Осаждение путем избирательной денатурации: Этот способ выделения приемлем только для стабильных белков,

2. Методы очистки белков

Осаждение путем избирательной денатурации: Этот способ выделения приемлем только для стабильных белков,

Наиболеетрудоёмкий этап получения индивидуальныхбелков – их очистка от других белков,находящихся в растворе, полученном изданной ткани. Часто изучаемый белокприсутствует в небольших количествах,составляющих доли процента от всехбелков раствора.

Таккак белки обладают конформационнойлабильностью, при работе с белкамиследует избегать денатурирующихвоздействий, поэтому выделение и очисткабелков происходят при низких температурах.

Напервых стадиях очистки белков целесообразноиспользовать методы, учитывающиекакую-либо характерную особенностьданного белка, например термостабильностьили устойчивость в кислых растворах.

Первыми методами очистки необходимоудалить из раствора основную массубалластных белков, которые значительноотличаются от выделяемого белкафизико-химическими свойствами.

Впоследствии применяют всё более тонкиеметоды очистки белка.

Очисткабелков избирательной денатурацией

Большинствобелков денатурирует и выпадает в осадокуже при кратковременном нагреваниираствора до 50-70 °С или подкислениираствора до рН 5. Если выделяемый белоквыдерживает эти условия, то с помощьюизбирательной денатурации можно удалитьбольшую часть посторонних белков,отфильтровав выпавшие в осадок белки,или осадить их центрифугированием.

Высаливание

Методочистки белков, основанный на различияхв их растворимости при разной концентрациисоли в растворе. Соли щелочных ищёлочно-земельных металлов вызываютобратимое осаждение белков, т.е. послеих удаления белки вновь приобретаютспособность растворяться, сохраняя приэтом свои нативные свойства.

Чащевсего для разделения белков методомвысаливания используют разные концентрациисолей сульфата аммония – (NH4)2SO4.Чем выше растворимость белка, тем большаяконцентрация соли необходима для еговысаливания.

Гель-фильтрация,или метод молекулярных сит

Дляразделения белков часто используютхроматографические методы, основанныена распределении веществ между двумяфазами, одна из которых подвижная, адругая неподвижная. В основухроматографических методов положеныразные принципы: гель-фильтрации, ионногообмена, адсорбции, биологическогосродства.

Методразделения белков с помощьюгель-фильтрационной хроматографииоснован на том, что вещества, отличающиесямолекулярной массой, по-разномураспределяются между неподвижной иподвижной фазами.

Хроматографическаяколонка заполняется гранулами пористоговещества (сефадекс, агароза и др.). Вструктуре полисахарида образуютсяпоперечные связи и формируются гранулыс “порами”, через которые легкопроходят вода и низкомолекулярныевещества.

В зависимости от условий можноформировать гранулы с разной величиной”пор”.

Неподвижнаяфаза – жидкость внутри гранул, в которуюспособны проникать низкомолекулярныевещества и белки с небольшой молекулярноймассой. Смесь белков, нанесённую нахроматографическую колонку, вымывают(элюируют), пропуская через колонкурастворитель. Вместе с фронтом растворителядвижутся и самые крупные молекулы.

Болеемелкие молекулы диффундируют внутрьгранул сефадекса и на некоторое времяпопадают в неподвижную фазу, в результатечего их движение задерживается. Величинапор определяет размер молекул, способныхпроникать внутрь гранул .

Таккак гелевая структура сефадекса легкодеформируется под давлением, гели стализаменять более жёсткими матрицами(сефактил, той-оперл), представляющимисферические гранулы с разными размерамипор. Выбор размеров пор в гранулахзависит от целей хроматографии.

Ультрацентрифугирование

Методразделения также основан на различиив молекулярных массах белков. Скоростьседиментации веществ в процессе вращенияв ультрацентрифуге, где центробежноеускорение достигает 100 000-500 000 g,пропорционально их молекулярной массе.На поверхность буферного раствора,помещённого в кювету, наносят тонкийслой смеси белков. Кювету помещают вротор ультрацентрифуги.

При вращенииротора в течение 10-12 ч более крупныемолекулы (с большей молекулярной массой)оседают в буферном растворе с большейскоростью. В результате в кюветепроисходит расслоение смеси белков наотдельные фракции с разной молекулярноймассой . После расслоения белковыхфракций дно кюветы прокаливают иглойи по каплям собирают содержимое небольшимипорциями в пробирки.

