Молекулярно-генетические методы исследования – ПЦР- диагностика

Молекулярно-генетическое исследование (FISH, ПЦР, секвенирование)

Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика

Молекулярно-генетическое исследование является дополнительным методом диагностики, применяемым в патологической анатомии при исследовании различных злокачественных новообразований, когда постановка диагноза по гистологическим или иммуногистохимическим препаратам не представляется возможной или требуется уточнение ряда клинически важных параметров заболевания на генетическом уровне.

Зачем?

Методики, применяемые при молекулярно-генетическом исследовании, основаны на выявлении в анализируемом образце ткани генетических аномалий (в т.ч. мутаций), позволяющих:

  • отличить один вид опухоли от другого (дифференциальная диагностика),
  • выявлять маркеры, отвечающие за лекарственную чувствительность опухоли,
  • выявлять маркеры, связанные с благоприятным или агрессивным течением заболевания.

Список генетических аномалий, определяемых в лаборатории молекулярной патологии Отдела патологической анатомии опухолей человека

Вид опухолиГенетическая аномалияМетод
Рак молочной железыРак желудкаРак (аденокарцинома) толстой кишкиНемелкоклеточный рак легкогоАмплификация гена HER 2/neuFISH
Рак молочной железыНемелкоклеточный рак легкогоАмплификация гена EGFRFISH
НейробластомаАмплификация гена N-mycFISH
НейробластомаДелеция локуса 1р36FISH
НейробластомаДелеция локуса 11q23FISH
Опухоли головного мозга (олигодендроглиома)Делеция 1р36, делеция 19q13FISH
Саркома Юинга (примитивная нейроэктодермальная опухоль)Светлоклеточная саркомаТранслокация участка 22q12FISH
Синовиальная саркомаТранслокация участка 18q11.2FISH
Немелкоклеточный рак легкогоТранслокация гена ALKFISH
Немелкоклеточный рак легкогоТранслокация гена ROS1FISH
Герминогенные опухолиИзохромосома 12рFISH
Миксоидная липосаркомаТранслокация гена DDIT3 (12q13)FISH
Альвеолярная рабдомиосаркомаТранслокация гена FKHR (13q14)FISH
Рак почкиАнеуплоидия теломерного участка 3рFISH
Рак мочевого пузыряПолисомия 3,7,17 хромосом, делеция локуса 9p21FISH
Рак предстательной железыРак и предрак эндометрия (тела матки)Амплификация гена AR(Xq12)FISH
Опухоли различного генезаПлоидность хромосом X,Y/FISH
Рак мочевого пузыряЗлокачественная мезотелиомаДелеция p16 (9p21)FISH
Рак почкиРак желудкаРак легкогоАмплификация гена C-METFISH
Рак почкиТранслокация TFE3(Xp11)FISH
Лимфома БеркиттаТранслокация t(8;14)(q24;q32)FISH
Лимфома БеркиттаТранслокация гена c-MYC t(8;22)(q24;q11), t(2;8)(p11;q24)FISH
Лимфома зоны мантииТранслокация t(11;14)(q13;q32.3)FISH
MALT лимфомаТранслокация t(11;18)(q21;q21)FISH
Фолликулярная лимфомаТранслокация t(14;18)(q32;q21)FISH
ЛимфомыТранслокация гена BCL6FISH
Рак (аденокарцинома) толстой кишкиМутация гена K-RASПЦР-секвенирование
Рак (аденокарцинома) толстой кишкиМеланомаМутация гена BRAFПЦР-секвенирование
Немелкоклеточный рак легкогоМутация гена EGFRПЦР-секвенирование
Гастроинтестинальные опухолиМеланомаМутация гена c-kitПЦР-секвенирование
Гастроинтестинальные опухолиМутация гена PDGFRAПЦР-секвенирование
Опухоли головного мозгаМеланомаМетилирование гена MGMTПЦР-секвенирование
Диффузные глиомыМутация гена IDH1ПЦР-секвенирование
Диффузные глиомыМутация гена IDH2ПЦР-секвенирование
Рак ротоглоткиОпределение ВПЧ 16 и 18 типовПЦР
Рак (аденокарцинома) толстой кишкиОпухоли головного мозгаОпределение микросателлитной нестабильности (MSI)Фрагментарное секвенирование
Рак (аденокарцинома) толстой кишкиМутация гена PIK3CAПЦР-секвенирование
ЛипосаркомаАмплификация гена MDM2FISH
Рак предстательной железыДелеция участка TMPRSS2-ERG (21q22)FISH
Рак молочной железыДелеция гена PTENFISH
Увеальная меланомаМоносомия 3-ей, 8-ой хромосомыFISH
Рак (аденокарцинома) толстой кишкиМутация гена N-RASПЦР-секвенирование
МедуллобластомаАмплификация гена C-MYCFISH
МедуллобластомаОпределение наличия или отсутствия изохромосомы 17q (iso17q)FISH

Стоимость

Узнать о стоимости молекулярно-генетического исследования можно в регистратуре лаборатории молекулярной патологии (2 этаж, каб.№2199).

Если у меня есть полис ОМС, должен ли я платить за молекулярно-генетическое исследование?

В связи с тем, что молекулярно-генетическое исследование не входит в перечень медицинских услуг, выполняемых по ОМС, оплата данного вида исследований осуществляется засчет личных средств пациента.

За более подробной информацией рекомендуем обращаться в вашу страховую компанию.

Сроки выполнения молекулярно-генетических исследований

В соответствии с п.24 Приказа №179н от 24.03.2016 г. Минздрава России, срок выполнения молекулярно-генетического исследования одной генной аномалии должен составлять не более 10 рабочих дней.

Источник: https://www.ronc.ru/grown/treatment/diagnostics/molekulyarno-geneticheskoe-issledovanie-fish-ptsr-sekvenirovanie/

Молекулярно-биологические исследования

Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика

Проведение полимеразной цепной реакции «в реальном времени» (Real Time PCR) является наиболее качественным и быстрым методом исследования. Метод ПЦР универсален – одна порция биологического материала позволяет провести исследования на наличие возбудителей целого ряда заболеваний.

Почему ПЦР диагностика обладает такой ценностью?

Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность – от 95 до 100%.

ПЦР в диагностике инфекций

Преимущества метода ПЦР (чувствительность и специфичность) определяют широкий спектр применения в современной медицине.

Метод ПЦР автоматизирован и позволяет получить результаты анализа в течение одного рабочего дня.

ПЦР используется в акушерстве, гинекологии, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, клинике инфекционных болезней, офтальмологии, неврологии, фтизиопульмонологии и др.

    Основные области применения ПЦР-диагностики:
  • 1. диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний различной локализации
  • 2. контроль эффективности проведенной терапии
  • 3. уточнение вида возбудителя

Метод ПЦР позволяет проводить диагностику многих инфекционных заболеваний со сложной серологической картиной, определять «вирусную нагрузку» в крови пациента, выявлять дисбиоз урогенитального тракта у женщин и мужчин.

