Положительный и отрицательный контроль: Положительный контроль необходим для проверки работы всех компонентов

Контроль реакции амплификации

Положительный и отрицательный контроль: Положительный контроль необходим для проверки работы всех компонентов

Параллельно с опытнымипробами ставятся контрольные образцыположительного и отрицательногоконтроля.

Положительный контроль– включает в себя все компоненты реакции,но вместо материала клинического образцавносится контрольный препарат ДНКисследуемого возбудителя. Положительныйконтрольный образец, используемый вкаждой постановке ПЦР, долженсоответствовать следующим требованиям:

  • быть стабильным в течение срока хранения тест-системы;
  • иметь точно измеренную концентрацию ДНК или РНК в препарате;
  • быть стерильным;
  • иметь аттестацию в ГИСК им. Л.А. Тарасевича (наличие стандартных образцов производителя или отраслевых стандартных образцов).

Отрицательный контрольвключает в себя все компоненты реакции,но вместо клинического материала илипрепарата ДНК вносится соответствующееколичество деионизованной воды илиэкстракта, не содержащего исследуемойДНК. Отрицательный контроль необходимдля проверки компонентов реакции наотсутствие в них ДНК или клеток возбудителявследствие контаминации, а такжепозволяет исключить учет ложноположительныхрезультатов.

Внутренний контроль вко

ВКО – это искусственносконструированный препарат ДНК илиРНК, имеющий те же сайты узнаванияпраймерами, что и ДНК или РНК микроорганизма,но размер амплифицированного ВКОпревышает размер специфическогоампликона. ВКО не должен конкурентноингибировать в ПЦР при минимальныхколичествах ДНК микроорганизма.

Использование ВКО наэтапе обработки клинического материалапозволяет проверить качество проведенияважных элементов ПЦР анализа:

  1. Контроль потерь ДНК/РНК и эффективность экстракции при обработке биологического материала.

  2. Контроль эффективности удаления ингибиторов ПЦР.

  3. Контроль работы лабораторного персонала.

Строгое соблюдениеправил работы в ПЦР лаборатории позволяетобеспечить достаточную надежностьлабораторных данных, что имеет огромноезначение для оказания высококачественноймедицинской помощи.

Проблема контаминации

Контаминация – попаданиеиз внешней среды в реакционную смесьспецифических и неспецифических молекулДНК, способных служить мишенями в реакцииамплификации и давать ложноположительныеили ложноотрицательные результаты. Припроведении ПЦР-анализа возможны двепричины возникновения контаминации:

  • перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов;
  • контаминация продуктами амплификации (ампликонами), являющаяся наиболее частой причиной ложноположительных результатов, поскольку в процессе ПЦР – анализа ампликоны накапливаются в больших количествах и очень легко переносятся воздухом с пылью, с аэрозолями, а также через приборы или руки. Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхности лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложнопожительных результатов.

Для любой лабораторнойметодики основной проблемой являетсяпрофилактика ложноположительных иложноотрицательных результатов.Существуют два вида ошибок на аналитическомэтапе при проведении ПЦР-анализа:ложноположительные и ложноотрицательные.

Ложноположительныерезультаты на лабораторном этапе могутвозникать при контаминации (загрязнении)как в отдельных пробах, так и во всехпробах (тотальная контаминация). Этонаиболее трудно выявляемый вид ошибок.

Основной причинойложноположительных результатов являетсятак называемая перекрестная контаминацияпродуктами амплификации. В ходе постановкиреакции амплификации происходитизбирательное размножение участка ДНК(ампликона) искомого возбудителя.Количество ампликона в пробе призавершении реакции может достигатьмиллиардов копий.

При неосторожномобращении с пробами после реакцииамплификации, даже просто при открываниипробирки трудно избежать аэрозольноговыброса макроколичеств реакционнойсмеси в атмосферу рабочего помещения.При этом может происходить контаминациявоздуха, рабочей поверхности, перчаток,пипеток и т.д.

Учитывая тот факт, чточувствительность реакции составляетединичные молекулы ДНК, а при аэрозольномвыбросе возможно попадание в атмосферусотен тысяч молекул, то очень высокавероятность попадания ампликона висследуемые пробы.

