Основные типы культур клеток животных и растений: Клеточные культуры классифицируют по ряду признаков. Культуры клеток

Культуры животных клеток Лекция 3 Животные клетки

Основные типы культур клеток животных и растений: Клеточные культуры классифицируют по ряду признаков. Культуры клеток

Культуры животных клеток Лекция 3

Животные клетки гораздо сложнее культивировать in vitro по сравнению с растительными клетками по следующим причинам: 1. Требуются более сложные по составу питательные среды. 2. Клетки очень чувствительны к механическим воздействиям. 3. Рост клеток происходит преимущественно после прикрепления к поверхности.

Культуры клеток животных классифицируют по следующим признакам: • способу культивирования; • происхождению; • продолжительности культивирования

Способы культивирования животных клеток Культивирование на внутренней поверхности культурального сосуда Монослойные культуры Глубинное культивирование Суспензионные культуры

Монослойные (опорно-зависимые) культуры – культуры, клетки которых размножаются в форме монослоя, прикрепившись к субстрату

В качестве субстрата для опорно-зависимых клеток используют: 1. Пластик (полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон и др. ) 2. Стекло (пирекс (алюмоборосиликатное стекло)) 3. Металлы (нержавеющая сталь, титан)

Клетки связываются с субстратом не непосредственно, а с участием факторов адгезии К факторам адгезии относятся: • фибронектин; • коллаген; • поли-L-лизин; • хондронектин (адгезия хондроцитов); • ламинин (адгезия эпителиальных, нервных клеток)

Монослойные культуры Стационарные культуры, растущие в неподвижных культуральных сосудах Роллерные культуры, растущие в сосудах, вращаемых вдоль своей продольной оси Площадь, занимаемая клетками, увеличивается на порядок по сравнению со стационарными культурами

Роллерные культуры (до 700 бутылок в каждой установке, сотни литров) используют для получения противовирусных вакцин и интерферона

Суспензионные культуры – культуры, клетки которых способны расти во взвешенном (суспендированном) состоянии в жидкой питательной среде

Преимущества суспензионных культур: • простота субкультивирования; • отсутствие необходимости увеличения площади поверхности роста наряду с возрастанием объема; • простота сбора клеток !Не все типы животных клеток могут расти в суспендированном состоянии

Типы культур животных клеток в зависимости от происхождения

А) в зависимости от типа исходной ткани: – элементы соединительной ткани (фибробласты, лимфоциты, клетки хряща и др. ); – мышечные ткани (скелетные, сердечные и гладкие мышцы); – эпителиальные ткани (печень, легкие, почки и др. ); – клетки нервной системы; – эндокринные клетки (надпочечники, гипофиз и др. ); – опухолевые клетки

Широко используемые культуры клеток животных: а – фибробласты; , б – эпителиальные клетки; с – мышечные клетки; d – лимфоциты; e – нейроны

Фибробласты Культура фибробластов ВНК 21 от сибирского хомяка впервые была получена в 1964 г.

Фибробласты Отличаются легкостью культивирования. Используются для изучения клеточных, биохимических, молекулярных аспектов патогенеза ряда болезней. Данные, полученные на культивируемых фибробластах, могут быть перенесены (экстраполированы) на условия in vivo.

Фибробласты – клетки молодости Используются для омоложения в косметологии, лечения ожогов и рубцов

Эпителиальные клетки Клетки почек мыши (первичная культура) Клетки почек хомяка (после нескольких субкультивирований)

Лоскут эпидермальной ткани, выращенной из клеток кожи человека in vitro

Мышечные клетки

Нейроны

Лимфоциты Могут расти в виде суспензионной культуры

Б) в зависимости от степени специализации ткани (эмбриональная либо взрослая ткань) Эмбриональные ткани активный рост, лучшая выживаемость in vitro Взрослые ткани низкая пролиферативная способность В) в зависимости от физиологического состояния (нормальная либо опухолевая ткани) Нормальные ткани дают начало культурам с ограниченным временем жизни Опухолевые ткани способны пролиферировать неограниченно долгое время

He. La Одна из первых и наиболее широко используемых культур опухолевых клеток человека • 8 января 1951 г. : выделена из раковой опухоли шейки матки (Henrietta Lacks (1920 -1951)) Henrietta Lacks (circa 1945)

более чем 60, 000 научных статей с использованием клеток He. La. Интенсивно используется для исследования раковых заболеваний. Клетки He.

La называют «бессмертными» , они способны делиться бесконечное число раз, в отличие от обычных клеток. Были заражены геномом вируса папилломы, от которого умерла женщина. Обладают аномальным кариотипом: различные сублинии He.