Основное направление – ДИАГНОСТИКА инфекций, передаваемых половым путем (ИППП).

Половым путем могут передаваться бактериальные (гонорея, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, гарднереллез), вирусные (герпес, цитомегаловирус, гепатит), протозойные (трихомониаз) и грибковые (кандидоз) инфекции.

Для быстрой, полной и недорогой диагностики инфекций, передаваемых половым путем, был разработан комплексный ПЦР анализ на 6, 10 и 11 основных возбудителей.

    Молекулярно-биологические исследования методом ПЦР«в реальном времени»:
  • Диагностика методом ПЦР «в реальном времени» бактериальной и вирусной инфекции урогенитального тракта;
  • Полное скрининговое исследование методом ПЦР на 11 инфекций (микоплазма хоминис, микоплазма гениталиум, уреаплазма уреалитикум/парвум, гарднерелла вагиналис, нейссерия гонорея, хламидия трахоматис, трихомонады, кандида альбиканс, цитомегаловирус, вирус простого герпеса, вирус Эпштейн-Барр);
  • Сокращенное скрининговое исследование методом ПЦР на 6 инфекций (микоплазма хоминис, микоплазма гениталиум, уреаплазма уреалитикум/парвум, гарднерелла вагиналис, хламидия трахоматис, трихомонады);
  • Скрининговое исследование методом ПЦР на 6 инфекций при ЛОР-заболеваниях (микоплазма хоминис, хламидия трахоматис, кандида альбиканс, цитомегаловирус, вирус простого герпеса, вирус Эпштейн-Барр);
  • Диагностика методом ПЦР «в реальном времени» вирусной инфекции в крови и тканях;
  • Диагностика методом ПЦР «в реальном времени» клинически значимого уровня папилломавирусной инфекции, и генотипирование;
  • Диагностика методом ПЦР «в реальном времени» вирусных гепатитов, их генотипирование (качественное и количественное определение);
  • Определение полиморфизма гена IL28B, ассоциированного с устойчивостью к терапии интерфероном и рибавирином у пациентов с гепатитом С, генотип 1Б. Выявление факторов, влияющих на успех лечения, в том числе генетических, имеет большое значение, как для врача, которому необходимы объективные критерии прогноза эффективности лечения, так и для пациента, который перед началом проведения стандартной терапии должен быть информирован о вероятности ее успеха и побочном действии используемых противовирусных препаратов. Определение генотипа пациента по IL28B поможет в принятии решения о применении стандартного курса терапии хронического гепатита С ПЕГ ИФН/РИБ и при необходимости индивидуальной оптимизации терапии за счет включения ингибиторов протеазы – телапревира и боцепревира.

    Молекулярно-генетические исследования методом ПЦР «в реальном времени» молекулярно-генетические исследования, которые выявляют предрасположенность к различным заболеваниям
  • Для здоровых, успешных людей, взявших за правило планировать жизнь и просчитывать все возможные риски, в том числе и риски, связанные со здоровьем.
  • Для заботливых родителей, желающих оценить риск тех или иных заболеваний у своих детей.
  • Для будущих мам, стремящихся свести к минимуму угрозы для нормального развития плода.
  • Для лиц, отягощенных наследственностью по онкологическим, сердечно-сосудистым и другим заболеваниям, желающим знать насколько велик риск этих заболеваний для них.

    Молекулярно-генетическая диагностика наследственной предрасположенности к широко распространенным заболеваниям (остеопорозу, заболеваниям, связанным с нарушением метаболизма кальция, ожирению, гипертонии, заболеваниям, связанным с нарушением фолатного цикла и с риском развития тромбофилии).
  • Основным направлением в работе лаборатории является исследование генетических факторов предрасположенности к тромбофилиям. Тромбофилия – патологическое состояние организма, характеризующееся повышенной склонностью к внутрисосудистому тромбообразованию вследствие врожденного, наследственного или приобретенного нарушения системы гемостаза, приводящего к утрате одной из ее основных функций – поддержания циркулирующей крови в жидком состоянии.

    Исследование генетической предрасположенности к тромбофилии показано в следующих случаях:
  • Наличие в анамнезе двух и более прерываний беременности на ранних сроках;
  • Наличие в анамнезе тяжёлых осложнений беременности (гестоз, задержка развития плода, внутриутробная гибель плода);
  • Наличие родственников с тромботическими проявлениями в возрасте до 50 лет (инфаркт миокарда, ОНМК, тромбоэмболия лёгочной артерии, тромбоз глубоких вен нижних конечностей и др.);
  • Несколько неудачных попыток ЭКО;
  • Повышение уровня антифосфолипидных антител и/или гомоцистеина;
  • Планирование гинекологических оперативных вмешательств;
  • Назначение оральных гормональных контрацептивов (ОК). Женщинам с эпизодом венозной тромбоэмболии, получающим оральные контрацептивы;
  • Назначение заместительной гормональной терапии. Женщинам с эпизодом венозной тромбоэмболии, получающим заместительную гормональную терапию;
  • Курящим мужчинам в возрасте до 50 лет с эпизодом венозной тромбоэмболии;
  • Наличие тромбофлебита.
    • Определение генетических полиморфизмов:
    • наследственной предрасположенности к гипертонической болезни,
    • генетической предрасположенности к гипертонической болезни и атеросклерозу,
    • генетической предрасположенности к ожирению с нарушением обмена липопротеинов,
    • нарушения метаболизма кальция,
    • наследственной предрасположенности к остеопорозу,
    • генетической предрасположенности к развитию рака молочной железы и яичников генов BRCA1 и BRCA2.

    График выдачи результатов молекулярно-биологических и цитогенетических исследовании

    ПЦР исследования на 2-4 рабочий деньТромбозы+ фолаты (код 73038), гипертоническая болезнь (код 73044), ожирение (код 74044Б) – 7 рабочих днейИнтерлейкин (код 73045)– выдача результатов каждый четвергМетаболизм кальция (код 7061) – 4 рабочих дняBRCA (код 73039) , остеопороз (код 74063), расширенная панель (73060) – 14 рабочих дней День забора материала не считаетсяЦитогенетические исследования выполняются в течение 14-18 рабочих дней

    Назад

    Социальные кнопки для Joomla

Источник: http://rokdc.ru/index.php/laboratornye-issledovaniya/75-informatsiya/laboratornye-issledovaniya/736-molekulyarno-biologicheskie-issledovaniya

Молекулярно-генетические методы

Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика

Молекулярно-генетическиеметодыизучения наследственности человека –это большая группа методов, позволяющихвыявлять варианты структуры исследуемогоучастка ДНК. В основе методов лежатразличные манипуляции с ДНК и РНК.