Электрофорезбелков

Методоснован на том, что при определённомзначении рН и ионной силы раствора белкидвигаются в электрическом поле соскоростью, пропорциональной их суммарномузаряду. Белки, имеющие суммарныйотрицательный заряд, двигаются к аноду(+), а положительно заряженные белки – ккатоду (-).

Электрофорезпроводят на различных носителях: бумаге,крахмальном геле, полиакриламидномгеле и др.

Различаютположительно заряженные анионообменники,среди которых наиболее часто используютдиэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу),содержащую катионные группы, и отрицательнозаряженные катионообменники, напримеркарбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу),содержащую анионные группы.

Выборионообменника определяется зарядомвыделяемого белка. Так, для выделенияотрицательнозаряженного белка используютанионообменник.

При пропускании растворабелка через колонку прочность связываниябелка с анионообменником зависит отколичества отрицательно заряженныхкарбоксильных групп в молекуле.

Белки,адсорбированные на анионообменнике,можно смыть (элюировать) буфернымирастворами с различной концентрациейсоли, чаще всего NaCI, и разными значениямирН.

Ионы хлора связываются с положительнозаряженными функциональными группамианионообменника и вытесняют карбоксильныегруппы белков. При низких концентрацияхсоли элюируются белки, слабо связанныес анионообменником. Постепенноеувеличение концентрации соли илиизменение рН, что меняет заряд белковоймолекулы, приводит к выделению белковыхфракций, в одной из которых находитсяискомый белок.

Аффиннаяхроматография, или хроматография посродству

Этонаиболее специфичный метод выделенияиндивидуальных белков, основанный наизбирательном взаимодействии белковс лигандами, прикреплёнными(иммобилизированными) к твёрдомуносителю. В качестве лиганда может бытьиспользован субстрат или кофермент,если выделяют какой-либо фермент,антигены для выделения антител и т.д.

Через колонку, заполненную иммобилизованнымлигандом, пропускают раствор, содержащийсмесь белков. К ли-ганду присоединяетсятолько белок, специфично взаимодействующийс ним; все остальные белки выходят сэлюатом . Белок, адсорбированный наколонке, можно снять, промыв её растворомс изменённым значением рН или изменённойионной силой.

В некоторых случаяхиспользуют раствор детергента, разрывающийгидрофобные связи между белком илигандом.

Аффиннаяхроматография отличается высокойизбирательностью и помогает очиститьвыделяемый белок в тысячи раз.

Источник: https://studfile.net/preview/5135123/page:6/

Фракционирование и очистка белков

Осаждение путем избирательной денатурации: Этот способ выделения приемлем только для стабильных белков,

После достижения полной экстракции белков, т.е. перевода белков в растворенное состояние, приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию и др.

Растворение белков в воде связано с гидратацией каждой молекулы, что приводит к образованию вокруг белковой глобулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды.

По химическим и физическим свойствам вода, входящая в состав гидратной оболочки, отличается от чистого растворителя. В частности, температура замерзания ее составляет –40°С. В этой воде хуже растворяются сахара, соли и другие вещества.

Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью, и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок.

Поэтому при добавлении к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также под влиянием физических факторов (нагревание, облучение и др.) наблюдаются дегидратация молекул белка и их выпадение в осадок.

Высаливание. При добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов происходит осаждение белков из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии.

Высаливанием белков обычно пользуются в клинической практике при анализе белков сыворотки крови и других биологических жидкостей, а также в препаративной энзимологии для предварительного осаждения и удаления балластных белков или выделения исследуемого фермента. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония.

Поэтому метод нашел широкое применение в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (выпадают при 100% насыщении).

На величину высаливания белков оказывают влияние не только природа и концентрация соли, но и рН среды и температура. Считают, что главную роль при этом играет валентность ионов. Действие разных ионов принято сравнивать не по молярной концентрации соли, а по так называемой ионной силе (μ), которая равна половине суммы произведений концентрации каждого иона (с) на квадрат его валентности (V):

Более тонкое разделение белков плазмы крови человека на фракции достигается при использовании различных концентраций этанола при низкой температуре (от –3 до –5°С) по методу Кона (рис. 1.2). В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Указанным методом часто пользуются для получения отдельных фракций крови, используемых в качестве кровезаменителей.