La имеют 49 — 78 хромосом. Recent National (US) Bestseller story about Henrietta Lacks

Типы культур животных клеток в зависимости от продолжительности культивирования Первичные культуры Клеточные линии Свежевыделенные культуры. Существуют лишь до первого пересева даже при систематической смене питательной среды Культуры, подвергаемые пассированию в течение ограниченного времени (до 50 пассажей) либо способные к неограниченному росту

Первичная культура Субкультивирование Клеточная линия Ограниченная Постоянная Трансформация Деградация

Получение первичной культуры Этап 1. Стерильное удаление фрагмента ткани, органа животного Источником получения первичных культур клеток чаще всего являются эмбриональные ткани (например, птиц и других экспериментальных животных, абортированных 8 -14 -недельных плодов человека)

Получение первичной культуры Этап 2. Механическая и ферментативная дезагрегация экспланта 2. 1. Ткань измельчается до кусочков объемом до 1 -3 мм, экспланты отмываются от эритроцитов раствором Хенкса с антибиотиками пока жидкость не станет почти прозрачной

2. 2. Для разрушения межклеточного вещества используют ферменты: трипсин или коллагеназу Обработку раствором трипсина можно проводить при комнатной (холодная трипсинизация) либо повышенной температуре (+37ºС). Кусочки ткани заливают раствором трипсина и в смесителе на магнитной мешалке перемешивают взвесь в течение 10 -30 мин

Получение первичной культуры Этап 3. Центрифугирование полученной суспензии клеток Для отделения крупных комочков ткани и соединительнотканных волокон содержащую клетки жидкость фильтруют через марлю, затем центрифугируют при 800 -1000 об/мин в течение 5 мин.

Получение первичной культуры Этап 4. Ресуспендирование клеток в питательной среде, перенос в культуральные сосуды Надосадочную жидкость сливают, осадок отмывают раствором Хенкса и разводят питательной средой, чтобы получить в 1 мл 100 000 -400 000 клеток. Взвесь клеток разливают в матрацы, плотно закрывают пробками и помещают в термостат при температуре 37 °С.

Получение первичной культуры Этап 5. Формирование монослойной культуры Прикрепляясь к субстрату, клетки в течение нескольких суток (как правило, 5 -7) образуют монослой в виде пласта, сцепленного со стенками матрацев

Схема получения первичной культуры Измельченная ткань Засев в культуральные сосуды Эксплант Орган Энзиматическая дезагрегация Формирование монослоя

Как определить, что клеточную культуру пора рассевать? • клетки образуют плотный монослой; • индикатор-краситель меняет цвет (например, индикаторный краситель Phenol Red (феноловый красный) меняет цвет с ярко-красного в свежей среде до желто -оранжевого в среде с культивируемыми в течение некоторого времени клетками)

КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ 1. Клеточные линии с ограниченным ростом – культуры клеток, которые сохраняют способность к делению в течение определенного времени К ним относятся диплоидные культуры (диплоидные штаммы).

В зависимости от вида животного продолжительность жизни диплоидных штаммов различна: для свиней – 25 -40 пассажей, овец – 30 -35 пассажей, крупного рогатого скота – 30 -45 пассажей, лошадей – 50 -60 пассажей. Человек 50± 10 пассажей Наиболее активное размножение клеток диплоидных штаммов наблюдают в период от 5 до 20 пассажей, затем активность клеточного метаболизма снижается.

После определенного количества пассажей диплоидный штамм либо стареет и дегенерирует, либо трансформируется и превращается в постоянную клеточную линию Трансформация – это необратимое изменение ростовых характеристик культивируемых клеток, вызванное определенными факторами (вирусами, химическими агентами, облучением и др. ). Трансформированные клетки не имеют ограниченной продолжительности жизни, и это обусловливает их преимущество в биотехнологии.

КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ 2. Постоянная клеточная линия – линия клеток, которая поддерживается в результате последовательных субкультивирований неограниченно долгое время. Полностью адаптированы к существованию вне организма. Автономно размножаются подобно бактериям. Получают из раковых и реже нормальных тканей.

Преимущества постоянной клеточной линии: • более высокая скорость роста; • высокая плотность, а следовательно, и больший выход биомассы; • возможность поддержания в более простых средах; • способность к росту в суспензии

Источник: https://present5.com/kultury-zhivotnyx-kletok-lekciya-3-zhivotnye-kletki/

Раздел

Основные типы культур клеток животных и растений: Клеточные культуры классифицируют по ряду признаков. Культуры клеток

главы: Разделы учебника: Реклама

Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования.    

Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или переса­дочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований.

Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токси­ческих веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток.

Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток.