ВыделениеДНК

Первымэтапом любого молекулярно-генетическогоисследования является выделениенуклеиновых кислотиз образца ткани. Для выделения ДНКпригодны любые ядросодержащие клеткиорганизма. Чаще всего на практикеиспользуется периферическая кровь(лейкоциты).

Выделеннаяиз клеток ДНК представляет собой весьгеном организма (геномная ДНК). Длявыделения ДНК применяется обработкакрови солевыми растворами различнойконцентрации для разрушения плазматическоймембраны и ядерной оболочки и очисткапрепаратов. Выделенная ДНК пригоднадля любых молекулярно-генетическихисследований и может продолжительноевремя сохраняться в замороженном виде.

Вбольшинстве случаев для анализа(например, для диагностики болезни)достаточно исследования небольшогофрагмента генома. Для этого исследуемыйфрагмент необходимо получить в большомколичестве копий (амплифицикация).Амплифицировать фрагмент ДНК можно припомощи методов молекулярногоклонирования и полимеразной цепнойреакции (ПЦР).

Молекулярноеклонирование

Молекулярноеклонирование(генная инженерия, технология рекомбинантныхДНК) – это совокупность методов,позволяющих осуществлять переносгенетического материала (ДНК) из одногоорганизма в другой.

Молекулярноеклонирование состоит из следующихэтапов:

  • Выделение ДНК из организма – донора;
  • Расщепление ДНК ферментами рестриктазами с образованием фрагментов ДНК с «липкими концами»;
  • Расщепление векторной молекулы (плазмида, фаг, космида и др.) той же рестриктазой, что и исследуемый образец ДНК;
  • Лигирование (сшивание) векторной молекулы и фрагмента исследуемой ДНК с образованием гибридной (рекомбинантной) молекулы;
  • Введение рекомбинантной молекулы в клетку-хозяина (реципиента). Этот процесс называется трансформацией.
  • Отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки);
  • Получение специфического белкового продукта, синтезируемого клетками-хозяевами.

Длямолекулярного клонирования необходимо:

  1. Ферменты рестриктазы

  2. Клонирующий вектор

  3. Встраиваемая ДНК (ген, фрагмент гена)

Рестриктазы– ферменты, разрезающие ДНК в строгоопределенном месте (сайте). Рестриктазывыделяют из клеток бактерий разныхвидов. Каждая рестриктаза узнает толькосвой сайт рестрикции. В настоящее времявыделено более 500 рестриктаз.

Например,рестриктаза EcoRIузнает и расщепляет ДНК по палиндромнойнуклеотидной последовательности GAATTC.В результате расщепления образуютсякомплементарные одноцепочечные «липкие»концы:

GAATTC

CTTAAG → обработка рестриктазой EcoRI→

G AATTC

CTTAAG G

Векторамидля молекулярного клонирования являютсямолекулы ДНК, которые могутдоставлять в клетку-хозяина чужероднуюДНК. Вектор должен быть небольшогоразмера, иметь сайт рестрикции, в которыйможет быть осуществлена вставка, иметьодин или более селективный генетическиймаркер для отбора реципиентных клеток,несущих чужеродную ДНК. Векторами дляклонирования являются:

  1. Плазмиды – кольцевые двухцепочечные экстрахромосомные самореплицирующиеся молекулы ДНК бактерий. В плазмидах клонируют фрагменты ДНК до 10 т.п.н.

  2. Фаги. Первыми были разработаны выкторы на основе фага λ E. coli. ДНК фага λ составляет примерно 50 т.п.н. Значительная часть (20т.п.н.) несущественна для размножения фага и может быть заменена на чужеродную ДНК. В фаге можно клонировать фрагмент ДНК до 20т.п.н.

  3. Космиды – векторы, объединяющие в себе свойства плазмиды и фага. Созданы искусственно. Могут амплифицироваться в бактерии как плазмиды и упаковываться в фаговые головки. Могут включать вставку чужеродной ДНК до 40т.п.н.

  4. Искусственная дрожжевая хромосома (yeast artificial chromosome –YAC). Вектор разработан на основе ДНК дрожжей. Применяются для клонирования больших фрагментов ДНК (от 100 до 1000 т.п.н.) эукариот.

Схемамолекулярного клонирования

Сиспользованием технологий рекомбинантныхДНК получают инсулин, соматотропный идругие гормоны человека.

Полимеразнаяцепная реакция (ПЦР)

Методамплификации (увеличение количествакопий) ДНК invitro.Метод позволяет в течение несколькихчасов получить большое количество копийисследуемой ДНК.

Возможностьосуществления репликации ДНК в пробиркедавно интересовала ученых. Особенноинтересной представлялась возможностьнакопления большого количества копийДНК для последующих исследований. Этотпроцесс стал возможным после открытиятермостабильной Tag-полимеразыиз термофильных бактерий Thermisaquaticus.

Принцип метода ПЦР был разработан КэриМюллисом (США) в 1983 году и в настоящеевремя используется как для научныхцелей, так и для диагностики в практическомздравоохранении. В основе метода ПЦРлежит комплементарное достраиваниеДНК-матрицы, осуществляемое invitroс помощью фермента ДНК-полимеразы (т.е.осуществляется репликация).

ОбычнаяДНК-полимераза не может работать привысоких температурах. Оптимум работыTag-полимеразынаходится в области 70-72 С, что позволилосделать процесс репликации циклическим.

При многократном повторении цикловсинтеза происходит экспоненциальноеувеличение числа копий специфическогофрагмента ДНК, что позволяет из небольшогоколичества анализируемого материала(не определяемое современными методами)получить достаточное количество копийДНК для идентификации их методомэлектрофореза.

Комплементарноедостраивание цепи начинается не в любойточке последовательности ДНК, а тольков определенных стартовых блоках –коротких двунитевых участках. Приприсоединении таких блоков к специфическимучасткам ДНК можно направлять процесссинтеза новой цепи только в этом участке,а не по всей длине цепи.

Для созданиястартовых блоков в заданных участкахДНК используют две олигонуклеотидныезатравки – праймеры. Праймерыкомплементарны последовательностямДНК на левой и правой границахспецифического фрагмента и ориентированытаким образом, что достраивание новойцепи ДНК протекает только между ними.

Таким образом, метод ПЦР представляетсобой многократное увеличение числакопий (амплификация) специфическогоучастка ДНК, катализируемое ферментомДНК-полимеразой.

Каждыйцикл амплификации включает 3 этапа,протекающих в различных температурныхрежимах.

1этап: Денатурация ДНК.

Протекаетпри 93-94 С в течение 30-40 сек.

2этап: Присоединение праймеров (отжиг).

Присоединениепраймеров происходит комплементарнок соответствующим последовательностямна противоположных цепях ДНК на границахсоответствующего участка. Для каждойпары праймеров существует своя температураотжига, значения которой располагаютсяв интервале 50-65 градусов. Время отжига20-60 сек.