В этом случаеполучается положительный результат невследствие наличия в пробе искомогоинфекционного агента, а в результатеразмножения ампликона.

Ложноотрицательныерезультаты на лабораторном этапевозникают в случаях: потери ДНК во времянеправильной транспортировки, принесоблюдении технологии выделения ДНК,при использовании некачественныхреактивов.

Добавление ВКО в пробу довыделения ДНК позволяет решить этупроблему.

Ускоренные методы выделениеДНК также увеличивает вероятностьпотери ДНК/РНК, особенно заметные приработе с небольшими количествами ДНКв образце.

Однойиз основных причин такого рода результатовявляется наличие в исследуемой пробеингибиторов реакции. Чаще всего с такимирезультатами приходится сталкиватьсяпри анализе клеточного осадка мочи илигнойного отделяемого, т.к. эти образцысодержат большое количество субстанций,способных ингибировать ход реакцииполимеризации ДНК-мишени.

Проверитьналичие ингибиторов в исследуемой пробеможно путем добавления аликвоты пробыв образец с контрольной ДНК-мишенью,имеющейся в каждом наборе (ВКО). Если врезультате проведенного экспериментане получается ожидаемый фрагмент ДНК,значит исследуемый образец содержитингибирующие компоненты.

В этом случаенеобходимо еще раз тщательно отмытьобразец, убедиться в высоком качествереагентов, используемых для выделенияДНК и повторить реакцию амплификации.

Другая причиналожноотрицательных результатов – этонизкая активность фермента Taq-полимеразыи деградация дезоксинуклеотидтрифосфатовили олигонуклеотидных праймеров,обусловленная неправильным хранениемили частым замораживанием и оттаиваниемреагентов.

Существует несколькоспособов борьбы с контаминацией:

  • одним из них является использование фермента N-урацил-глико­зилазы.
  • другим способом инактивации ампликонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением ультрафиолетовым светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не могут участвовать в реакции амплификации;
  • третьим – проблема ложноположительных результатов решается с помощью организационных мероприятий (см. выше).

Источник: https://studfile.net/preview/5585844/page:23/

Тема 41: Полимеразная цепная реакция (стр. 5 )

Положительный и отрицательный контроль: Положительный контроль необходим для проверки работы всех компонентов

В настоящее время система состоит из 141 раздела (89 собственных разделов ФСВОК и 52 раздела, совместных с зарубежными системами внешней оценки качества), охватывающих все основные виды клинико-лабораторных исследований. Ежегодно в ФСВОК участвует около семи тысяч клинико-диагностических лабораторий Российской Федерации.

Основными разделами ФСВОК относительно ПЦР являются:

·  ПЦР – выявление микобактерий туберкулеза

·  Молекулярно-генетическое выявление лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза

·  ПЦР – выявление вируса гепатита В (HBV)

·  ПЦР – выявление HCV

·  ПЦР – выявление ВИЧ

·  ПЦР – выявление C. trachomatis, M. hominis, U. urealiticum

·  ПЦР – выявление N. gonorrhoeae

·  ПЦР – выявление вируса папилломы человека (ВПЧ)

·  Количественное определение ДНК вируса гепатита В (ВГВ) методом ПЦР

·  Количественное определение РНК вируса гепатита с (HCV) методом ПЦР

Внутренний контроль качества

Порядок проведения внутрилабораторного контроля качества определяется в МУ1.3.2569-09 следующими мероприятиями:

В лаборатории, использующей методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) в диагностических целях, проводят внутрилабораторный контроль качества проводимых исследований с периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой руководителем лаборатории, но не реже одного раза в квартал.

При проведении внутрилабораторного контроля качества лабораторных исследований могут использоваться аттестованные на наличие аналита (его количества) панели производителей коммерческих наборов или внутрилабораторные аттестованные образцы, содержащие и не содержащие нуклеиновые кислоты конкретных возбудителей в различной концентрации, стабильные в условиях хранения.

