комплектация обозначается цифрой.

В микроскопе различают механическую и оптическую части.

К механической части относятся: штатив (состоящий из основания и тубусодержателя) и укрепленные на нем тубус с револьвером для крепления и смены объективов, предметный столик для препарата, приспособления для крепления конденсора и светофильтров, а также встроенные в штатив механизмы для грубого (макромеханизм, макровинт) и тонкого (микромеханизм, микровинт) перемещения предметного столика или тубусодержателя.

Оптическая часть микроскопа представлена объективами, окулярами и осветительной системой, которая в свою очередь состоит из расположенных под предметным столиком конденсора Аббе, зеркала, имеющего плоскую и вогнутую сторону, а также отдельного или встроенного осветителя. Объективы ввинчиваются в револьвер, а соответствующий окуляр, через который наблюдают изображение, устанавливают с противоположной стороны тубуса. Различают монокулярный (имеющий один окуляр) и бинокулярный (имеющий два одинаковых окуляра) тубусы.

Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы

1. Источник света; 2. Коллектор; 3. Ирисовая полевая диафрагма; 4. Зеркало; 5. Ирисовая аппертурная диафрагма; 6. Конденбсор; 7. Препарат; 7'.

Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое ; объективом; 7''. Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре; 8. Объектив; 9.

выходной значок объектива; 10. Полевая диафрагма окуляра; 11. Окуляр; 12. Глаз.

Основную роль в получении изображения играет объектив. Он строит увеличенное, действительное и перевернутое изображение объекта. Затем это изображение дополнительно увеличивается при рассматривании его через окуляр, который аналогично обычной лупе дает увеличенное мнимое изображение.

Увеличение микроскопа ориентировочно можно определить, умножая увеличение объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не определяет качества изображения. Качество изображения, его четкость, определяется разрешающей способностью микроскопа, т. е. возможностью различать раздельно две близко расположенные точки.

Предел разрешения — минимальное расстояние, на котором эти точки еще видны раздельно,— зависит от длины волны света, которым освещается объект, и числовой апертуры объектива. Числовая апертура, в свою очередь, зависит от угловой апертуры объектива и показателя преломления среды, находящейся между фронтальной линзой объектива и препаратом.

Угловая апертура—это максимальный угол, под которым могут попадать в объектив лучи, прошедшие через объект. Чем больше апертура и чем ближе показатель преломления среды, находящейся между объективом и препаратом, к показателю преломления стекла, тем выше разрешающая способность объектива.

Если считать апертуру конденсора равной апертуре объектива, то формула разрешающей способности имеет следующий вид:

где R – предел разрешения; – длина волны; NA – числовая апертура.

Различают полезное и бесполезное увеличение. Полезное увеличение обычно равно числовой апертуре объектива, увеличенной в 500—1000 раз. Более высокое окулярное увеличение не выявляет новых деталей и является бесполезным.

В зависимости от среды, которая находится между объективом и препаратом, различают «сухие» объективы малого и среднего увеличения (до 40 х) и иммерсионные с максимальной апертурой и увеличением (90—100 х).

«Сухой» объектив – это такой объектив, между фронтальной линзой которого и препаратом, находится воздух.

Особенностью иммерсионных объективов является то, что между фронтальной линзой такого объектива и препаратом помещают иммерсионную жидкость, имеющую показатель преломления такой же, как стекло (или близкий к нему), что обеспечивает увеличение числовой апертуры и разрешающей способности объектива.

В качестве иммерсионной жидкости для объективов водной иммерсии используют дистиллированную воду, а для объективов масляной иммерсии—кедровое масло или специальное синтетическое иммерсионное масло.

Использование синтетического иммерсионного масла предпочтительнее, поскольку его параметры более точно нормируются, и оно в отличие от кедрового, не засыхает на поверхности фронтальной линзы объектива. Для объективов, работающих в ультрафиолетовой области спектра, в качестве иммерсионной жидкости используют глицерин.

Ни в коем случае нельзя пользоваться суррогатами иммерсионного масла и, в частности, вазелиновым маслом. **Изображение, полученное с помощью линз, обладает различными недостатками: сферической и хроматической аберрациями, кривизной поля изображения и др. В объективах, состоящих из нескольких линз, эти недостатки в той или иной мере исправлены.

В зависимости от степени исправления этих недостатков различают объективы ахроматы и более сложные апохроматы. Соответственно объективы, в которых исправлена кривизна поля изображения, называются планахроматами и планапохроматами.

Использование этих объективов позволяет получить резкое изображение по всему полю, тогда как изображение, полученное с помощью обычных объективов, не имеет одинаковой резкости в центре и на краях поля зрения. Все характеристики объектива обычно выгравированы на его оправе: собственное увеличение, апертура, тип объектива (АПО – апохромат и т. п.

); объективы водной иммерсии имеют обозначение ВИ и белое кольцо вокруг оправы в нижней ее части, объективы масляной иммерсии—обозначение МИ и черное кольцо. Все объективы рассчитаны для работы с покровным стеклом толщиной 0,17мм. Толщина покровного стекла особенно влияет на качество изображения при работе с сильными сухими системами (40 х).

При работе с иммерсионными объективами нельзя пользоваться покровными стеклами толще 0,17 мм потому, что толщина покровного стекла может оказаться больше, чем рабочее расстояние объектива, и в этом случае, при попытке сфокусировать объектив на препарат, может быть повреждена фронтальная линза объектива.

Окуляры состоят из двух линз и тоже бывают нескольких типов, каждый из которых применяется с определенным типом объектива, дополнительно устраняя недостатки изображения. Тип окуляра и его увеличение обозначены на его оправе.

Конденсор предназначен для того, чтобы сфокусировать на препарате свет от осветителя, направляемый зеркалом микроскопа или осветителя (в случае использования накладного или встроенного осветителя). Одной из деталей конденсора является апертурная диафрагма, которая имеет важное значения для правильного освещения препарата.

Осветитель состоит из низковольтной лампы накаливания с толстой нитью, трансформатора, коллекторной линзы и полевой диафрагмы, от раскрытия, которой зависит диаметр освещенного поля на препарате. Зеркало направляет свет от осветителя в конденсор. Для того чтобы сохранить параллельность лучей, идущих от осветителя в конденсор, необходимо использовать только плоскую сторону зеркала.