3эпап: Достраивание цепи (элонгация).Комплементарное достраивание цепейпроисходит от 5’-конца к 3’-концу впротивоположных напрвлениях, начинаяс участков присоединения праймеров.Материалом для синтеза новых цепейслужат добавляемые в раствор нуклеотиды.Синтез происходит при температуре 70-72С, время синтеза – 20-40 сек.

Образовавшиесяв первом цикле амплификации новые цепиДНК служат матрицами для нового циклаамплификации, в котором происходитобразование искомого специфическогофрагмента ДНК (ампликона). В последующихциклах амплификации ампликоны служатматрицей для синтеза новых цепей. Такимобразом, происходит накопление ампликоновв растворе по формуле 2n,где n-число циклов амплфикации.

Поэтому, дажеесли в исходном растворе первоначальнонаходилась всего одна двухцепочечнаямолекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворенакапливается около 10 в восьмой степенимолекул ампликона. Этого количествадостаточно для достоверной визуальнойдетекции этого фрагмента методомэлектрофореза в агарозном геле.

Процессамплификации проводится в специальномпрограммируемом термостате (амплификаторе),который по заданной программе осуществляетсмену температур согласно числу цикловамплификации.

ПрименениеПЦР:

Клиническаялабораторная диагностика

•диагностикавирусных инфекций (ВИЧ, гепатит, половыеинфекции и др.)

• определение отцовства

•диагностикагенных болезней (выявление мутаций)

•судебнаямедицина (напр. Идентификация личности)

Фундаментальнаянаука и практика

•секвенирование(определение нуклеотидной последовательности)

•клонированиегенов

•геннаяинженерия (создание трансгенных животныхи растений)

•геннаятерапия

• направленныймутагенез

СхемаПЦР

Электрофорезфрагментов ДНК

Электрофорезприменяется для визуализации результатовэкспериментов (ПЦР и др.). Электрофорезфрагментов ДНК обеспечивает их разделениеи распределение в агарозном илиполиакриламидном геле. Фрагменты ДНКдвижутся в электрическом поле ототрицательного полюса к положительномув зависимости от их размеров.

Чем большемолекулярная масса фрагмента, теммедленнее он движется в электрическомполе. После окончания электрофорезакаждый фрагмент ДНК занимает определенноеположение в геле в виде полосы.

Длинукаждого фрагмента можно определитьпутем сравнения пройденного фрагментомрасстояния с расстоянием, пройденнымстандартным образцом ДНК с известнымразмером (маркер). Для визуализациирезультатов экспериментов гелиокрашивают. Чаще всего применяетсяокраска геля этидия бромидом, которыйсвязывается с ДНК.

Полосы, соответствующиефрагментам ДНК выявляются приультрафиолетовом облучении геля(свечение в красной области спектра).

Агарозный гель окрашенный этидия бромидом. В ультрафиолетовом свете видны полосы, соответствующие фрагментам ДНК разной длины.Камера для электрофореза в полиакриламидном геле. Образцы ДНК наносятся в специальные лунки в геле. В камеру заливается буферный солевой раствор, через который пропускается электрический ток.

Прииспользовании ПЦР с последующимразделением фрагментов при помощиэлектрофореза можно обнаружить делециии вставки в исследуемом гене.

В случаеделеций после ПЦР образуются фрагментыменьшей длины по сравнению с нормальнымгеном, а в случае вставок (дупликаций)- большей.

Замены оснований не изменяютдлину фрагментов, поэтому для ихопределения можно использовать методполиморфизма длины рестрикционныхфрагментов и секвенирование.

Методполиморфизма длины рестрикционныхфрагментов

Значительноечисло нуклеотидных замен приводит кпоявлению в последовательности ДНКновых сайтов для различных рестриктаз.В результате нормальный фрагмент ДНКи фрагмент с заменой нуклеотида будутразрезаться одной рестриктазой наразное число фрагментов, отличающихсяпо длине. Различной длины фрагментылегко выявляются при помощи электрофореза.

Примеромможет служить рестрикционный анализфрагмента гена алькогольдегидрогеназы(ADH).После ПЦР образуется фрагмент 165 н.п.

Аллель ADH-1не несет замены, после его обработкирестриктазой MaeIIIпри электрофорезе выявляются 2 фрагмента(98 и 68 н.п.).

Аллель ADH-2несет нуклеотидную замену (при заменеобразуется лишний сайт для рестриктазы)и после рестрикции разрезается на 3фрагмента (63, 36 и 68 н.п.).

СеквенированиеДНК

Секвенирование–определение нуклеотидной последовательностиДНК. Метод применяется для изучениягенома человека как в норме так и впатологии.

При помощи секвенированияопределяют аллельные варианты генов,а также различные типы генных мутаций(чаще по замене оснований).

Программа«Геном человека», результатом которойявилась расшифровка нуклеотиднойпоследовательности генома человека(основная часть программы закончена в2003г.) была осуществлена с применениемметодов секвенирования ДНК.

Существуетнесколько различных способов секвенированияДНК. Первым был предложен химическийметод Максама-Гилберта, затем ферментативныйметод Сенгера. В настоящее время восновном применяется дидезоксинуклеотидныйметод секвенирования ДНК (метод обрывацепи).

Вэтой процедуре одноцепочечная молекулаДНК, последовательность которойопределяется, служит матрицей длясинтеза серии комплементарных цепей,обрывающихся в момент присоединения крастущей цепи специфических нуклеотидов.

Для обрыва синтеза используютдидезоксинуклеотиды – искусственносинтезированные нуклеотиды, лишенные2' и 3'- гидроксильных групп и поэтому неспособные присоединять к цепи следующийнуклеотид.

Проба ДНК делится на 4 пробирки,в которые добавляют праймер, ДНК-полимеразу,смесь четырех трифосфатов (дАТФ, дГТФ,дТТФ, дЦТФ) и небольшое количество одногоиз дидезокирибонуклеотидов (ддАТФ,ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ).

Во время синтезаДНК-полимераза случайным образомвключает в цепь нормальные нуклеотидыи дидезоксинуклеотиды. При этом в каждойпробирке образуется набор фрагментовразной длины, заканчивающихся на одиниз дидезоксинуклеотидов.

Послеэтого проводится электрофорез, чтопозволяет разделить отличающиеся наодин нуклеотид фрагменты ДНК. В результатев геле образуется набор полос, напоминающихлестницу.

Нуклеотиднаяпоследовательность ДНК читается в гелеснизу вверх, согласно направлению 5'-3'цепи ДНК.

Дляопределения нуклеотидной последовательностибольших фрагментов ДНК используютсяавтоматизированные машины (ДНК-секвенаторы).

Кромеперечисленных, применяется большоеколичество других молекулярных методовизучения последовательности человека.