Реализация указанных положений возможна при использовании следующих подходов:

1. Постановка внутренних контролей (ВК)

2. Использование отрицательных контрольных образцов (К-)

3. Использование положительных контрольных образцов (К+)

4. Постановка специальных контролей

5. Регулярные смывы с поверхностей

Внутренние контроли

Препарат ДНК, подготовленный к ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях и приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Поэтому становится необходимым контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью.

Для этой цели в каждую пробирку добавляют дополнительный, так называемый, внутренний контроль. Он представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма.

Для инфекционных тест-систем иногда используют, например, β-глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций «пришивают» участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы.

При отсутствии регистрации внутреннего контроля и выявления специфической ДНК результат следует считать недостоверным. В этом случае для данного исследуемого образца рекомендуется перевыделить ДНК.

Если внутренний контроль внести в реакционную смесь, то он станет такой же мишенью для отжига праймеров, как и ДНК искомого возбудителя инфекции. Размер продукта амплификации внутреннего контроля подбирают таким образом, чтобы он отличался от специфических ампликонов в 2 и более раз.

В результате, если внести ДНК внутреннего контроля в реакционную смесь вместе с испытуемым образцом, то независимо от наличия микроорганизма в биологическом образце, внутренний контроль станет причиной образования ампликонов, которые отличаются по размеру от специфических ампликонов, получаемых после постановки ПЦР в присутствии специфической ДНК микроорганизма.

Наличие ампликонов внутреннего контроля в реакционной смеси будет свидетельством нормального прохождения реакции амплификации и отсутствия ингибиторов.

Если ампликоны нужного размера не образовались, но не образовались также и ампликоны внутреннего контроля, можно сделать вывод о возникшей проблеме при прохождении ПЦР как следствие наличия в анализируемом образце нежелательных примесей, от которых следует избавиться, либо технологических нарушений. В любом случае результат реакции следует признать недостоверным.

Важно отметить, что если в реакционной смеси находится нужная ДНК, то эффективность ее амплификации может заметно снижаться из-за конкуренции за праймеры с ДНК ВК.

Это особенно заметно при низких концентрациях ДНК в испытуемом образце и может приводить к ложноотрицательным результатам.

Поэтому концентрация внутреннего контроля должна быть такой, чтобы не составлять конкуренции для амплификации даже единичных искомых молекул ДНК.

Количественный анализ ВК позволяет в каждой пробе оценивать потери выявляемой ДНК/РНК на стадии пробоподготовки, а также определить снижение эффективности за счет ингибиторов обратной транскрипции или ПЦР. В связи с этим ВК должен удовлетворять следующим требованиям:

·  Амплификация ДНК ВК должна происходить и регистрироваться независимо от присутствия и количества искомой ДНК в реакционной смеси для всего диапазона определяемых концентраций, т. е. ВК не должен быть конкурентным.

·  Эффективность амплификации ВК и исследуемых проб должна быть одинаковой, а ее количество должно соответствовать линейному участку диапазона определяемых концентраций ДНК-мишени.

·  В случае диагностики инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами, в состав ВК должен входить целевой фрагмент специфической РНК, из которой перед проведением ПЦР будет синтезирована кДНК посредством обратной транскрипции. Применение ВК на основе ДНК-конструкций при количественном анализе РНК не позволяет учитывать ее потери за счет повышенной физической и ферментативной деградации, а также контролировать процесс обратной транскрипции.

Положительный контроль

Положительный контроль позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. Для этого используют препарат ДНК, содержащий сайты для отжига праймеров, например, ДНК искомого микроорганизма или клонированные специфические участки его генома.

Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образующихся в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Они могут быть как большего, так и меньшего размеров по сравнению с положительным контролем. В худшем случае их размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.

Для контроля специфичности образуемого продукта амплификации можно использовать гибридизационные зонды, меченные флуоресцентными метками или радиоактивными изотопами и взаимодействующие с ДНК в соответствии с теми же принципами, что и праймеры.

Отрицательный контроль

Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации и исключения учета ложноположительных результатов.