Рис. 1.2. Диаграмма фракционирования белков плазмы крови человека этанолом (по методу Кона).

В последнее время наибольшее распространение получили хроматографические и электрофоретические методы разделения белков.

Хроматография. Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).

Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей.

При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству) – в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них.

Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.

Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси (образца) основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте.

В качестве адсорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды алюминия или кремния.

Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще всего буферным раствором) вносят в стеклянную вертикальную трубку (колонку) и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку –

Рис. 1.3. Абсорбционнаяхроматография (схема). Разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью.

1 – нанесение образца на колонку; 2 -середина опыта; 3 – окончание опыта.

компоненты разделяемой смеси адсорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии освобождения – десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты (рис. 1.3). Сбор фракций осуществляют при помощи автоматического коллектора фракций.

Распределительная хроматография. В отличие от адсорбционной твердая фаза служит только опорой (основой) для стационарной жидкой фазы. Один из типов распределительной хроматографии, как и адсорбционная, осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель.

Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые вещества, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой (водный слой) и движущейся фазой органического растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки.

Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно вещество, соединяют для выделения этого вещества в чистом виде.

Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях, в том числе клинических, для разделения пептидов, аминокислот и других веществ (рис. 1.4). В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями фильтровальной бумаги.

Образец помещают на одном конце бумажной полосы, этим же концом бумагу погружают в подходящую смесь органических растворителей (например, бутанол–уксусная кислота–вода в определенных соотношениях). При движении растворителя по бумаге благодаря силе капиллярности происходит разделение компонентов смеси.

Проявленную хроматограмму высушивают, а местоположение каждого из разделяемых веществ определяют химическими или физико-химическими методами.

Рис. 1.4. Хроматография на бумаге (схема).

А – восходящая хроматография; Б – нисходящая хроматография (вид сбоку); В – хроматограмма с разделенными и окрашенными веществами: 1 – фронт растворителя, 2 – разделенные вещества, 3 – место нанесения образца.

Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен.

Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы.

Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы, несущие функциональные группы:

Аналогичные функциональные группы содержат триэтиламиноэтил (ТЭАЭ)- и аминоэтил (АЭ)-целлюлозы.

Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами (производные винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллюлозой, имеющими следующие функциональные группы:

В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются с колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают с колонки, применяя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.

Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), широко используются в фармакологии (при создании и определении лекарственных веществ), в клинической биохимии (при определении биологически активных веществ в физиологических жидкостях), в биотехнологических процессах и производствах и других областях: они позволяют определять вещества в нано-, пико- и фемтаграммных количествах.

Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами – лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д.

Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси.

Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность одноэтапно выделить заданный белок или другой биополимер высокой степени чистоты.

При помощи аффинной хроматографии, например, удалось сравнительно легко выделить очищенные препараты аминоацил-тРНК-синтетаз на полиакрилгидразидагаровом геле, к которому в качестве лигандов были присоединены определенные тРНК (транспортные РНК).

Гель-хроматография. В препаративных целях, особенно при очистке белков от примесей, широко используют метод молекулярных сит, или гель-хроматографию.

При обработке эпихлоргидрином полисахарида дек-страна образуются различной степени выраженности поперечные связи, приводящие к формированию крупных гидрофильных зерен, нерастворимых в воде и называемых сефадексами.

Благодаря большому сродству к воде зерна сильно набухают в водной среде с образованием геля, которым заполняют хроматографическую колонку.

Разделение веществ этим методом основано на том, что большие молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу геля, являющуюся стационарной, и остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой вниз вдоль колонки; небольшие молекулы, напротив, свободно диффундируют внутрь зерен, образуя равновесную систему между подвижной и стационарной фазами, и соответственно с меньшей скоростью двигаются вдоль колонки (рис. 1.5). Обычно момент появления веществ в вытекающем из колонки с сефадексом элюенте выражают формулой:

где V – объем элюирующей жидкости вещества с данным К, мл; V0 – свободный объем колонки или общий объем внешнего растворителя (вне зерен геля), мл; Vi – объем растворителя внутри геля, мл; K – коэффициент распределения для растворенного вещества между растворителем внутри зерен геля и окружающим растворителем. Если анализируемую пробу, содержащую одно растворенное вещество с К = 1 и второе с К = 0, внести в колонку с сефадексом, то второе вещество появится в элюирующей жидкости сразу после выхода из колонки V0 , а первое – только после выхода объема V0+ Vi.