Настройка освещения н фокусировка микроскопа

Качество изображения в значительной мере зависит также от правильного освещения. Существует несколько различных способов освещения препарата при микроскопии.

Наиболее распространенным является способ установки света по Келеру, который заключается в следующем: 1) устанавливают осветитель против зеркала микроскопа; 2) включают лампу осветителя и направляют свет на плоское (!) зеркало микроскопа; 3)помещают препарат на предметный столик микроскопа; 4) закрывают зеркало микроскопа листком белой бумаги и фокусируют на нем изображение нити лампы, передвигая патрон лампы в осветителе; 5) убирают лист бумаги с зеркала; 6) закрывают апертурную диафрагму конденсора. Перемещая зеркало и слегка передвигая патрон лампы, фокусируют изображение нити на апертурной диафрагме. Расстояние осветителя от микроскопа должно быть таким, чтобы изображение нити лампы было равно диаметру апертурной диафрагмы конденсора (наблюдать апертурную диафрагму можно с помощью плоского зеркала, помещенного с правой стороны основания микроскопа). 7)открывают апертурную диафрагму конденсора, уменьшают отверстие полевой диафрагмы осветителя и значительно уменьшают накал лампы; 8) при малом увеличении (10х), глядя в окуляр, получают резкое изображение препарата; 9)слегка поворачивая зеркало, переводят изображение полевой диафрагмы, которое имеет вид светлого пятна, в центр поля зрения. Опуская и поднимая конденсор, добиваются получения резкого изображения краев полевой диафрагмы в плоскости препарата (вокруг них может быть видна цветная каемка); 10) раскрывают полевую диафрагму осветителя до краев поля зрения, увеличивают накал нити лампы и слегка (на 1/3) уменьшают раскрытие апертурной диафрагмы конденсора; 11)при смене объектива необходимо проверить настройку света. После окончания настройки света по Келеру нельзя изменять положение конденсораf раскрытие полевой и апертурной диафрагмы. Освещенность препарата можно регулировать только нейтральными светофильтрами или изменением накала лампы с помощью реостата. Излишнее открытие апертурной диафрагмы конденсора может привести к значительному снижению контраста изображения, а недостаточное – к значительному ухудшению качества изображения (появлению диффракционных колец). Для проверки правильности раскрытия апертурной диафрагмы необходимо удалить окуляр и, глядя в тубус, открыть ее таким образом, чтобы она закрывала светящееся поле на одну треть. Для правильного освещения препарата при работе с объективами малого увеличения (до 10х) необходимо отвинтить и снять верхнюю линзу конденсора.

Внимание! При работе с объективами, дающими большое увеличение – с сильными сухими (40х) и иммерсионными (90х) системами, чтобы не повредить фронтальную линзу, при фокусировке пользуются следующим приемом: наблюдая сбоку, опускают объектив макровинтом почти до соприкосновения с препаратом, затем, глядя в окуляр, макровинтом очень медленно поднимают объектив до появления изображения и с помощью микровинта производят окончательную фокусировку микроскопа.

Уход за микроскопом

При работе с микроскопом нельзя применять большие усилия. Нельзя касаться пальцами поверхности линз, зеркал и светофильтров. Чтобы предохранить внутренние поверхности объективов, а также призмы тубуса от попадания пыли, необходимо всегда оставлять окуляр в тубусе.

При чистке внешних поверхностей линз нужно удалить с них пыль мягкой кисточкой, промытой в эфире. Если необходимо, осторожно протирают поверхности линз хорошо выстиранной, не содержащей остатков мыла, полотняной или батистовой тряпочкой, слегка смоченной чистым бензином, эфиром или специальной смесью для чистки оптики.

Не рекомендуется протирать оптику объективов ксилолом, так как это может привести к их расклеиванию. С зеркал, имеющих наружное серебрение, можно только удалять пыль, сдувая ее резиновой грушей. Протирать их нельзя. Нельзя также самостоятельно развинчивать и разбирать объективы — это приведет к их порче.

По окончании работы на микроскопе необходимо тщательно удалить остатки иммерсионного масла с фронтальной линзы объектива указанным выше способом. Затем опустить предметный столик (или конденсор в микроскопах с неподвижным столиком) и накрыть микроскоп чехлом.

Для сохранения внешнего вида микроскопа необходимо периодически протирать его мягкой тряпкой, слегка пропитанной бескислотным вазелином и затем сухой мягкой чистой тряпкой.

Помимо обычной световой микроскопии существуют методы микроскопии, позволяющие изучать неокрашенные микроорганизмы: фазово-контрастная, темнопольная и люминесцентная микроскопия. Для изучения микроорганизмов и их структур, размер которых меньше разрешающей способности светового микроскопа используют электронную микроскопию.

Источник: https://nsau.edu.ru/images/vetfac/images/ebooks/microbiology/stu/bacter/microscop.htm

Тема 3 Микроскопические методы исследования

Микроскопы и способы микроскопии: В паразитологических исследованиях применяются методы оптической и

вмикробиологии: устройство микроскопаи основные приемы микроскопированияживых микроорганизмов

1 Особенностиразных видов микроскопии

2 Устройствосветлопольного микроскопа

3 Правила работыс иммерсионным объективом

4 Приемымикроскопирования живых микроорганизмов

1 Особенности разных видов микроскопии

Основными задачамимикроскопии являются следующие:

  • Выявление микроорганизмов в различных материалах.
  • Ориентировочная идентификация микроорганизмов в образце.
  • Изучение некоторых морфологических признаков и структур микроорганизмов (например, капсул, жгутиков и т. д.).
  • Изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.

На сегодняшнийдень наиболее используемой являетсясветовая микроскопия.

Световаямикроскопияобеспечивает увеличение до 2–3 тысячраз, цветное и подвижное изображениеживого объекта, возможность микрокиносъемкии длительного наблюдения одного и тогоже объекта, оценку его динамики и химизма.

Изображениев световом микроскопе формируетсявследствие того, что объект и различныеего структуры избирательно поглощаютсвет с различной длиной волны (абсорбционныйконтраст) или вследствие изменения фазысветовой волны при прохождении светачерез объект (фазовый контраст).