Специальные контроли

Использование специальных контролей при постановке ПЦР позволяет решить ряд задач, в первую очередь, касающихся оценки эффективности процесса амплификации и контроля специфичности полученных результатов, а также дает возможность реализовать подход к количественному анализу ДНК.

Принципиальным моментом является постановка специальных контролей при исследовании сложных многокомпонентных систем, таких как биоценозы, поскольку появляется возможность качественного и количественного анализа взаимодействия компонентов системы и характеристики их отношения к биотопу.

К специальным контролям можно отнести следующее:

·  Маркеры длин фрагментов ДНК

·  Контроль фона

·  Стандарты и калибраторы

Контроль взятия материала (КВМ)

Маркеры длин фрагментов ДНК используются при детекции результатов ПЦР методом гель-электрофореза. Стандарты (маркеры) представляют собой фрагменты двуцепочечной ДНК строго определенной длины, позволяющие идентифицировать и охарактеризовать полосы, полученные в геле, и оценить результаты анализа с точки зрения их специфичности.

Контроль фона

Наиболее актуален при использовании метода гибридизации в процессе амплификации.

Это обусловлено тем, что помимо флуоресценции, возрастающей пропорционально синтезу ампликонов (ПЦР-РВ) или определяющейся после амплификации (FLASH), прибор регистрирует фоновую флуоресценцию, величина которой зависит от: свойств меченых зондов; изменения концентрации отдельных компонентов реакционной смеси в зависимости от серии, режима и продолжительности хранения; используемого пластика; особенностей регистрирующей аппаратуры.

Анализ величины целевого сигнала от ампликонов над фоновой флуоресценцией и шумами в процессе ПЦР-РВ позволяет установить некоторое пороговое значение флуоресценции.

Оно одинаково для всех совместно анализируемых проб, и осуществляется автоматически, не требуя дополнительных манипуляций по приготовлению фоновых образцов.

При проведении же анализа методом FLASH существует необходимость введения отдельных фоновых пробирок.

Стандарты и калибраторы

Наиболее часто используются при осуществлении количественного анализа методом ПЦР. Введение этого типа контролей предполагает построение калибровочного графика в координатах с серией разведений ДНК-стандарта, из которого находят концентрацию субстрата в экспериментальных образцах.

Точность метода зависит от того, насколько условия ПЦР серии стандартов (прежде всего, эффективность амплификации) близки к условиям ПЦР экспериментальных образцов.

В тех случаях, когда требуется оценить «абсолютное» количество субстрата, выбор стандартов для градуировочного графика представляет собой сложную задачу.

Для определения количества матрицы в ПЦР-РВ существуют следующие варианты стандартов:

·  Очищенный продукт ПЦР-РВ.

·  Рекомбинантная ДНК.

·  Рекомбинантная РНК с последующей обратной транскрипцией.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Источник: https://pandia.ru/text/80/229/66258-5.php

Большая Энциклопедия Нефти и Газа

Положительный и отрицательный контроль: Положительный контроль необходим для проверки работы всех компонентов

Cтраница 1

Положительный контроль, который детерминирует специфичность РёРјРјСѓРЅРЅРѕР№ сыворотки Рё флуоресцирующего антиглобулинового конъюгата; Рґ) применение РЅР° первом этапе нефлуоресцирующей РёРјРјСѓРЅРЅРѕР№ сыворотки, соответствующей РїРѕ РІРёРґСѓ ( РІ антигенном отношении) флуоресцирующей антиглобулиновой сыворотке. Положительный контроль – детерминирует специфичность используемого опытного антигена Рё флуоресцирующего антиглобулинового препарата.  [1]

Примером положительного контроля является запасание Рё использование клеткой животного крахмала – гликогена. Клетки животных запасают энергию РІ форме гликогена.  [2]

РџСЂРё положительном контроле мазок сначала обрабатывают РёРјРјСѓРЅРЅРѕР№ сывороткой известной специфичности, обычно диагностической, Р° РЅР° втором этапе той же флуоресцирующей сывороткой.  [3]

Результаты испытания лекарственного препарата СЃ помощью ЛАЛ-теста можно оценивать лишь РІ том случае, РєРѕРіРґР° РІ обеих пробирках СЃ отрицательным контролем реакция отрицательна, Р° РІ обеих пробирках СЃ положительным контролем – положительна.  [4]