Источник: https://studfile.net/preview/535923/

ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции

Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

В конце статьи см. словарь
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).
В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР – метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).
Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.
Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.
Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике – для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ – вирусов папилломы человека; в пульмонологии – для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии – для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний – в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии – для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.
Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами – короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 – 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
  • два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
  • термостабильная ДНК-полимераза;
  • дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
  • ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
  • буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.
Ход реакции

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 – 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий.

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 – 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 – 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись.

Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 – 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 – 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 – 2 минут.

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C.

Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 – 15 мин.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО  в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой – позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.

Словарь

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота – биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.

РНК– рибонуклеиновая кислота – биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев – нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку.

РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка.

Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.

Нуклеоти́ды – основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп.

Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу.

Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию – адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) – гуанин, цитозиновый (C) – цитозин, тиминовый (Т) – тимин, урациловый (U) – урацил.

В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов – A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа – A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК – рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. 

Литература

  1. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с., илл. ISBN 5-03-003328-9

Источник: https://www.invitro.ru/library/labdiagnostika/16110/

Молекулярно-генетические методы диагностики Полимеразную цепную

Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика

Молекулярно-генетические методы диагностики

• Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис (Kary Mullis). • Принцип метода заключается в удвоении (амплификации) участка ДНК, ограниченного праймерами, при помощи фермента ДНКполимеразы.

• За каждый следующий цикл амплификации происходит удвоение как исходного участка ДНК, так и вновь синтезированных фрагментов (амплификатов). • В результате этого число фрагментов растет в геометрической прогрессии (цепная реакция).

После 30 – 40 циклов их число превышает несколько миллиардов, что делает возможным их обнаружение различными методами.

• Амплификация (лат. amplificatio — усиление, увеличение), в молекулярной биологии — увеличение числа копий ДНК.

В клетке амплификация происходит в результате репликации ДНК, в искусственных условиях увеличения числа копий ДНК добиваются с помощью полимеразной цепной реакции.

• Праймер — короткая олиго- или полинуклеотидная последовательность со свободной З’ОН-группой, комплементарно связанная с однонитевой ДНК или РНК; с его 3’-конца ДНК-полимераза начинает наращивать полидезоксирибонуклеотидную цепь.

Этапы ПЦР-исследования • • 1. Выделение нуклеиновых кислот. На первом этапе выделяется вся ДНК (для ДНК-содержащих микроорганизмов) или РНК (для метода NASBA или РНК – содержащих вирусов) из исследуемого материала. 2. Собственно ПЦР или амплификация.

В раствор, содержащий смесь нуклеотидов, ПЦР-буфер, полимеразу и праймеры добавляется ДНК, выделенная на первом этапе.

ПЦР проводят следующим образом: сначала реакционную смесь нагревают до температуры 90 -94° С, вызывая этим денатурацию ДНК, затем температуру снижают до 50 -70° С в зависимости от нуклеотидной последовательности праймеров, чтобы отжиг происходил в строго комплементарных участках, и наконец, в смеси устанавливают температуру, оптимальную для работы ДНК-полимеразы. При повторении этих циклов количество копий участка ДНК, находящегося между местами посадки праймеров, возрастает в геометрической прогрессии. 3. Учет результатов. Накопленные продуты амплификации (большое число копий ДНК между местами посадки праймеров) можно выявить путем электрофореза в геле. Помимо этого, при использовании флуоресцентно меченых зондов, возможен учет результатов по изменению флуоресценции относительно отрицательного контроля. NASBA (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification)- в отличие от обычной ПЦР, мишенью для NASBA (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification) служат молекулы РНК рибосом микроорганизмов, что дает целый ряд преимуществ

Компоненты реакции • • Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК.

Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfuполимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (d. ATP, d. GTP, d. CTP, d. TTP). Ионы Mg 2+, необходимые для работы полимеразы. Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — р. Н, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

• Для того, чтобы выявить и размножить в имеющейся пробе именно ту последовательность ДНК, которая необходима, нужно знать нуклеотидные последовательности ее концов, для того, чтобы создать к ним комплементарные короткие (18 -30 нуклеотидов) фрагменты – праймеры. На рисунке эти известные концы последовательности отмечены синим, а черным – тот фрагмент ДНК, который нужен.

Первая стадия – денатурация Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94— 96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0, 5— 2 мин. , чтобы цепи ДНК разошлись.

Вторая стадия – отжиг. Температуру снижают, и праймеры соединяются Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей с комплементарными им участками ДНК. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4— 5°С ниже их температуры плавления.

Время стадии — 0, 5— 2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Главный элемент PCR – это многократный тепловой цикл, при котором образец ДНК подвергается воздействию трёх различных температур.

Третья стадия – элонгация Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C Полимераза – это фермент, умеющий достраивать вторую цепь ДНК.

Для того, чтобы начать это делать, ей нужен кусочек, где ДНК уже двуцепочечная, в этом качестве и выступает место взаимодействия ДНК с праймером.

Полимераза всегда достраивает цепь от 5' к 3'-концу (эти названия связаны с ориентацией сахара дезоксирибозы в цепи; в обычной двуцепочечной ДНК цепи направлены противоположно другу: 5'_______3' 3'_______5'

• Теперь в растворе есть четыре слишком длинных цепи ДНК. Две – те, которые были, и две построенные по праймерам.

Но если повторить процесс ещё раз, то получится следующая картина: Если изначальные цепи ДНК можно было считать условно бесконечными в обе стороны, то нити, полученные в первом цикле, бесконечны в одну сторону, а со второй ограничены праймером.

Когда такие цепи будут взаимодействовать со вторым праймером, будут получаться кусочки, ограниченные с двух сторон.

Всего в ПЦР проводят несколько десятков циклов, поэтому абсолютное большинство продукта реакции будет представлять собой короткие нужные последовательности, с которыми уже можно будет производить различные манипуляции, в простейшем случае – разгонять на хроматографе и сравнивать полученные полоски с теми, которые должны были бы получиться, если бы была уреаплазма или кто-то другой.

Четвертая стадия – детекция. • В начале у нас был раствор с небольшим количеством длинных, полноценных клеточных молекул ДНК. • В конце ПЦР мы имеем раствор с огромным количеством размноженных нужных участков, кусочков ДНК • Раствор наносят на гель, к гелю прикладывают напряжение.

За часокдругой кусочки молекул ДНК (они имеют заряд) перемещаются в геле на расстояние, пропорциональное их массе. • Гель кладут под ультрафиолет и масса одинаковых кусочков ДНК начинает светиться в том месте геля, где собралась. • Если собралась — значит в ДНК был участок, соответствующий праймеру, нужный «ген» .

Если ничего не светится, мутная полоска без четкого участка — значит, нужного участка в ДНК нет.

Схема удвоения фрагментов ДНК в ПЦР (Andy Vierstraete, 2001) Схема удвоения фрагментов ДНК в ПЦР Для процесса амплификации необходимо, чтобы структура праймеров была идентична (комплементарна) участку исходной ДНК.