Основнымихарактеристиками любого микроскопаявляются разрешающая способность иконтраст. Разрешающаяспособность– это минимальное расстояние, на которомнаходятся две точки, демонстрируемыемикроскопом раздельно. Разрешениечеловеческого глаза в режиме наилучшеговидения равно 0,2 мм.

Контрастизображения –это различие яркостей изображения ифона. Если это различие составляет менее3–4 %, то его невозможно уловить ни глазом,ни фотопластинкой; тогда изображениеостанется невидимым, даже если микроскопразрешает его детали.

На контраст влияюткак свойства объекта, изменяющие световойпоток по сравнению с фоном, так испособности оптики уловить возникающиеразличия в свойствах луча. Возможностисветового микроскопа ограничены волновойприродой света.

Физические свойствасвета – цвет (длина волны), яркость(амплитуда волны), фаза, плотность инаправление распространения волныизменяются в зависимости от свойствобъекта. Эти различия и используются всовременных микроскопах для созданияконтраста.

Увеличениемикроскопаопределяется как произведение увеличенияобъектива на увеличение окуляра. Утипичных исследовательских микроскоповувеличение окуляра равно 10, а увеличениеобъективов – 10, 40 и 100.

Соответственно,увеличение такого микроскопа составляетот 100 до 1 000. Некоторые из микроскоповимеют увеличение до 2 000. Еще более высокоеувеличение не имеет смысла, так как приэтом разрешающая способность неулучшается.

Напротив, качествоизображения ухудшается.

Числовая апертураиспользуется для выражения разрешающейспособности оптической системы. Числоваяапертура – это оптический «охват»линзы, она является мерой количествасвета, попадающего в линзу. Числоваяапертура объектива указана на егооправе. Апертура конденсора должнасоответствовать числовой апертуреобъектива.

Числовая апертура любойлинзы, граничащей с воздухом (т.е. «сухойсистемы»), не может превысить 1, так какпоказатель преломления воздуха равен1. Числовую апертуру можно повысить,если увеличить показатель преломлениясреды между фронтальной линзой объективаи предметным стеклом, приблизив его кпоказателю преломления стекла (1,5).

Дляэтого между фронтальной линзой объективаи исследуемым объектом помещают каплюжидкости с показателем преломлениябольшим, чем показатель преломлениявоздуха, например, каплю воды (n= 1,3), глицерина (n= 1,4) или кедрового (иммерсионного) масла(n= 1,5).

Для каждой из указанных вышежидкостей выпускаются специальныеобъективы, которые называютсяиммерсионными.

Световаямикроскопия включаетобычную просвечивающуюмикроскопию (светло-, темнопольную),фазово-контрастную, люминесцентную. Впоследнее время разработаны и другиеспособы микроскопии и микроскопы –инверсионнаяиконфокальная лазерная сканирующаямикроскопия.

Светлопольнаямикроскопияпозволяет исследовать объекты впроходящем свете в светлом поле.

Данныйвид микроскопии предназначен дляисследования морфологии, размеровклеток, их взаимного расположения,структурной организации клеток и другихособенностей.

У светового микроскопамаксимальная разрешающая способностьсоставляет 0,2 мкм, что обеспечиваетвысокоточное увеличение микроскопа до1500х.

Фазово-контрастнаямикроскопияпозволяет более четко наблюдать живыепрозрачные объекты, которые имеюткоэффициенты преломления, близкие ккоэффициентам преломления среды.

Действие фазово-контрастного микроскопаосновано на интерференции света вплоскости изображения, обусловленнойсдвигом по фазе (при использованиифазового кольца в апертурной диафрагме).

При фазово-контрастной микроскопиичасто применяют биологические микроскопыс обратным расположением оптики –инвертированные микроскопы. У такихмикроскопов объективы расположеныснизу, а конденсор – сверху.

С помощьюфазово-контрастной микроскопии изучаютформу, размеры, взаимное расположениеклеток, их подвижность, размножение,прорастание спор микроорганизмов и т.д. Благодаряприменению этого способа микроскопииконтраст живых неокрашенных микроорганизмоврезко увеличивается и они выглядяттемными на светлом фоне (позитивныйфазовый контраст) или светлыми на темномфоне (негативный фазовый контраст).

Темнопольнаямикроскопияоснована на освещении объекта косымилучами света. При таком освещении лучине попадают в объектив, поэтому полезрения выглядит темным.

Такое освещениепрепарата достигается использованиемспециального темнопольного конденсора.Темнопольная микроскопия являетсяочень простым, но эффективным методоми хорошо подходит для полученияизображения живых и неокрашенныхбиологических образцов.

Учитываяпростоту установки, качество получаемыхизображений весьма хорошее.

При микроскопированиив темном поле можно увидеть объекты,величина которых измеряется сотымидолями микрометра, что находится запределами разрешающей способностиобычного светлопольного микроскопа.Однако наблюдение за объектами в темномполе позволяет исследовать толькоконтуры клеток и не дает возможностирассмотреть их внутреннюю структуру.

Люминесцентная(флуоресцентная) микроскопияоснована на способности ряда веществбиологического происхождения илинекоторых красителей светиться при ихосвещении невидимым ультрафиолетовымили синим светом. При использованииультрафиолетового света разрешающаяспособность микроскопа может достигать0,1 мкм.

Клеткимикроорганизмов обрабатывают специальнымикрасителями – флуорохромами (акридиновыйоранжевый, примулин, родамин и др.) ввиде сильно разбавленных водныхрастворов: 1:500–1:100 000. Такие растворыслабо токсичны, что дает возможностьизучать неповрежденную клетку.

Взависимости от химического состава,клеточные структуры в разной степениадсорбируют красители и люминесцируютразличным образом. Кроме того, флуорохромынеодинаково адсорбируются живыми имертвыми клетками.

Это позволяетиспользовать данный вид микроскопиидля цитологических и иммунологическихисследований, определения жизнеспособностиклеток и т. д.

Электроннаямикроскопияпозволяет обнаружить объекты, которыене разрешаются при использованиисветовых или ультрафиолетовых лучей.Теоретическиразрешениепросвечивающегоэлектронного микроскопасоставляет 0,002 нм; реальное разрешениесовременных электронныхмикроскоповприближается к 0,1 нм. На практикеразрешение для биологических объектовдостигает 2 нм.