Положительный контроль, который детерминирует специфичность РёРјРјСѓРЅРЅРѕР№ сыворотки Рё флуоресцирующего антиглобулинового конъюгата; Рґ) применение РЅР° первом этапе нефлуоресцирующей РёРјРјСѓРЅРЅРѕР№ сыворотки, соответствующей РїРѕ РІРёРґСѓ ( РІ антигенном отношении) флуоресцирующей антиглобулиновой сыворотке. Положительный контроль – детерминирует специфичность используемого опытного антигена Рё флуоресцирующего антиглобулинового препарата.  [5]

Кроме того, параллельно ставят положительный и отрицательный контроли.

Положительным контролем служит заведомо известная иммунная сыворотка, взятая в таком разведении, при котором обнаруживается четкое тушение люминесценции.

Р’ отрицательном РєРѕРЅ – Этроле используется нормальная сыворотка, которая должна быть разведена РІ такой же степени, как Рё исследуемая.  [6]

Одновременно ставят положительный и отрицательный контроль-опыт.

Для проведения положительного контроля РІ РґРІРµ РїСЂРѕР±РёСЂРєРё помещают РїРѕ 0 1 РјР» ЛАЛ-реактива Рё РїРѕ 0 1 РјР» раствора Р РЎРћ эндотоксина концентрации, РІ РґРІР° раза превышающей чувствительность ЛАЛ-реактива. Для отрицательного контроля РІ РґРІРµ РїСЂРѕР±РёСЂРєРё помещают РїРѕ 0 1 РјР» ЛАЛ-реактива Рё РїРѕ 0 1 РјР» РІРѕРґС‹ для ЛАЛ-теста.  [7]

Вышесказанное является описанием первой проанализированной системы.

Этот процесс описывается как отрицательный контроль, поскольку биологическая активность подавляется присутствием специфической молекулы – белка-репрессора.

Р’ настоящее время известны примеры, РєРѕРіРґР° белки осуществляют положительный контроль Рё даже положительный или отрицательный контроль.  [8]

Рабочим титром конъюгата считается такое его разведение, которое РІ случае АБТС дает СЏСЂРєРѕ-зеленое окрашивание СЃ положительным антигеном, тогда как СЃ отрицательным антигеном окрашивание должно быть сопоставимо СЃ окраской субстратной смеси. РџСЂРё этом должно выявляться минимальное количество положительного антигена. РџСЂРё спектрофотометрическом анализе рабочим титром конъюгата Р±Сѓ: дет разведение, дающее РІ положительном контроле 1 5 – 1 2 РѕРїС‚.  [10]

Р’ такой простой петле каждый элемент непосредственно контролируется только элементом, следующим РІ петле сразу выше него, Рё сам обусловливает непосредственный контроль только элемента, ближайшего Рє нему ниже РІ петле. Однако каждый элемент оказывает ( через РІСЃРµ остальные) косвенное влияние РЅР° РІСЃРµ элементы РІ петле, включая самого себя. Что, вероятно, РїСЂСЏРјРѕ РЅРµ очевидно, так это то, что РІ простой петле независимо РѕС‚ числа ее элементов, числа Рё РїРѕСЂСЏРґРєР° положительных Рё отрицательных взаимодействий РІ ней каждый элемент либо обеспечивает положительный контроль над собственным образованием, либо отрицательный котроль над РЅРёРј. Соответственно имеются РґРІР° типа простых цепей управления СЃ петлями обратной СЃРІСЏР·Рё – петли положительной Рё отрицательной обратной СЃРІСЏР·Рё.  [11]

�спытуемый препарат проверяют в ряде последовательных двукратных разведений водой для ЛАЛ-теста. Определение проводят в двух повторностях.

Контроль ингибирования испытуемым препаратом реакции эндотоксина с ЛАЛ-реактивом готовят для каждого разведения и также повторяют дважды.