Если этого не происходит (отсутствует специфическая ДНК), то удвоения ДНК не происходит.

Если в растворе не окажется ни одной молекулы ДНК с участком, комплементарным внесенным праймерам, то реакция ПЦР не пойдет, даже несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул ДНК. Этим и обусловлена высокая специфичность метода ПЦР.

Преимущества метода ПЦР 1. Универсальность. При помощи ПЦР можно определять ДНК в любых биологических образцах. Причем это в равной степени относится как к ДНК микроорганизмов, так и к ДНК человека. 2. Высокая специфичность. Специфичность определяется тем, что в ПЦР определяется уникальный участок гена, характерный только для данного возбудителя.

Для повышения специфичности возможно определять несколько разных генов одного микроба. Так, например, для определения Ureaplasma urealyticum можно выявлять как ген 16 S-RNA, так и ген уреазы. А для идентификации Chlamydia trachomatis, помимо определения хромосомальной ДНК и ДНК криптической плазмиды стало возможным выявлять рибосомальную РНК (NASBA).

Это значительно повышает достоверность исследования. 3. Высокая чувствительность. Полимеразная цепная реакция способна выявлять единичные копии ДНК. В среднем порог чувствительности большинства современных тест-систем составляет от 10 до 100 копий ДНК. Это значительно превышает чувствительность культуральных методов исследования. 4. Малый объем биологического материала.

Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до нескольких микролитров), что крайне важно в педиатрии, неонатологии, неврологии, судебной медицине. 5. Возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях.

Недостатки метода ПЦР 1. Амплифицируется ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма. Это налагает определенные требования при использовании ПЦР для контроля эффективности лечения. В общем случае подобный контроль должен проводиться спустя промежуток времени, в течение которого происходит полная элиминация возбудителя.

Однако, метод NASBA выявляет РНК только живых микроорганизмов и позволяет избежать этих ограничений. 2. Высокая чувствительность. Ряд микроорганизмов (условно – патогенная флора, УПФ) в норме может существовать у человека в малом количестве. При помощи метода ПЦР определяются даже самые малые количества УПФ, даже при отсутствии патологии.

Однако эта проблема решена с появлением метода количественного определения ДНК (Real-time PCR). 3. Различия при использовании разных тест систем. Как говорилось выше, для амплификации можно использовать различные участки генома возбудителя. Однако в случае различных мутаций микроорганизмов возможно изменение или утрата генов.

Это приводит к разным результатам при использовании тест систем разных производителей.

ПЦР в реальном времени • Принцип метода ПЦР в реальном времени (Real. Time PCR) основан на детекции продуктов амплификации уже в процессе реакции и проведении мониторинга кинетики накопления ампликонов.

Это означает, что учет результата ПЦР (числа ампликонов) происходит после каждого цикла амплификации, а не в конце, как при обычной ПЦР. Чем больше в исходной пробе было специфической ДНК, тем раньше и больше увеличится число специфических фрагментов.

• “ПЦР в реальном времени” (Real-Time PCR) позволяет осуществлять количественную оценку содержания ДНК в исследуемом материале.

Детекция продуктов амплификации 1. Выщепление 5' концевой метки (Taq. Man Assay). Данная методика основана на использовании 5' -экзонуклеазной активности полимеразы.

В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в состав которых входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель флуоресценции в 3'положении, а также фосфатная группа в 3'положении. Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области.

Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу.

В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присоединение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем больше продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул зондов свяжется с соответствующими ампликонами.

Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при достижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектируемого свечения. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработано в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свечение.

Принцип работы Taq. Man-зондов MGB (Minor Groove Binders) – молекулы, связывающиеся с малой бороздкой ДНК

Молекулярные маяки Флуорофор Свечение Гаситель Молекулярные маяки – это ДНКзонды, сконструированные таким образом, чтобы в них содержалась структура в виде шпильки с петлей. Последовательность петли комплементарна специфичной, целевой для зонда последовательности, образующие шпильку, комплементарны другу.

5’ и 3‘-концы зонда ковалентно связаны с флуорофором и гасителем. Когда шпилечная структура «закрыта» , флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости. В этом случае все фотоны, испускаемые флуорофором, поглощаются гасителем. В присутствии комплементарной последовательности зонд развертывается и гибридизуется с целевой последовательностью.

Флуорофор отодвигается от гасителя и зонд начинает флуоресцировать.

Зонды-скорпионы Флуорофор Гаситель Блокатор ПЦР Праймер Дальнейшая эволюция представлена семейством зондов, называемых «скорпионами» . «Скорпион» состоит из специфической последовательности зонда, содержащей структуру шпильки с петлей. Флуорофор присоединен к 5’-концу, он испускает флуоресцентный сигнал, который поглощается гасителем на 3‘конце.

Шпилька с петлей присоединена к 5’концу праймера. После удлинения праймера- «скорпиона» последовательность зонда становится способной связываться с комплементарной ей последовательностью в той же цепи ДНК. Это приводит к открытию петли шпильки таким образом, что флуоресценция больше не гасится (наблюдается увеличение сигнала флуоресценции).

Блокатор ПЦР, расположенный между праймером и последовательностью шпильки, предотвращает «прочтение» петли шпильки, что могло бы привести к открытию петли шпильки в отсутствие специфической целевой последовательности. В отличие от молекулярных маятников и Taq.

Man, система анализа с использованием «скорпионов» не требует создания отдельных зондов, помимо праймеров.

2. Использование интеркалирующих агентов. • Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК. Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации.

• Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер).

Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых “кривых плавления” (melting curves).

Использование интеркалирующего агента SYBR green I. Краситель SYBR green I связывается с малой бороздкой двухцепочечной ДНК. Вследствие связывания флуоресценция значительно возрастает (приблизительно в 800 – 1000 раз).

В процессе проведения ПЦР возрастающее количество вновь синтезированной ДНК приводит к увеличению сигнала флуоресценции. Основное ограничение системы детекции последовательностей, основанной на использовании красителя SYBR green I, связано с неспецифическим характером распознавания ДНК.

Для преодоления этой проблемы применяют анализ кривой плавления. После завершающего этапа ПЦР продукты медленно расплавляют, при этом фиксируется сигнал флуоресценции.

Так каждая двухцепочечная ДНК имеет специфическую температуру плавления, возможно количественно определить содержание различных компонентов, имеющих разную температуру плавления в реакционной смеси, и таким образом элиминировать неспецифические компоненты из результатов количественного определения.

Кривые плавления • После окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плавления продукта амплификации флуоресценция резко снижается. • Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответствует числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных типов ампликонов.

Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I. При использовании кривых плавления в системах с ДНКзондами (например, Taq.

Man assay) возможно различать точечные мутации, расположенные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда.