Поскольку молекулы белков, обладающие большими молекулярной массой и размерами, не диффундируют внутрь зерен сефадекса, они первыми вымываются из колонки после выхода свободного объема колонки V0, в то время как все остальные вещества (включая низкомолекулярные примеси) вымываются после выхода объема, равного V0+ К • Vi.

Метод нашел широкое применение в препаративной энзимологии. С помощью сефадекса можно разделить белки с разной молекулярной массой.

Электрофорез. Метод свободного электрофореза, детально разработанный лауреатом Нобелевской премии А.

Тизелиусом, основан на различии в скорости движения (подвижности) белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных значениях рН и ионной силы раствора.

В последнее время более широкое распространение получили методы зонального электрофореза белков на различных носителях, в частности на твердых поддерживающих средах: гелях крахмала и полиакриламида, целлюлозе.

Преимущества их по сравнению с методом свободного электрофореза состоят в том, что исключается размывание границы белок-растворитель в результате диффузии и конвекции, не требуется налаживания сложной аппаратуры для определения положения границы, а для анализа необходимо небольшое количество белка (подробно эти методы и соответствующая аппаратура рассматриваются в практических руководствах по биохимии).

Рис. 1.5. Гель-хроматография на колонке с сефадексом (схема).

Большие светлые кружки с крестиками – зерна сефадекса; малые черные и красные кружки и треугольники – белки с различной молекулярной массой; А – колонка в начале работы; Б, В, Г – колонка в различные периоды времени. На графике элюции четко видно разделение белковых компонентов.

Одним из наиболее распространенных методов фракционирования белков (как и методов оценки гомогенности) является диск-электрофорез (от англ.

discontinuous – прерывистый, перемежающийся) в полиакриламидном геле, при котором используют пары буферных растворов с различными значениями рН и разной степени пористости гель. Следует отметить высокую разрешающую способность гель-электрофореза.

Если при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге открываются всего 6 фракций, то при электрофорезе в крахмальном геле – 10, а в полиакрил-амидном геле – до 18 разных белковых фракций.

Для выявления белков при электрофорезе в гелях их обрабатывают одним из следующих красителей: бромфеноловым синим, амидо черным 10В, кислотным синим 83, кумасси бриллиантовым голубым R-250 и др.

Интенсивность окраски и соответственно относительное содержание каждой белковой фракции обычно определяют денситометрически путем прямого сканирования на денситометре.

В последние годы стали применять методы электрофореза белков с градиентом концентрации геля, что значительно повышает разрешающую способность, особенно при фракционировании белков с высокой молекулярной массой, превышающей 50000– 100000.

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусирования – изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом рН.

Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении рН равен нулю.

При использовании метода изоэлектрического фокусирования применяют смеси синтетических полиаминополикарбоновых кислот (амфолины) для создания градиента рН в диапазоне от 3,0 до 10,0.

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле – методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций.

Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, не лишенный, однако, некоторых примесей солей.

Для полного освобождения белков от низкомолекулярных примесей в настоящее время используют методы диализа, гельхроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллодийная пленка), диаметр пор которых варьирует в широких пределах.

Белки, как правило, не диффундируют через такую мембрану, в то время как низкомолекулярные вещества легко проникают через нее в окружающую среду.

Метод кристаллизации белков основан на достижении критической точки начала осаждения белка из раствора сульфата аммония при медленном повышении температуры.

Уже получены сотни кристаллических белков .

Однако не всякий кристаллический белок является гомогенным, поскольку при одной и той же концентрации раствора сульфата аммония могут кристаллизоваться близкие по размерам и массе разные белки.

Наилучшие результаты при освобождении белков от низкомолекулярных примесей получают с помощью гельхроматографии и ультрафильтрации. Последняя основана на продавливании растворов белка через специальные мембраны, задерживающие белковые молекулы, что позволяет не только освободить белковые растворы от низкомолекулярных примесей, но и концентрировать их.

Предыдущая страница | Следующая страница

СОДЕРЖАНИЕ

Источник: http://www.xumuk.ru/biologhim/007.html

Очистка белков избирательной денатурацией

Осаждение путем избирательной денатурации: Этот способ выделения приемлем только для стабильных белков,

Методы выделения и очистки белков

Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:

  • дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;
  • фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;
  • экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);
  • разделение смеси белков на индивидуальные белки.

{ Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, метод попеременного замораживания и оттаивания, а также обработку клеток ультразвуком.}

А) Гомогенизация биологического материала

Ткань, находящуюся в буферном растворе с определённым значением рН и концентрацией солей, помещают в стеклянный сосуд (гомогенизатор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает и растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

Б) Метод замораживания и оттаивания ткани

В результате попеременного замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Последующее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содержаться в одной из этих фракций.

В) Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на протомеры

Если искомый белок прочно связан с какими-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гидрофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детергенты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протомерами в олигомерных белках.

Г) Удаление из раствора небелковых веществ

Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их Особенные физико-химические свойства.

Так, липиды легко удаляются из раствора добавлением органических растворителей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков.

Нуклеиновые кислоты осаждают добавлением в раствор стрептомицина.

Методы очистки белков

Наиболее трудоёмкий этап получения индивидуальных белков – их очистка от других белков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присутствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.

Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэтому выделение и очистка белков происходят при низких температурах.

На первых стадиях очистки белков целесообразно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устойчивость в кислых растворах.

Первыми методами очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами.

Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.

Очистка белков избирательной денатурацией

Большинство белков денатурирует и выпадает в осадок уже при кратковременном нагревании раствора до 50-70 °С или подкислении раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью избирательной денатурации можно удалить большую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок-белки, или осадить их центрифугированием.

Высаливание

Метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе. Соли щелочных и щёлочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония – (NH4)2SO4. Чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его высаливания.

Дата добавления: 2016-12-06; просмотров: 691 | Нарушение авторских прав

Рекомендуемый контект:

Похожая информация:

Поиск на сайте:

Источник: https://lektsii.org/12-74240.html

Общие принципы выделения белков

Осаждение путем избирательной денатурации: Этот способ выделения приемлем только для стабильных белков,

Механические (интенсивное перемешивание или встряхивание).

Химические (резкое изменение pH, воздействие некоторых органических веществ в высоких концентрациях, воздействие солей тяжелых металлов, мочевины , поверхностно активных веществ – додецилсульфат натрия, меркаптоэтанол (на белки, содержащие – SH ) ) .

Физические (резкое изменение температуры, ионизирующие излучение)

Признаки денатураци:

1) помутнение раствора белка,

2) изменение вязкости,

3) изменение реаактивности функциональных групп.

4) изменение биологической активности,

5) выпадение в осадок.

Различают денатурацию обратимую и необратимую.

Если убрать факторы, вызывающие денатурацию, и молекула белка денатурирует, то-есть восстанавливает все уровни структурной организации( вторичную, третичную и четвертичную), соответственно обретая все свои утерянные при денатурации физико-химические свойства и биологическую активность, то такой вид денатурации называется обратимым. Если же после удаления денатурирующих факторов физико-химические свойства и биологическая активность белка не восстанавливается, то это – необратимая денатурацию. Явление денатурации широко используется в медицине и биологии. Оно используется для целого ряда лабораторных исследований; при стерилизации инструмента и спецодежды; при кварцевании палат и операционных (вызывается денатурация белков микроорганизмов); в лечении онкобольных (облучение ионизирующим излучением + локальная гипертермия опухолей).

Для изучения белка (будь то определение его структуры или биологических функций) первым делом необходимо выделить белок в чистом виде. Поскольку белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию большенства химических реагентов (органических растворителей, кислот, щелочей и т.д.

), обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, экстракция, кристаллизация и т.д.) оказались в случае белков неприемлимыми. Белки в этом случае подвергаются денатурации, теряя свою биологическую активность.

Поэтому разработаны эффективные методы выделения белков в мягких условиях, при пониженной температуре (не более +4 по Цельсию) с применением щадящих нативную структуру химических реагентов. Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани), исследуемый материал тщательно измельчают, вплоть до разрушения клеточной структуры.

Этот процесс называется гомогенизация. Для этого используются различного рода гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультрозвук, метод «азотной бомбы “ (клетки насыщаются азотом под давлением, затем резко сбрасывают давление, а выделяющийся газообразный азот как бы “взрывает“ клетки). На следующем этапе из полученного гомогената тканей белки экстрагируют.