Отрицательный Рё положительный контроль ставится для всей серии разведений. Р’СЃРµ РїСЂРѕР±РёСЂРєРё инкубируются одновременно.  [12]

Область промотора расположена между г-геном и оператором и выполняет две функции.

Остатки СЃ 53 РїРѕ 84 образуют участок связывания комплекса, образуемого белком катаболитным активатором гена ( РЎРђР ) Рё цикло – РђРњР .

РљРѕРіРґР° бактерия испытывает недостаток РІ продуктах метаболизма, образующихся РёР· глюкозы, уровень содержания цикло – РђРњР  повышается.

Таким образом, положительный контроль проявляет СЃРІРѕРµ влияние путем увеличения частоты, СЃ которой Р РќРљ-полимераза запирает область промотора, РєРѕРіРґР° бактерия становится голодна.  [13]

РћРЅ содержит структурные гены ara Р’, ara Рђ Рё ara D для ферментов, участвующих РІ превращении L-араби-РЅРѕР·С‹ РІ Р’-ксилулозо – 5-фосфат, Экспрессия оперона индуцируется араби-РЅРѕР·РѕР№.

Как и многие другие системы катаболизма, оперон подвергается регуляции в области промотора, с которым связан САР, активированный циклическим AMP.

С оператором связан регу-ляторный белок, кодируемый геном ara С. Этот белок действует как репрессор-присоединяясь к оператору, он препятствует транскрипции.

Однако в присутствии арабинозы он становится активатором-присоединяется к промотору и делает возможной транскрипцию.

Таким образом, арабинозный оперон находится РїРѕРґ влиянием как отрицательного, так Рё положительного контроля СЃРѕ стороны специфического белка-регулятора.  [14]

Определение титров.  [15]

Страницы:      1    2

Источник: https://www.ngpedia.ru/id107225p1.html

Разница между положительным и отрицательным контролем

Положительный и отрицательный контроль: Положительный контроль необходим для проверки работы всех компонентов

Научный контроль – это методология, которая проверяет целостность в экспериментах, выделяя переменные в соответствии с научным методом, чтобы сделать вывод о таких переменных. Его можно определить как эксперимент, предназначенный для минимизации влияния переменных, отличных от независимых переменных.

(Вещи, которые меняются в эксперименте, называются переменными). Эксперимент можно контролировать положительно или отрицательно.

Основное различие между положительным и отрицательным контролем заключается в том, что положительный контроль дает ответ на эксперимент, тогда как отрицательный контроль не дает никакого ответа.

Ключевые области покрыты

1. Что такое положительный контроль
– Определение, Процесс, Использование
2. Что такое отрицательный контроль
– Определение, Процесс
3. В чем разница между положительным и отрицательным контролем
– Сравнение основных различий

Ключевые термины: анализ, контроль, эксперимент, отрицательный контроль, положительный контроль

Что такое положительный контроль

Положительный контроль – это экспериментальный контроль, который дает положительный результат в конце эксперимента. Этот тип теста всегда дает результат как «да». Это хороший показатель, чтобы знать, работает ли тест. Следовательно, положительный контроль используется для оценки достоверности теста.

Положительный контроль не подвергался экспериментальному тесту; это делается параллельно с этим. Положительный контроль используется для получения ожидаемого результата. Этот положительный результат обеспечивает успех теста.

После получения положительного результата тест можно использовать для экспериментального лечения.

Если положительный контроль не дает ожидаемого результата, его следует делать снова и снова (изменяя различные параметры) до получения положительного результата.

Рисунок 1: ELISA эксперимент – Ферментный сбор

Есть много применений положительного контроля в биохимических экспериментах.

  • Чтобы обнаружить болезнь
  • Наблюдать за ростом микроорганизмов
  • Для измерения количества ферментов, присутствующих после проведения ферментного анализа (в положительном контроле количество фермента после очистки должно быть известным количеством)

Что такое отрицательный контроль

Отрицательный контроль – это экспериментальный контроль, который не дает ответа на тест. Отрицательный контроль также не подвергается экспериментальному тесту напрямую. Это делается параллельно эксперименту как контрольный эксперимент.