Короткая длинаволны электронов позволяет различитьобъекты размером 0,5–1,0 нм. В современныхэлектронных микроскопах на экранедостигается увеличение 5000– 200 000.Благодаря столь высокому разрешениюстановится возможным выявление деталейбактериальных структур.

Например, спомощью напыления солей тяжелых металлов,окружающих бактерию и проникающих вповерхностные неровности, получаютконтрастирование за счет дифференциальнойзадержки электронов. Этот эффект получилназвание негативногоконтрастирования.

Электронныймикроскоп, в котором изображениеформируется благодаря прохождению(просвечиванию) электронов через образец,называют просвечивающим(или трансмиссионным).

В сканирующемэлектронном микроскопе (растроваяэлектронная микроскопия (РЭМ)пучок электронов быстро сканируетповерхность образца, вызывая излучение,которое формирует изображение насветящемся экране.

Для РЭМ характернывысокаяразрешающая способность, большойдиапазон увеличений (до 100 000 и выше),большая глубина фокусировки (~100 мкм),многообразие режимов работы.

Сканирующиймикроскоп дает картину поверхностей ипозволяет получать трехмерное изображение.

Лазернаяконфокальная микроскопиядает возможность получить отчетливоеизображение и наблюдать объекты в фокусепо всему полю. Данныйметод пригоден лишь для исследованиясамосветящихся (флуоресцентных) объектов.При сочетаниис компъютерной техникой возможнапространственная реконструкцияизучаемого объекта.

В конфокальном лазерном сканирующеммикроскопе изображения внутреннихсечений формируются за счет сканированиясфокусированным лазерным пучком отразных (405, 488, 532, 635 нм) лазеров ипространственной фильтрации излучения.При использовании сканирующей микроскопииближнего поля (СМБП) достигается высокаяразрешающая способность.

Наименьшийразмер элемента, полученного с помощьюСМБП, составляет 20 нм при длине волнысвета 0,486 нм. В изображении контролируемогоэлемента отсутствуют дифракционныеили интерференционные эффекты,затрудняющие определение его границ.

Отличительной особенностью СМБП посравнению с атомно-силовым микроскопомявляется чувствительность к оптическимхарактеристикам поверхности контролируемогообразца, длине волны света, люминесценциии др.

Компьютернаяинтерференционная микроскопияпозволяет получить высококонтрастноеизображение при наблюдении субклеточныхструктур; во многих случаях применяетсядля изучения живых клеток.

Принципдействия автоматизированногоинтерференционного микроскопа основанна интерференции световых пучковлазерного излучения, отраженного отопорного зеркала и зеркала, на которомпомещен измеряемый фазовый объект.

Теоретически предельнодостижимая разрешающая способностьможет составить в среднем 0,2 нм, практическиона составляет 0,4 мкм.

Рентгеновскаякомпьютерная томография (РКТ), позитроннаяэмиссионная томография(ПЭТ)позволяют наблюдать объекты в обычныхусловиях.

Источник: https://studfile.net/preview/5244850/page:8/

Методы микроскопии

Микроскопы и способы микроскопии: В паразитологических исследованиях применяются методы оптической и

Микроскопические методы исследования – это способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Широко применяются в бактериологических, гистологических, цитологических и других исследованиях.

Микроскопия – один из главных методов диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний, позволяющий определить вид возбудителя по форме, размерам, строению оболочки, цитоплазмы, ядра, взаиморасположению и способности окрашиваться определенными красителями; обнаружить яйца и личинки гельминтов, их фрагментов, вегетативных и цистных форм патогенных простейших.

Микроскоп – это оптический прибор, имеющий как минимум двухступенчатое увеличение. И одно из них принадлежит окуляру, который играет роль лупы. Только в отличие от бытовой лупы, окуляр имеет постоянное увеличение, его положение в микроскопе определено и жестко закреплено стандартом (высота окуляра).

Любой оптический микроскоп имеет базовые узлы, функциональное назначение которых не меняется от типа, класса прибора или страны производителя.

Разница только в конструкторском и технологическом решениях, предложенных специалистами фирм-разработчиков, а также уровне мирового научно-технического прогресса.

И как бы микроскоп не назывался – световой, цифровой, видеомикроскоп, фотомикроскоп, лазерный сканирующий микроскоп, анализатор изображения – в его основе будет базовый световой микроскоп, принцип которого был разработан еще Левингуком, Ньютоном, Карл Цейсом, Эрнстом Аббе.

Микроскоп – это оптико-механо-электрический прибор, объединяющий в себе три функциональные части:· функция воспроизводящей системы – воспроизвести (создать, сформировать) изображение объекта таким образом, чтобы оно как можно точнее передавало детали объекта с соответствующим разрешением, увеличением, контрастом и цветопередачей;· функция визуализирующей системы – передать изображение объекта, созданное воспроизводящей системой микроскопа, таким образом, чтобы оно с небольшим дополнительным увеличением (или без него) было видно достаточно резко на сетчатке глаза, фотопленке или пластинке, на экране телевизора или монитора компьютера;

· функция осветительной системы – создать световой поток, позволяющий осветить объект таким образом, чтобы воспроизводящая система микроскопа предельно точно могла выполнить свою основную функцию. При этом совместная работа обоих систем должна обеспечивать визуализацию изображения с использованием физико-химических свойств объекта.

Важнейшей характеристикой каждого объектива микроскопа является его разрешающая способность. Разрешающей способностью называется расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно (т.е. не сливаются в одну).

Для полного использования разрешающей способности иммерсионного объектива необходимо выполнять следующие основные правила:1) Конденсор осветительного аппарата должен быть поднят до отказа (до уровня предметного столика).

2) Диафрагма конденсора полностью открыта.

Во всех без исключения случаях работа ведется с применением встроенной подсветки или плоского зеркала, так как конденсор рассчитан на работу с параллельными пучками света.Одной из важных характеристик объектива является его свободное рабочее расстояние, т.е.

расстояние между верхней поверхностью препарата и нижней поверхностью фронтальной линзы объектива при наведенном на фокус объективе. Эти расстояния следующие:для объектива с увеличением 10х – 0,25 мм;для объектива с увеличением 40х – 0,65 мм;для объектива с увеличением 100х – 1,25 мм.

Знание этих расстояний необходимо для того, чтобы быстро сфокусировать объектив на препарат.