Для экстракции белков широко применяются различные буферные смеси с определенным значением рН, органические растворители (водные растворы глицерина, слабый раствор глюкозы), различные ферменты, расщепляющие белково-липидные и белково-белковые связи (додецилсульфат натрия, дезоксихалат натрия и т.д.).

После достижения полной экстракции белков (то-есть перевода в растворенное состояние), приступают к фракционированию белков, то-есть разделению смеси белков на отдельные белки. Часто фракционирование сочетается с идентификацией. Для этого используются различные методы:

1) электрофорез (различные виды: на бумаге, на геле, высоковольтный и т.д.). 2) ультроцентрифугирование 3) иммуно-химический анализ (антиген+антитело)

4) различные виды хроматографии 5) гельфильтрация.

Для последующей очистки белков от низкомолекулярных примесей используются методы диализа, гельфильтрации, кристаллизации, ультрафильтрации и т.д. Все эти методы основаны на разной растворимости, разной осаждаемости, величине (диализ, гельфильтрация), разности зарядов (электрофорез, ионообменная хроматография).

Иногда используют разную биологическую активность (это при фракционировании и очистке ферментов). Но об этом легко говорить, однако осуществить трудно.

В общем случае необходима многостадийная обработка исходного материала, на каждой из этих стадий удаляется большая часть постороннего материала, присутствующего в образце после предидущей стадии разделения до тех пор, пока искомый белок не будет получен в чистом виде, без примесей.

Универсальной методики выделения для всех белков не существует. Хорошим считается результат, когда очистка проходит 5-6 стадий. Например, выделение галоктозосвязывающего белка из кишечной палочки (участвует в транспорте галактозы через мембрану) включает следующие стадии:

1) гомогенизирование 2) осаждение протамином (для удаления ДНК иРНК)

3) осаждение сульфатом аммония (высаливание – снижает растворимость белка).

4) хроматография на целлюлозе

5) хроматография на гидроксил-апатите

6) хроматография на сефадексе

Для определения степени очистки расчитывают удельную активность белка или используют метод аналитического центрифугирования. Очень эффективные методы:

1) афинная хроматография (1968 год – Анфинсен и сотрудники) – основан на специфическом связывании антиген-антитело.

2) изоэлектрофокусировка – использует различие в изоэлектрической точке белков (обычно используют полиакриламидный гель или агарозу) – на гель наносят слой белка, который мигрирует через области с различными рН, до тех пор, пока не достигнет изоэлектрического состояния.

ОТКРЫТИЕ БЕЛКОВ В РАСТВОРАХ.

Для открытия белков в растворах используют цветные реакции или реакции осаждения.

Цветные реакции различают двух типов:

1)универсальные, когда реагент реагирует с пептидной связью (биуретовая, нингидриновая) – эти реакции характерны для всех белков.

2)специфические – когда реагент дает окрашенные производные с какими-то определенными аминокислотами (реакция Фоля – на серусодержащие аминокислоты, реакция Миллона – на тирозин, ксантопротеиновая – азотная кислота взаимодействует с ароматическими аминокислотами, вызывая их нитрование – появляется желтое окрашивание).

Реакции осаждения делятся на необратимые (по сути, это – необратимая денатурация) и обратимые (высаливание). О денатурации мы уже говорили.

Для высаливания применяются большие концентрации нейтральных солей: NaCl; (NH4)2SO4; MgSO4. При этом происходит дегидротация и снятие заряда, что является необходимым условием высаливания.

На процесс высаливания влияет ряд факторов: молекулярная масса белка, гидрофильность, заряд белка и т.д.

МЕТОДЫ КОЛЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ.

Для количественного определения белка в растворе широко используются методы, основанные на использовании оптических свойств белков.

1)Рефрактометрический метод ( прибор рефрактометр) – чем больше концентрация белка в растворе, тем на больший угол отклоняется луч света, пропущенный через раствор белка, что и фиксируется прибором.

2)Нефелометрический метод (прибор – нефелометр). Основан на свойстве белковых растворов рассеивать свет. Соответственно, чем выше концентрация белка в растворе, тем больше степень рассеивания света.

3)Спектрофотометрический метод (прибор – спектрофотометр). Основан на свойстве раствора белка поглощать свет в ультрофиолетовой части спектора. Чем больше белка в растворе, тем больше поглощение этим раствором ультрафиолетовых лучей, что и фиксируется прибором.

4)Поляриметрический метод (прибор – поляриметр). Основан на зависимости вращения плоскости поляризованного света, пропускаемого через белковый раствор, от концентрации белка.