Отрицательный контроль используется для подтверждения отсутствия реакции на реагент или микроорганизм (или любой другой параметр), использованный в тесте.

Чтобы получить хороший результат от отрицательного контроля, следует убедиться, что нет чистого ответа на тест. Следовательно, отрицательный контроль полезен при выявлении внешних воздействий на эксперимент.

Например, влияние загрязнителей на эксперимент может быть указано.

Определение

Положительный контроль: Положительный контроль – это экспериментальный контроль, который дает положительный результат в конце эксперимента.

Отрицательный контроль: Отрицательный контроль – это экспериментальный контроль, который не дает ответа на тест.

Результат

Положительный контроль: Положительный контроль дает положительный результат

Отрицательный контроль: Отрицательный контроль дает отрицательный результат.

отклик

Положительный контроль: Положительный контроль дает ответ на эксперимент.

Отрицательный контроль: Отрицательный контроль не дает никакого ответа.

результат

Положительный контроль: Положительный контроль обеспечивает успех теста.

Отрицательный контроль: Отрицательный контроль используется, чтобы гарантировать отсутствие ответа на тест.

Пользы

Положительный контроль: Положительный контроль используется для проверки достоверности эксперимента.

Отрицательный контроль: Отрицательный контроль используется для выявления влияния внешних факторов на тест.

Заключение

Положительный контроль и отрицательный контроль – это два типа тестов, которые дают совершенно противоположные ответы в эксперименте. Основное различие между положительным и отрицательным контролем заключается в том, что положительный контроль дает ответ на эксперимент, тогда как отрицательный контроль не дает никакого ответа.

Ссылка:

1. «Научный контроль». Бюллетень Тити Тудоранца,

Источник: https://ru.strephonsays.com/difference-between-positive-and-negative-control

Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста. Оценка результатов иммуногистохимической реакции

Положительный и отрицательный контроль: Положительный контроль необходим для проверки работы всех компонентов

Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста

Бабиченко И.И., Ковязин В.А.
Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с.

Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов

Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление “Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий”

ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции

ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации

Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза

ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом

ЛИТЕРАТУРА [показать]

  1. Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305.
  2. Георгиев Г.П.

    Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7.

  3. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с.
  4. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm).

  5. Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525.
  6. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с.
  7. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х.

    , Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10.

  8. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5.

    – C. 169-175.

  9. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8.
  10. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22.
  11. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн.

    Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14.

  12. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25.
  13. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С.

    Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с.

  14. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с.
  15. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. “Итоги науки и техники” ВИНИТИ, серия “Морфология”. – 1991. – вып. 15. – 115 с.
  16. Франк Г.А.

    Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236.

  17. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом “Династия”, 2004. – 88 с.
  18. Хансон К.П., Имянитов Е.Н.

    Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169.

  19. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13.
  20. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P.

    200-202.

  21. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60.
  22. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p.
  23. De Miguel M.P., Royuela M.

    , Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727.

  24. Graham R.C., Karnovsky M.J.

    The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302.

  25. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P.

    1131-1139.

  26. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139.
  27. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220.
  28. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R.

    Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257.

  29. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P.

    801-807.

  30. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293.
  31. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30.
  32. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P.

    205-262.

  33. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929.
  34. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p.
  35. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M.

    , Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110.

  36. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry.

    John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169.

  37. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml).
  38. Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M.

    Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751.

  39. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204.

ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ

Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции

При использовании различных методов визуализации антигенов должно получиться интенсивное четко выявляемое окрашивание тканевых антигенов в исследуемом образце и позитивном контроле.

Окрашивание негативного контроля также необходимо принимать во внимание при оценке специфичного расположения исследуемых антигенов.

Интерпретация полученных результатов ИГХ реакции включает такие термины, как “выраженная позитивная реакция”, “ложно-позитивная реакция”, “негативная реакция”, “ложно-негативное окрашивание”.

Негативную реакцию сложно интерпретировать, в отличие от позитивной, для этого необходимо провести контрольные исследования с различными дополнительными антителами.

Так, при выявлении гистогенеза недифференцированной злокачественной опухоли на предмет рак это или лимфома, отрицательной реакции с антителами на кератин (промежуточный филамент, выявляемый в большинстве раков) недостаточно для постановки диагноза лимфомы.