Классификация микроскопов

Микроскопы по объекту исследования можно разделить на следующие основные виды:
микроскопы плоского поля – это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в двумерном пространстве – двумерное изображение.

Объекты исследования – тонкие, в среднем, толщиной от 10 мм до 0,1 мм, просматриваемый слой от 1 мм до 0,001 мм. В этих микроскопах возможно наблюдение объемного изображения в пределах 100-200 мкм по высоте за счет особых способов освещения.

стереоскопические микроскопы – это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в трехмерном пространстве – объемное, трехмерное изображение. Объекты исследования – габаритные, в среднем, толщиной от 100 мм до 1 мм, просматриваемый слой по высоте/глубине – от 50 мм до 0,5 мм, и плоские.

Конструктивно микроскопы могут быть выполнены в двух вариантах:

прямые микроскопы (классическое построение схемы) – наблюдательная часть микроскопа расположена сверху объекта. Это относится к микроскопам плоского поля и стереомикроскопам.

инвертированные микроскопы (перевернутое построение схемы) – наблюдательная часть микроскопа расположена снизу объекта. Это относится только к микроскопам плоского поля.

По построению изображения микроскопы можно разделить следующим образом:
микроскопы светлого поля – на светлом фоне более темное изображение объекта. Освещение: обычный прямо проходящий свет.
микроскопы с методом косого освещения – на сером фоне контрастное изображение объекта с неровным по толщине контуром.

Освещение: обычный прямо проходящий свет частично перекрывается до того, как попадает объект.
микроскопы с методом темного поля – на темном фоне более светлое изображение объекта или ярко блестящий контур объекта.

Освещение:а) в микроскопах проходящего света – обычный прямо проходящий свет полностью перекрывается до того, как попадает на объект;б) в микроскопах отраженного света – обычный свет, проходя через кольцевую диафрагму с непрозрачным диском, по размеру перекрывающим выходной зрачок объектива.

микроскопы с методом фазового контраста – дают возможность с максимальной степенью визуализации и детальности наблюдать на сером фоне более темное «объемное» изображение объекта, окруженное по контуру светлой полосой; при негативном (темнопольном) фазовом контрасте картина обратная.

Освещение: обычный прямо проходящий свет перекрывается, но в два этапа – часть света до объекта, а затем после объекта прошедшая часть света перекрывается с ослаблением. При этом свет в виде светового кольца определенной площади проходит через объект, а затем после объекта – через полупрозрачное кольцо в объективе.

Кроме того в парке микроскопов имеются специализированные микроскопы :

люминесцентные микроскопы – обеспечивают возможность наблюдения на темном фоне свечения объектов.

Освещение: обычный прямо падающий свет определенной длины волны попадает на объект, изображение объекта строится в другой длине волны; выделение соответствующих областей спектра происходит с помощью сложной системы блоков интерференционных светофильтров.

поляризационные микроскопы – на сером или темном фоне разноцветное, четкое или контрастное изображение. Освещение: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, после объекта с помощью анализатора происходит выделение из структуры изображения тех элементов, которые связаны с анизотропией объекта.
микроскопы дифференциально-интерференционного контраста или интерференционного контраста – на однотонном цветном фоне яркое цветное «объемное» изображение или изображение того же цвета, что и фон, с окантовкой из другого цвета. Освещение: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, после объекта с помощью специальной призмы и анализатора происходит создание объемного цветного контрастного изображения.
ультрафиолетовые и инфракрасные микроскопы – освещение и наблюдение объекта с помощью электронно-оптических преобразователей вне видимого диапазона: до 400 нм и свыше 700 нм.

лазерные микроскопы – освещение и наблюдение объекта с помощью лазерного излучения (смотрите пример ниже).

Порядок работы со световыми микроскопами· Проверить состояние осветительного аппарата: поднять конденсор, открыть его диафрагму, включить питание и для установки интенсивности освещения медленно повернуть ручку настройки яркости, в случае отсутствия встроенной подсветки, поставить плоское зеркало.

· Поместить на столик микроскопа исследуемый препарат и установить в фокусе сухой объектив (10х) на расстояние несколько меньше свободного рабочего расстояния.· Глядя в окуляр, произвести предварительную установку освещения с помощью ручки настройки яркости (или вращая зеркалом).· Медленно поднимая тубус макровинтом, добиться резкого изображения препарата.

· Поставив сухой (40х) или иммерсионный (100х) объектив, опускать тубус микроскопа под контролем глаза, глядя сбоку. Опустить объектив на расстояние меньше свободного рабочего и, глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до тех пор, пока не появится мелькание препарата. Точная установка достигается с помощью микровинта.

Не следует делать микровинтом более половины оборота в одну или другую сторону.

Микроскопия неокрашенных объектовПри работе с нативным материалом необходимо соблюдать два основных принципа: не загрязнить исследуемый объект микроорганизмами, не заразить себя и окружающую среду.

При микроскопии необходимо помнить, что рассматривание неокрашенного препарата возможно только с ограниченным освещением, путем опускания конденсора или уменьшением отверстия ирис-диафрагмы. Для микроскопии неокрашенных объектов используется окуляр 10х и объектив 10х.

При освещении с помощью встроенной подсветки осветителя или плоского зеркала ирис-диафрагма частично закрыта, конденсор опущен. С помощью макровинта устанавливается поле зрения и проводится обзор препарата. С целью обнаружения объекта все нативные (неокрашенные) препараты просматривают под малым увеличением с помощью макровинта.

Для лучшего рассмотрения объекта или его отдельных фрагментов используется сухой объектив с увеличением 40х и освещенность, с помощью поднятия конденсора и открытия ирис-диафрагмы под контролем глаза.

Микроскопия окрашенных объектовПри микроскопии окрашенного препарата необходимо помнить, что рассматривание возможно только при полном освещении. Для микроскопии окрашенных объектов используется окуляр 10х и объектив 10х.

Ирис-диафрагма открыта, конденсор поднят. С помощью макровинта устанавливается поле зрения и проводится обзор препарата.

Достигается максимальное освещение препарата. При малом увеличении делается обзор препарата для обнаружения четко выраженных полей зрения. Изучение препарата проводится под большим увеличением с применением сухой системы объектив 40х.