5)Кроме методов, основанных на оптических свойствах белка, широко используется колориметрический метод. Суть метода: проводят цветную реакцию и через окрашенный раствор белка пропускают свет с определенной длинной волны. Часть света поглощается окрашенным раствором белка. Степень поглощения зависит от концентрации белка в растворе.

6)В тех случаях, когда невозможно прямое определение белка в растворе, используют азотометрический метод. То-есть определяют не белок, а азот в растворе. Зная, что среднее содержание азота в белке составляет примерно 16%, легко, определив количество азота, рассчитать, сколько в растворе содержалось белка.

СТРУКТУРА БЕЛКА.

Белки обладают сложной пространственной структурой. Обычно принято говорить о четырех уровнях структурной организации белковой молекулы.

1)Первичная структура определяется:

а)природой входящих в молекулу аминокислот;

б)относительным количеством входящих в молекулу аминокислот;

в)строго определенной аминокислотной последовательностью полипептидной цепи (или цепей). Если имеются простетические группы , их состав и количество также влияют на первичную структуру. Впервые первичную структуру для одного из белков (инсулина) определил в 1951 году Сенджер (потребовалось несколько лет).

Он показал, что аминокислотная последовательность инсулина включает 51 аминокислоту. В 1975 году была установлена первичная последовательность аспартатаминотрансферазы (412 остатков). К настоящему времени известна аминокислотная последовательность примерно в 1500 белков.

За прошедшее с тех пор время, методы исследования были значительно усовершенствованы и теперь определение аминокислотной последовательности вызывает меньше затруднений. Используя, в частности, автоматические секвенаторы, работающие с очень малыми количествами образца (10 в –12 степени моль).

Расшифрована аминокислотная последовательность молекулы антитела альфа-глобулиновой фракции крови – установленная аминокислотная последовательность включает 1320 аминокислотных остатков! Необходимо отметить, что последовательность аминокислот закодирована в генах, поэтому при синтезе белка формирование первичной структуры происходит не спонтанно, а согласно информации, закодированной в генах. Для первичной структуры характерна видовая специфичность, то-есть каждый вид животных организмов имеет свою, неповторимую первичную структуру у белков, выполняющих одну и ту же функцию у разных видов. Например, инсулин человека, свиньи, собаки, коровы и так далее для каждого вида имеет свою последовательность аминокислот, хотя и выполняет аналогичную функцию. Поэтому введение инсулина каких либо животных человеку не дает биологического эффекта.

Высшие уровни структуры белков, в частности, общая конформация и биологическая активность белка тесно связаны и фактически определяется аминокислотной последовательностью.

Это убедительно подтверждают синтез Меррифильдом фермента рибунуклеазы (124 аминокислотных остатка). Этот синтезированный фермент принял такую же конформацию, как и нативный фермент и обладал такой же биологической (ферментативной) активностью.

Получено много подобных фактов и с другими синтетическими белками (пептидами).

Свидетельства другого рода накоплены на основании изучения серповидно-клеточной анемии – наследственной болезни, при которой способность эритроцитов связывать кислород снижается. Интактная молекула гемоглобина состоит из двух бэтта- цепей и двух альфа-цепей.

Бэтта- цепь нормального гемоглобина взрослого человека в шестом положении содержит глутаминовую кислоту. В серповидных клетках (характерно измененной формы) – бэтта-цепь в шестом положении содержит валин. Все остальные аминокислоты в составе бэтта-цепи и альфа-цепи совершенно одинаковые.

Несмотря на столь малое различие (при общем числе аминокислотных остатков равном 574), молекула гемоглобина S имеет сниженную спсобность связывать кислород, видимо из-за того, что молекулы гемоглобина S имеют тенденцию слипаться, образуя агрегаты большого размера, что и вызывает изменение формы эритроцитов и превращение их в серповидные.

Деформированные эритриоциты могут задерживаться в узких кровяных сосудах, что еще больше снижает доставку кислорода в ткани. Они легко разрушаются, что вызывает анемию,

Но было бы неправильно считать, что каждый аминокислотный остаток в каждом белке необходим для сохранения нормальной структуры и функции белка. Это не так.

Например, были выявлены многие варианты аминокислотных последовательностей гемоглобина, функционирующие нормально.