Наличие таких мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к изменениям в графике кривой плавления

ПЦР в реальном времени: преимущества метода Данный способ детекции ДНК является альтернативой электрофоретическому методу и имеет ряд существенных преимуществ: 1. Высокая специфичность детекции ампликонов, обусловленная применением гибридизационной схемы с использованием высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов. 2.

Уменьшение вероятности контаминации. Возможность проведения реакции амплификации ДНК в одном приборе, что снижает риск контаминации реакционной смеси. 3. Возможность количественной оценки исходной матричной ДНК. 4. Возможность анализа точечных мутаций. 5.

Регистрация и учет данных в электронном (автоматическая регистрация полученных результатов). формате

Некоторые разновидности ПЦР • 1. «Вложенная» ПЦР (Nested PCR) – есть вторая пара праймеров, которая амплифицирует кусочек полученного кусочка. 2. «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR) – перед проведением ПЦР с помощью серии ферментативных реакций как бы приклеивают известные фрагменты на концы неизвестного, чтобы можно было его амплифицировать. 3.

ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR) – берется РНК (молекула, которая является промежуточным этапом между ДНК и белками в живой клетке), а из нее с помощью фермента обратной транскриптазы получают ДНК, с которой уже проводят ПЦР. Это удобно, например, для того, чтобы выявить, какие именно гены в данной клетке экспрессируются. 4.

Асимметричная ПЦР (Asymmetric PCR) – если нужны продукты амплификации преимущественно одной из двух цепей ДНК. Добавляют неравное количество праймеров. 5.

Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) – используются флуоресцентно меченые реагенты, и специальный прибор рассматривает пробирку, в которой идет реакция, и сообщает: “готово столько-то продукта! а теперь уже вдвое больше!” 6.

ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) – чтобы амплифицировать длинный (больше 10 тысяч пар оснований) фрагмент, используют ПЦР с двумя полимеразами: одна из них, Taq-полимераза, может синтезировать длинную цепь, а вторая, ДНКполимераза с 3'5'-экзонуклеазной активностью, может исправить ошибки, допущенные первой. 7. Multiplex PCR – добавляют несколько пар праймеров и одновременно амплифицируют несколько фрагментов.

Источник: https://present5.com/molekulyarno-geneticheskie-metody-diagnostiki-polimeraznuyu-cepnuyu/

Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных болезней

Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика

Полимеразная цепная реакцияпозволяет обнаружить микроб в ис­следуемом материале (воде, продуктах, ма­териале от больного) по наличию в нем ДНК микроба без выделения последнего в чистую культуру.

Для проведения этой реакции из исследу­емого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для дан­ного микроба гена. Обнаружение гена осу­ществляют его накоплением. Для этого необ­ходимо иметь праймеры комплементарного З'-концам ДНК. исходного гена. Накопление (амплификация) гена выполняется следую­щим образом.

Выделенную из исследуемого материала ДНК нагревают. При этом ДНК распадается на 2 нити. Добавляют праймеры. Смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры, при наличии в смеси ДНК искомо­го гена, связываются с его комплементарными участками. Затем к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу и нуклеотиды.

Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования ДНК-полимеразы. В этих условиях, в случае комплементарное™ ДНК гена и праймера, происходит присоединение нуклеотидов к З'-концам праймеров, в резуль­тате чего синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяется снова, при этом ко­личество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз вдвое.

Проводят реакцию в специальных приборах — амплификаторах. ПЦР применяется для диагностики вирусных и бактериальных инфекций.

Рестрикционный анализ.Данный метод основан на применении фер­ментов, носящих название рестриктаз.

Рестриктазы представляют собой эндонук-леазы, которые расщепляют молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов.

Особое значение для методов мо­лекулярной генетики имеют рестриктазы, кото­рые узнают последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии. Точка разрыва ДНК может или совпадать с осью симметрии, или быть сдвинута относи­тельно нее.

В настоящее время из различных бактерий выделено и очищено более 175 различных рестриктаз, для которых известны сайты (участки) узнавания (рестрикции). Выявлено более 80 различных типов сайтов, в которых может про­исходить разрыв двойной спирали ДНК.

В геноме конкретной таксономической еди­ницы находится строго определенное (генети­чески задетерминированное) число участков узнавания для определенной рестриктазы.

Если выделенную из конкретного микроба ДНК обработать определенной рестриктазой, то это приведет к образованию строго опреде­ленного количества фрагментов ДНК фикси­рованного размера.

Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в агарозном геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем более крупные фрагменты, и длина их пробега больше. Гель окрашива­ют бромистым этидием и фотографируют в УФ-излучении. Таким образом, можно полу­чить рестрикционную карту определенного вида микробов.

Сопоставляя карты рестрикции ДНК, вы­деленных из различных штаммов, можно оп­ределить их генетическое родство, выявить принадлежность к определенному виду или роду, а также обнаружить участки, подвергну­тые мутациям.

Этот метод используется также как началь­ный этап метода определения последователь­ности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гибридизации.

Метод молекулярной гибридизациипозволяет выявить степень сходства раз­личных ДНК. Применяется при идентифи­кации микробов для определения их точного таксономического положения.

Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатурировать, т. е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру. Метод требует наличия молекулярного зонда.

Зондомназывается одноцепочечная мо­лекула нуклеиновой кислоты, меченная ра­диоактивными нуклидами, с которой сравнивают исследуемую ДНК.

Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют на специальном фильтре, который затем помещают в раствор, со­держащий радиоактивный зонд. Создаются ус­ловия, благоприятные для образования двойных спиралей. В случае наличия комплементарности между зондом и исследуемой ДНК, они образу­ют между собой двойную спираль.

Риботипирование и опосредованная транскрипцией амплификация рибосомальной РНК.Последовательность нуклеотидных основа­ний в оперонах, кодирующих рРНК, отлича­ется консервативностью, присущей каждомувиду бактерий. Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких ко­пиях.

Фрагменты ДНК, полученные после об­работки ее рестриктазами, содержат последо­вательности генов рРНК, которые могут быть обнаружены методом молекулярной гибри­дизации с меченой рРНК соответствующего виды бактерий.

Количество и локализация копий оперонов рРНК и рестрикционный состав сайтов как внутри рРНК-оперона, так и по его флангам варьируют у различных вида бактерий. На основе этого свойства построен метод риботипирования, который позволяет производить мониторинг выделенных штам­мов и определение их вида.

В настоящее вре­мя риботипирование проводится в автомати­ческом режиме в специальных приборах.

Опосредованная транскрипцией амплифика­ция рРНКиспользуется для диагностики сме­шанных инфекций. Этот метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гиб­ридизации амплифицированных рРНК, спе­цифичных для определенного вида бактерий. Исследование проводится в три этапа:

1. Амплификация пула рРНК на матрице вы­деленной из исследуемого материала ДНК при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

2. Гибридизация накопленного пула рРНК с комплементарными видоспецифическим рРНК олигонуклеотидами, меченными флюорохромом или ферментами.