Для микроскопии окрашенных препаратов биологической жидкости, мокроты, биологического материала применяется иммерсионная система объектив 100х с нанесением на предметное стекло иммерсионного масла.

Метод люминесцентной микроскопииЛюминесценция, основа многих современных методов биологических исследований, позволяет наблюдать за взаимоотношениями молекул внутри клеток.Фактором качественной работы для всех методов люминесцентных исследований является скорость.Основной целью современной люминесцентной микроскопии является визуализация всех измерений объекта.

Метод с большим эффектом может быть использован для ускорения диагностики ряда заболеваний.Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию.

Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета.Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуорохромами. Центральная часть клеток и присутствующие в препарате посторонние микробные клетки не светятся.

Ускоренная диагностика, идентификация возбудителя, обнаружение специфических антител в биологическом материале, биологической жидкости и во внешней среде осуществляется методами МФА, МИФ с применением люминесцирующих сывороток:- иммуноглобулины диагностические туляремийные люминесцирующие – диагностика туляремии;- иммуноглобулины диагностические бруцеллезные люминесцирующие – диагностика бруцеллеза;-иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические люминесцирующие – диагностика сибирской язвы;-иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные антиспоровые адсорбированные флуоресцирующие – диагностика сибирской язвы;-иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные адсорбированные лошадиные – диагностика холеры;- антигенный препарат с хантавирусным антигеном – диагностика ГЛПС;- иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие для быстрой диагностики гриппа, ОРВИ.

Антигены, вирусы гриппа и другие возбудители ОРВИ в инфицированных клетках по их характерной локализации выявляются в результате взаимодействия антигенов с противовирусными антителами, маркированными флуоресцеинизотиоцианатом, методом МИФ. Метод иммунофлуоресцентного анализа (МИФ) является высоко чувствительным и специфичным качественным иммунодиагностическим тестом. К числу преимуществ метода относится его исключительная простота и возможность быстрого (за 1-2 часа) анализа клинических материалов с распознаванием широкого круга возбудителей, включая вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирусы, аденовирусы, вирусы герпеса.

Источник: http://www.cgekuban.ru/publication/ilc/micro.php

Общий метод: наблюдение. Частный метод: микроскопирование.

: Наблюдение коралла под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом.

Christine E. Farrar, Zac H. Forsman, Ruth D. Gates, Jo-Ann C. Leong, and Robert J. Toonen, Hawai'i Institute of Marine Biology at the University of Hawai'i, Manoa

No dyes or digital software produced the brilliant color of these corals—the glory is all their own. Fluorescent molecules, innate to the corals and to the red algae that live inside and nourish them, shine Christmas lights under different wavelengths of light emitted by a confocal microscope.

When she saw the corals under the lens for the first time, “my jaw just dropped,” says Ruth Gates, a coral biologist at the University of Hawai'i, Manoa, and the narrator of the video. “Most people think corals are inanimate rocks,” she says.

“We showcase how beautiful and dynamic they are as animals.” In the video, which compiles the images into three-dimensional, time-lapse animations, corals extend and retract their glowing tentacles.

Tiny creatures crawl over the corals, all part of a complex and threatened ecosystem. In the future, Gates says, it might be possible to use confocal microscopy to classify different coral species or diagnose coral disease by their fluorescent patterns.

Prior to applying this technique, she says, “that was not even a facet in our thinking about coral biology.”

Источник: http://kineziolog.su/content/metody-mikroskopii

Микроскопические методы исследования

Микроскопы и способы микроскопии: В паразитологических исследованиях применяются методы оптической и

Микроскопические методы исследования — способы изучения микроскопического строения различных объектов, размеры которых находятся за пределами разрешающей способности глаза.

Микроскопические методы исследования играют важную роль в бактериологических, вирусологических, цитологических, гематологических, гистологических и других исследованиях; их применяют также в фармакологии, химии, минералогии, кристаллографии и др.

Среди Микроскопических методов исследования наряду с обычной световой микроскопией широко используют стереоскопическую, темнопольную, интерференционную, фазово-контрастную, поляризационную, ультрафиолетовую, электронную микроскопию и др.

Основой для развития Микроскопических методов исследования явились работы Аббе (Е. К. Abbe) но дифракционным свойствам электромагнитного излучения. С помощью теории Аббе определяют разрешающую способность микроскопов и изготавливают линзы, лишенные хроматической и сферической аберрации, объективы, дифракционные решетки, осветительный и рисовальный аппараты.

Дифракционная решетка Аббе служит для изучения явлений дифракции и состоит из системы тонких прозрачных и непрозрачных чередующихся линий, к-рые прорезают специальным резцом в толще металлического покрытия, нанесенного на стеклянную подложку.

Осветительный аппарат Аббе применяют в микроскопах для освещения объекта в проходящем свете.

Он состоит из зеркала (плоского или вогнутого) и конденсора, посредством к-рых поток света направляют в плоскость объекта в виде сходящегося пучка лучей, что обеспечивает более высокую освещенность препарата и улучшает разрешающую способность микроскопа.

Конденсор состоит, как правило, из двух-трех линз; ближнюю к объективу линзу устанавливают так, чтобы ее плоская поверхность была параллельна плоскости предметного столика микроскопа. При удалении конденсора от плоскости объекта яркость освещения снижается, однако возрастает контрастность изображения.

Рисовальный аппарат Аббе служит для зарисовки с гистол, препаратов.

Он состоит из расположенной над окуляром микроскопа системы стеклянных призм, к-рая направляет в глаз исследователя световые лучи, прошедшие через гистол, препарат и отраженные с помощью зеркала от листа бумаги, лежащей возле микроскопа. Благодаря этому наблюдатель видит совмещенное изображение препарата и своей руки, очерчивающей, напр., карандашом контуры деталей гистол, картины препарата.

При пользовании М. м. и. важное значение приобретает правильная установка освещения, к-рую обычно проводят по методу Келера. Для этого автономный осветитель, напр. ОИ-19, располагают так, чтобы плоскость ирисовой диафрагмы осветителя находилась на расстоянии 15—25 см от центра зеркала микроскопа.

Затем через закрытую на 1/2—1/3 диафрагму проецируют изображение нити лампы накаливания осветителя в центр зеркала микроскопа, прикрытого для облегчения наблюдения листом белой бумаги.