Поэтому, несмотря на пе­речисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным.

Получение стабильно устойчивых линий — процесс длительный.

Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает.

Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах.

Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение последующих 4—6 субкультивирований на селективной среде проверяет­ся стабильность устойчивости полученных клонов.

Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2—3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растения-регенеранты. Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибов—возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам.

Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне редко, на древесных.

Уже достигнуты первые положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCI или Na2S04.

Получены клетки, а из них растения моркови, которые синтезируют в 20 раз больше метионина, в 30 раз — триптофана, в 5 раз — лизина путем добавления в питательную среду токсичных аналогов аминокислот. Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили.

Что касается древесных, то для них работы в этом направлении крайне редки и часто имеют поисковый характер. Таким образом, использование каллусной культуры в селекционных целях открывает огромные возможности в создании новых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для человечества.

Наряду с перечисленными выше объектами (каллусная, суспензионная культура, изолированные протопласты), в качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а также культура изолированных зародышей. Например, путем культивиро­вания и селекции in vitro зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с улучшенным  содержанием  белка.  Для  картофеля  разработан эффективный метод обработки побегов и черенков мутагеном, приводивший к получению химерных мутантов хлорофиллдефектности и антибиотикоустойчивости. При культивировании пыльников яровой пшеницы сорта Саратовская-29 и Московская-35 на питательных средах с повышенным содержанием солей хлорида натрия получены соматические эмбриоиды, а в дальнейшем растения-регенеранты, проявившие повышенную солеустойчивость (Беккужина, 1993).

Таким образом, проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в 2—4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции.

Читать дальше ► преимущества клеточной селекции

Источник: http://www.biotechnolog.ru/pcell/pcell5_3.htm

Культуры клеток, классификация, характеристика. Культивирование вирусов на культурах клеток. Подготовка материала, заражение культуры

Основные типы культур клеток животных и растений: Клеточные культуры классифицируют по ряду признаков. Культуры клеток

Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются следующие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные эмбрионы; 3) лабораторные животные.

I. Культуры клеток

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на первичные (первично трипсинизированные), полуперевиваемые (диплоидные), перевиваемые, трансфецированные.

По происхождению они подразделяются на эмбриональные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу — на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, способные культивироваться в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности в специальной питательной среде, но не способные к длительному размножению. Срок жизни таких культур ограничен.

В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток.

Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (диплоидные) культуры клеток — клетки одного генотипа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные линии фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются бессмертием и гетероплоидным кариотипом.

Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ — из сердца обезьяны циномольгус, ПЭС — из почек эмбриона свиньи, ВНК-21 — из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС — из почки морской свинки и др.

), отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению в клетках таких свойств, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Другой источник перевиваемых клеточных линий — злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo.

Получены и наиболее широко в вирусологической практике применяются следующие линии перевиваемых клеток: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Hep-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака легкого в костный мозг; RH — из опухоли почки человека.

Трансфецированные культуры клеток. Разработаны экспериментальные линии культур клеток методом трансфекции (переноса) генов вирусов, контролирующих биосинтез поверхностных антигенов.

Такие культуры клеток экспрессируют поверхностный белок определенного вируса (HBs-антиген, gp120 и др.) на мембране клеток культуры.

Такие культуры клеток используются с целью изучения иммунологических механизмов патогенеза вирусных инфекций, разработки химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.

Для обеспечения жизнедеятельности культивируемых клеток необходимы питательные среды. По назначению они делятся на ростовые и поддерживающие.

В ростовых питательных средах должно содержаться больше питательных веществ, обеспечивающих активное размножение клеток и формирование монослоя.

Поддерживающие среды обеспечивают переживание клеток в уже сформированном монослое в период размножения в них вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса.

Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

С целью предотвращения возможного роста микроорганизмов в питательные среды вносят антибиотики.

Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации

При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток.

Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин.

контакта вируса с монослоем клеток удаляют избыток материала, в культуру клеток вносят поддерживающую среду и пробы оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикатором наличия вируса в зараженных таким образом культурах клеток может служить:

1)       развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие вируса (ЦПД), имеющее три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток (симпластов); развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

2)       обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и/или в ядрах пораженных клеток;

3)       положительная реакция гамагглютинации (РГА) или гемадсорбции (РГАдс);

4)       феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.

5)       при отсутствии ЦПД, ГА или ГАдс. можно использовать реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Источник: https://students-library.com/library/read/29821-kultury-kletok-klassifikacia-harakteristika-kultivirovanie-virusov-na-kulturah-kletok-podgotovka-materiala-zarazenie-kultury

Medic-studio
Добавить комментарий