3. Определение продуктов гибридизации методами денситометрии, иммунофермент-ного анализа (ИФА).

Реакция проводится в автоматическом ре­жиме в установках, в которых одномоментное определение рРНК, принадлежащих различ­ным видам бактерий, достигается разделе­нием амплифицированного пула рРНК на несколько проб, в которые вносятся компле­ментарные видоспецифическим рРНК мече­ные олигонуклеотиды для гибридизации.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/10_129759_molekulyarno-geneticheskie-metodi-diagnostiki-infektsionnih-bolezney.html

Молекулярно-генетические методы исследования:ПЦР

Молекулярно-генетические методы исследования - ПЦР- диагностика

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка нуклеиновой кислоты ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro).

При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК.

В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp[8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов.

Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований[9].

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

1-ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

2-Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

3-Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК.

4- Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Taq-полимераз/Pfu-полимераза/Pwo-полимераза/Tth-полимераза и другие.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Преимущества ПЦР:

Высокая чувствительность

Высокая специфичность

Простота в исполнении

Скорость

Компоненты реакции:

Праймеры

ДНК-полимераза

Смесь нуклеотидов

Дезоксинуклеотидтрифосфатов:

АТФ, ГТФ, ЦТФ, ТТФ

Буферный раствор

Анализируемый образец ДНК

Принципы ПЦР:

Использование термостабильной полимеразы

Полимераза достраивает специфические затравки

Амплификацию проводят в течении 30-40 циклов

За 30 циклов происходит умножение амплифицируемого фрагмента ДНК в более чем 1млн раз.

Вопрос-99 Электрофарез

Лекарственный электрофорез Механизм действия этой процедуры заключается в том, что лекарственный препарат в виде ионов поступает внутрь организма пациента через поры и протоки сальных и потовых желез. Катионы и анионы задерживаются на кожных покровах под электродом, а затем постепенно проникают в кровь и лимфу.

Из-за такого постепенного поступления воздействие лекарства на организм длительное, что является одним из преимуществ этого метода терапии. Осуществляется лекарственный электрофорез при помощи разных аппаратов, одним из которых является «Поток». Этот прибор в медицине используется уже давно, он проверен временем и надежен.

Есть возможность регулировать во время процедуры силу тока, а также устанавливать время. В настоящее время выпускаются современные аналоги прибора, которые имеют цифровые индикаторы. Чтобы получить терапевтический эффект, совсем необязательно располагать электроды на больном органе или вводить большие дозы препаратов.

Посредством физиотерапии вводят ионы кальция, магния, йода для повышения рефлекторного воздействия на пораженную ткань.

Методики проведения электрофореза

Чтобы повысить эффективность данной процедуры, постоянно разрабатываются и совершенствуются методики электрофореза лекарственного. В настоящее время используют следующие:

Пролонгированная гальванизация. Применяют электрический ток малой силы, но время воздействия продолжительное. Батарея «Крона» является источником тока. Курс лечебных процедур обычно составляет 20-30 сеансов. Электрофорез хорошо успокаивает, оказывает обезболивающее действие.

Лабильная гальванизация.Один электрод во время процедуры закрепляется неподвижно, а второй находится в движении и перемещается со скоростью 3-5 см в секунду по поверхности кожи. Чтобы исключить колебания тока, в аппарат вводят стабилизирующее устройство. Процедура хорошо повышает метаболизм, улучшает кровоснабжение органов и тканей и нервно-мышечную проводимость.

 Внутритканевый электрофорез. Проведение процедуры лекарственного электрофореза по данной методике сводится к введению через канюлю подкожно или внутримышечно препарата или смеси веществ.

Вводиться лекарство может струйно или капельно. К очагу поражения поперек накладывают электроды, чтобы увеличить концентрацию медицинского препарата.

Если лекарство вводят струйно, то ток включают одновременно с этим, а при капельном – после введения.

Вопрос-100 Блот гибридизации

Блот-гибридизация — гибридизация рестриктазных фрагментов исследуемой ДНК, предварительно разделенных электрофоретически и перенесенных на нитроцеллюлозный фильтр при помощи фильтровальной бумаги, со специфичным нуклеотидным зондом. Методика проведения Б.-г. состоит из нескольких этапов.

1-й этап — получение ДНК из исследуемого материала. В зависимости от вида биологического материала (ткань, кровь, молоко) методика выделения ДНК имеет специфические особенности. Главным моментом на данном этапе является депротеинизация ДНК, ее отделение от белка, осаждение и отмывание.

 2-й этап— обработка ДНК рестриктазами (рестрикционными эндонуклеазами). Обработка происходит в стандартных условиях на протяжении 3-16 ч. Вследствие гидролиза длинноцепочечная ДНК превращается в смесь коротких фрагментов.

3-й этап — нанесение смеси фрагментов ДНК на электрофоретическую пластинку агарозным гелем и проведение электрофореза.

Вследствие различной молекулярной массы фрагменты ДНК будут двигаться в электрическом поле от отрицательного полюса к положительному с различной скоростью.

После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля.

 4-й этап— непосредственно блоттинг, или получение оттиска картины электрофореза на нитроцеллюлозном фильтре.

Сразу после окончания электрофореза на пластинку агарозного геля, которая находится в буферном растворе, накладывают нитроцеллюлозный фильтр, а сверху на него — несколько листов фильтровальной бумаги, и все это помещают под пресс.

За счет капиллярного эффекта создается ток буфера, перпендикулярный плоскости геля, который вместе с ДНК-рестриктами проходит через нитроцеллюлозный фильтр. ДНК-фрагменты адсорбируются на фильтре строго в соответствии с их положением в геле. Таким способом получают от печаток полученных рестриктов на нитроцеллюлозном фильтре.

Помимо нитроцеллюлозных фильтров используются различные нейлоновые или капроновые мембраны. Нейлоновые мембраны ковалентно связывают ДНК-фрагменты, что позволяет осуществлять их последующую регенерацию и многократное использование. Для ускорения процедуры блоттинга и его эффективности применяют вакуум и электроперенос.

5-й этап — гибридизация рестриктных фрагментов с ДНК-зондами. ДНК-цепи закрепляют на фильтре прогреванием, а далее фильтр инкубируется с меченым нуклеотидным зондом. В качестве метки в классическом варианте используют изотопные маркеры, чаще 32Р.

В таком случае дальнейшая идентификация гибридов производится путем радиоавтографии. Различают несколько видов блот-гибридизации: Саузерн-блоттинг(см.) — для визуализации фрагментов ДНК; нозерн-блоттинг (см.

) — для РНК; вестернблоттинг, или иммуноблоттинг, — для связывания электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах с мечеными антителами.

Источник: https://studopedia.net/2_27411_molekulyarno-geneticheskie-metodi-issledovaniyaptsr.html

Medic-studio
Добавить комментарий