Изменяя расстояние между микроскопом и осветителем, производят фокусировку изображения нити накаливания и затем зеркалом микроскопа направляют изображение в его объектив.

При этом величина освещенного пятна должна совпадать с диаметром апертурной диафрагмы микроскопа, резкое изображение к-рой можно получить, изменяя положение конденсора и плоскости зеркала. В заключение раскрывают апертурную диафрагму микроскопа и с помощью макро- и микровинтов микроскопа получают яркое и четкое изображение объекта.

При работе с малыми увеличениями микроскопа этот способ не всегда позволяет получить полное и равномерное освещение поля зрения. В этих случаях снимают или отводят в сторону фронтальную линзу конденсора, применяют конденсор с большим фокусным расстоянием.

При широко открытой апертурной диафрагме микроскопа изображение бывает недостаточно контрастным. В процессе диафрагмирования увеличивается контрастность изображения и возрастает глубина резкости, но может снизиться разрешающая способность микроскопа за счет нарастающих при этом дифракционных явлений.

При смене объектива изображение следует снова сфокусировать в фокальной плоскости при закрытой диафрагме осветителя. В случае отклонения оси осветителя от оси объектива микроскопа края изображения могут быть освещены неодинаково.

Чтобы освещенность краев изображения стала одинаковой и равномерной по всей площади поля зрения, наблюдая изображение через окуляр, перемещают осветитель.

Установку освещения по методу Келера применяют также при изучении препаратов в так наз. темном поле. В этом случае заменяют обычный конденсор темнопольным и, наблюдая в окуляр, медленно поднимают конденсор до возникновения темнопольного изображения.

Объекты, изучаемые под микроскопом, могут быть прозрачными, а также непрозрачными, т. е. изменяющими амплитудные и фазовые свойства направленного на них электромагнитного излучения. В зависимости от свойств объекта изменяются физ. свойства света — цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плоскость и направление распространения волны, что используют в М. м. и.

Для микроскопического исследования окрашенных объектов применяют световой микроскоп. Цвет изображения и различия в окраске нередко позволяют судить о хим. природе отдельных структур изучаемого объекта, но не дают возможности оценить его жизнедеятельность (движение, хемотаксис, слияние и др.), т.к. при окраске часто используют хим.

или температурную фиксацию, убивающую биол, объект, но обеспечивающую эффективное окрашивание. В отличие от исследования фиксированных биол, объектов, витальная микроскопия основана на прижизненном окрашивании, в результате к-рого многие структуры живой клетки мало изменяются под действием специальных красителей.

Витальная микроскопия может проводиться и без окрашивания, если в обычный световой микроскоп ввести темнопольный конденсор.

Самостоятельным вариантом темнопольной микроскопии (см.) является ультрамикроскопия, при к-рой мельчайшие частицы изучаемого объекта освещают боковым пучком света и на темном фоне они выглядят в виде точек. С помощью ультрамикроскопа (см.) удается измерять частицы и определять нек-рые свойства изучаемых объектов.

Для фазово-контрастной и амплитудно-контрастной микроскопии применяют микроскопы, в к-рых луч света подвергается дифракции в зависимости от особенностей изучаемого объекта; при этом изменяется длина и фаза волны света. Живые микроскопические объекты в световом микроскопе выглядят прозрачными и почти не изменяют амплитуды и цвета светового луча и вызывают лишь сдвиг фазы его волны.

Лучи света, прошедшие через изучаемый объект, отклоняются от вложенной в объектив специальной полупрозрачной фазовой пластинки, и, т. о., между лучами фона и объекта возникает разность длины волны.

Если эта разность достигает 1/4 длины волны, то возникает заметный для глаза эффект, когда темный объект отчетливо виден на светлом фоне или, наоборот, в зависимости от структуры фазовой пластинки (см. Фазово-контрастная микроскопия). Пластинки, изменяющие только яркость и цвет фона, используют в амплитудно-контрастном или аноптральном микроскопе.

Амплитудно-контрастное устройство может быть установлено также на биол, микроскоп. Эти микроскопы значительно расширяют возможности прижизненного исследования биол, объектов без предварительной фиксации и окраски препарата.

Интерференционная микроскопия построена примерно на тех же принципах, что и фазово-контрастная, но, в отличие от нее, дает возможность получать количественные данные.

С помощью интерференционного микроскопа можно измерять разность фаз, вызываемую различными клеточными структурами, и определять их массу.

Последовательные измерения разности фаз в двух средах с известными показателями преломления дают возможность одновременно определять толщину объекта, концентрацию сухого вещества, содержание воды и позволяют косвенным образом судить о клеточном метаболизме, проницаемости мембран, активности ферментов. Интерференционная микроскопия находит применение в цитол, исследованиях, используется для количественного анализа клеточных структур живых объектов, напр, культур тканей, простейших и т. п.

Поляризационная микроскопия основана на различном преломлении структурными компонентами клеток и тканей поляризованного света.

В одних из них свет распространяется с одинаковой скоростью независимо от плоскости поляризации (изотропные структуры), в других — скорость распространения поляризованного света зависит от направления его по продольной или поперечной оси объекта (анизотропные структуры). Ряд биол, объектов (миофибриллы, мерцательные реснички и др.

) имеет строгую молекулярную ориентацию, является анизотропным и обладает двойным лучепреломлением. Поляризованный свет формируют при помощи специальных поляризаторов — пленчатых поляроидов или призм Николля, к-рые помещают в микроскопе между источником света и изучаемым объектом.

Образованный ими пучок плоскополяризованного света разлагается на два луча, поляризованных во взаимно перпендикулярных плоскостях. Один из этих лучей проходит через анизотропные структуры объекта, запаздывая относительно другого. При выходе из объекта оба луча оказываются в разных фазах.

Когда показатель преломления вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, говорят о положительном двойном лучепреломлении, при обратных отношениях — об отрицательном двойном лучепреломлении. Структуры клетки, образованные ориентированными белковыми молекулами, обладают собственным положительным двойным лучепреломлением.

Характер лучепреломления поляризованного света, величина анизотропии в сочетании с изменением этих оптических показателей после экстракции жирорастворителями позволяют судить о молекулярной организации структуры. Напр.