Вероятно, можно употреблять понятие о «необходимых» (существенных) и «допустимых замещениях» (малосущественных) остатках аминокислот в полипептидной цепочке белка.

Исходя из изложенного, можно отметить важное значение первичной структуры белковых молекул:

1) определяет общую конформацию и биологическую активность белка,

2) Определяет видовую специфичность,

3) позволяет определять молекулярные патологии,

4)дает возможность синтезировать белок с заданными биологическим свойствами (впервые был синтезирован инсулин Сэнджером в 1964 году).

Как же определить первичную структуру. Прежде чем приступить к секвенироированию, обычно проводят некоторые важные предварительные исследования, для чего необходимо иметь очищенный препарат белка. Определяют:

1)Молярную массу и оценивают чистоту препарта,

а) колончатая хроматография (гельфильтрация – используется агароза или декстран);

б) электрофорез в полиакриламидном геле (применяется для разделения, очистки, оценки чистоты и для определения молекулярной массы );

в) аналитическое ультроцентрифугирование.

2) Определяет тип и число простетических групп. При секвенировании иногда их отделяют от белковой части.

3) Определяются внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи и однвременно определяется число сульфгидрильных групп цистеина.

4)Белки, имеющие чтвертичную структуру, разделяют на отдельные полипептидные цепи (изменяют pH, обрабатывают поверхностноактивными веществами и так далее).

Природу и количество аминокислот, составляющих белок, определяют, проводя расщепление белка до отдельных аминокислот и затем анализируют эту смесь. Обычным методом расщепления служит кислотный гидролиз, или вместо соляной кислоты добавляют метансульфоновую кислоту.

(12 –36 часов при температуре 100 – 110 градусов, чаще в атмосфере азота). Более мягкий метод – с использованием протеолитических ферментов (пептидаз), но здесь возможно «загрязнение» (кроме расщепления полипептида, они могут катализировать собственное расщепление).

Качественно и количественно определяются аминокислоты с помощью хроматографии.

Определение последовательности аминокислотных остатков в полипептидной цепи обычно начинается с определения концевых остатков. С-концевую аминокислоту можно определить обработав полипетид гидразином (NH2 – NH2 ), который реагирует с гидроксильными группировками в составе пептидной связи, но не образует соединения с концевой карбоксильной группой.

Вследствие этого концевую (С – концевую) аминокислоту можно выделить и идентифицировать, используя хроматографические методы. Другой метод – обработка полипептида карбоксипептидазой (выделяется из желудочного сока). Она довольно специфично отщепляет С- концевые остатки полипептида.

Необходимо контролировать только скорость отщепления аминокислотных остатков

Аминопептидаза – атакует полипептидную цепь с другого конца. И карбоксипептидаза и аминопептидаза являются экзопептидазами, то-есть катализируют отщепление концевых аминокислотных остатков.

Для идентификации N-концевой амино кислоты используют: реактив Сэнджера (2,4-динитрофторбензол), или реактив Эдмана (фенилизотиоционат) или дансилхлорид.

Но именно при использовании реактива Эдмана расщепляется первая (а не несколько) пептидная связь.

NO2

_NO2

| |

| |

F N=C=S

2,4 – динитробензол Фенилизотионат

Однако, даже в случае использовании автоматического аминокислотного секвинатора, максимальное возможное число операций с использованием реактива Эдмана ограничено отщеплением 40 – 60 аминокислотных остатков. Полипептидные цепи же обычно гораздо длиннее. Например.

141 аминкислотный остаток в альфацепи гемоглобина, 188 – в гормоне роста, 332 – в глицероальдегиддегидрогеназе. Поэтому, наилучшей является следующая стратегия: большие полипептиды расщепляются на несколько фрагментов. Каждый из которых затем выделяется и секвенируется с помощью реактива Эдмана.

Для получения фрагментов используют эндопептидазы (трипсин – предпочтительно расщепляет пептидные связи, содержащие карбоксильные группы основных аминокислот: лизин, аргинин; химотрепсин – то же самое, только ароматических аминокислот: тирозин, фенилаланин, триптофан).

Есть и химические реактивы, например, бромциан BrCN – расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильной группой метионина. Обычно фрагментирование проводят комбинированно, используя различные комбинации реагентов, чтобы достаточно точно определять последовательнсть фрагментов.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/1_120631_obshchie-printsipi-videleniya-belkov.html

Medic-studio
Добавить комментарий