, в результате исследований миелиновых оболочек нервов с помощью поляризационного микроскопа было обнаружено радиальное по отношению к продольной оси нерва расположение молекул липоидных веществ и перпендикулярное по отношению к ним расположение макромолекул белка. Сходное расположение белково-липоидных элементов обнаруживается в эритроцитах и хлоропластах. С помощью поляризационного микроскопа в гаверсовых системах трубчатых костей обнаружены пластины с продольной и циркулярной ориентацией фибрилл. Кроме того, по характеру двойного лучепреломления изучают форму вирусов, белковых макромолекул и т. п.

В поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные тканевые срезы, приготовленные на замораживающем микротоме или залитые в парафин.

В частности, липиды и миелин исследуют на замороженных срезах, тогда как исследование поперечнополосатой мышечной ткани и кристаллов можно производить как в парафиновых, так и замороженных срезах.

Двойное лучепреломление коллагена, отчетливо проявляющееся в таких средах, как капрат целлюлозы или смолы, может полностью утрачиваться в препаратах, заключенных в смесь глицерин-желатин.

В научных и практических исследованиях широко применяют люминесцентную микроскопию (см.), для к-рой используют ультрафиолетовые лучи или сине-фиолетовую часть спектра. Нек-рые внутриклеточные образования, напр, липиды, обладают собственной (первичной) люминесценцией (см.). Другие компоненты клетки могут люминесцировать после предварительной окраски так наз. флюорохромами (см.).

Ультрафиолетовая микроскопия используется в цитол, и гистохимических исследованиях.

Она позволяет изучать локализацию, количественное распределение в клетках и тканях высокомолекулярных соединений (белки, нуклеиновые кислоты) и наблюдать за их динамикой в процессе жизнедеятельности.

Этот метод дает возможность без предварительной фиксации и окраски препаратов рассматривать исследуемый материал, напр., с целью прижизненного изучения микрообъектов.

Ультрафиолетовая абсорбционная микроскопия основана на способности нек-рых веществ, входящих в состав тканей и клеток, прозрачных в видимом свете, поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны.

При исследовании живых или фиксированных неокрашенных объектов возрастает контрастность изображения за счет избирательного поглощения ультрафиолетовых лучей высокомолекулярными соединениями. В частности, важное значение ультрафиолетовая микроскопия имеет для изучения распределения в клетке нуклеиновых к-т, поглощающих ультрафиолетовое излучение в участке спектра ок. 260 нм.

Поглощение ультрафиолетового излучения белками зависит от входящих в их состав ароматических аминокислот (тирозина, триптофана, фенилаланина), дающих максимум поглощения в участке спектра ок. 280 нм. Для получения наглядного представления о распределении в препарате веществ изучаемый участок фотографируют в ультрафиолетовом свете с разной длиной волн.

В последующем фотоснимки переснимают на цветную пленку в хромоскопе, в к-ром перед снимком, сделанным в коротковолновых лучах, помещают синий светофильтр, в лучах средней длины — зеленый и в длинноволновых лучах — красный светофильтр.

Эти снимки с помощью специального приспособления совмещают на экране, и изображение становится видимым, передавая условными цветами различия поглощения ультрафиолетовых лучей отдельными структурами клетки.

Ультрафиолетовую флюоресцентную микроскопию, как и абсорбционную, используют для цитохимического изучения живых или фиксированных неокрашенных объектов, в связи с тем что спектры ультрафиолетовой флюоресценции веществ отличаются друг от друга.

Инфракрасная микроскопия дает возможность установить структуру объекта по характеру поглощения света с длиной волн 800—1000 нм.

Широкое распространение имеет исследование в инфракрасном свете веществ, частично или полностью непрозрачных в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для инфракрасной микроскопии биол, объекты не подвергают дополнительной хим. обработке.

При помощи инфракрасного микроскопа производят исследование импрегнированной нервной ткани и капилляров в гистол, срезах, распознают повреждения сетчатки и радужной оболочки глаза.

Стереоскопическая микроскопия позволяет исследовать непрозрачные объекты и создает эффект объемного изображения. Ее применяют, напр.

, для исследования секционного, операционного и биопсийного материала, для проведения работ с помощью метода макромикроскопии (см.).

В судебной медицине стереоскопическую микроскопию используют для изучения органов и тканей трупа, а также для исследования различных вещественных доказательств (см.).

Для повышения разрешающей способности М. м. и. создают оптические системы, основанные на электромагнитных линзах с применением в качестве источника излучения потока электронов, напр, для электронной микроскопии (см.

) используют пучок быстрых электронов, а роль линз выполняют электрические и магнитные поля определенной конфигурации.

Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая (растровая) микроскопия, к-рая дает возможность получить объемное изображение объекта за счет излучаемых им вторичных электронов.

В нек-рых микроскопах плавное, бесступенчатое увеличение без смены объектива позволяет в пределах широкого диапазона установить интересующие детали объекта, напр, динамику биол, процессов, происходящих в тканевых культурах.

См. также Микроскоп, Окраска микроорганизмов.

Библиография:

Аппельт Г. Введение в методы микроскопического исследования, пер. с нем., М., 1959, библиогр.;

Биофизические методы исследования, под ред. Ф. Юбера, пер. с англ., М., 1956; Де Робертис Э., Новинский В. и Саус Ф. Биология клетки, пер. с англ., с. 94, М., 1973; Дитчберн Р. Физическая оптика, пер. с англ., М., 1965; Ильин P. С.

, Федотов Г. И. и Федин Л. А. Лабораторные оптические приборы, М., 19 66, библиогр.; Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., с. 7, М., 1969; Скворцов Г. Е. и др. Микроскопы, Л., 1969, библиогр.

Н. К. Пермяков, Г. М. Могилевский.

Источник: https://xn--90aw5c.xn--c1avg/index.php/%D0%9C%D0%98%D0%9A%D0%A0%D0%9E%D0%A1%D0%9A%D0%9E%D0%9F%D0%98%D0%A7%D0%95%D0%A1%D0%9A%D0%98%D0%95_%D0%9C%D0%95%D0%A2%D0%9E%D0%94%D0%AB_%D0%98%D0%A1%D0%A1%D0%9B%D0%95%D0%94%D0%9E%D0%92%D0%90%D0%9D%D0%98%D0%AF

Medic-studio
Добавить комментарий