Необходимо провести дополнительное исследование и получить положительное окрашивание опухолевых клеток на общий лимфоцитарный антиген (белок, характерный для большинства лимфом).

Контроль иммуногистохимической реакции

При любом иммуногистохимическом исследовании необходимо использовать различные контрольные тесты для оценки адекватности методической процедуры.

Для подобных процедур исследуют стекла с тканью положительного и негативного контроля для того, чтобы убедиться в том, что 1) система визуализации работает адекватно, 2) положительное или негативное окрашивание является специфичным, 3) полностью соблюдена методическая последовательность.

Контроль ИГХ реакции означает оценку специфичности взаимодействия антител с тканевыми антигенами. С этой целью используют отрицательный и положительный контроль.

Отрицательный контроль.

  • Для отрицательного контроля берут срезы тканей, в которых заведомо нет искомого антигена. Результаты реакции должны быть отрицательными.
  • При проведении ИГХ реакции исключают инкубацию с первичными антителами, заменяя их неиммунной сывороткой. Результаты реакции должны быть отрицательными.
  • Антитела (в максимальном разведении) предварительно адсорбируют специфическим антигеном (0,1-10 нмоль/ мл), затем их наносят на срезы в качестве контроля. Результаты реакции должны быть отрицательными. После адсорбции специфическим антигеном антитела должны терять способность окрашивать ткань.

    Подобный контроль необходимо ставить с каждой новой антисывороткой и при обнаружении новых участков взаимодействия антител с тканью.

Положительный контроль.

В любом опыте важно иметь положительный контроль – окрашивать ткань, заведомо содержащую исследуемые антигены, для того чтобы убедиться, что все антитела работают нормально. В качестве положительного контроля служат срезы тканей, в которых исследуемый антиген заведомо присутствует. Результаты реакции должны быть положительными.

Возможные проблемы, возникающие при проведении ИГХ реакции

Если наблюдается сильное фоновое окрашивание, то необходимо:

  • до нанесения первичных антител провести блокирование нормальной сывороткой животного, донора вторичных антител, либо использовать готовые антитела для блокирования мест неспецифического связывания антител, значительно снижающие фоновую неспецифическую окраску срезов;
  • использовать более высокие разведения первичных и/или вторичных антител. В результате разведения абсолютное количество загрязненных антител падает, в то время как количество специфических антител остается достаточным для визуализации антигенов;
  • возможно, во время инкубации с сыворотками срезы подсохли;
  • уменьшить время инкубирования первичных антител;
  • снизить температуру при инкубации первичных антител;
  • уменьшить время инкубации субстрата;
  • более тщательно промывать срезы после инкубации с антителами;
  • провести адсорбцию первичных и вторичных антител альбумином. Неспецифическое связывание иммуноглобулинов с компонентами ткани за счет гидрофобных или электростатических взаимодействий можно предотвратить путем адсорбции антисыворотки альбуминами животного, ткань которого предстоит окрашивать. При этом блокируются большинство участков неспецифического связывания, но образующиеся связи слабее, чем связь антигенантитело и не мешают взаимодействовать специфическим антителам с антигеном. К рабочему раствору антител можно также добавить нормальную сыворотку до концентрации 1%;
  • внести в буфер, используемый для промывки, детергент (0,2% тритон Х-100) для снижения неспецифического связывания белка;
  • попытаться дополнительно заблокировать эндогенную пероксидазу например 3% или 6% раствором перекиси водорода, нитроферрицианидом натрия или смесью периодат-борогидрид;
  • ткани обладают эндогенной биотиновой активностью. Необходимо провести блокирование эндогенной биотиновой активности, используя авидин-биотин блокирующие реагенты до нанесения первичных антител;
  • антитела и исследуемая ткань принадлежат к одному виду животных. Мышиные антитела используются для выявления антигенов в тканях мыши;
  • удалить комплемент из препарата первичных антител, прогревая антисыворотку 30 мин при 56 °C.

Возможные причины слабого окрашивания всех срезов:

  • неадекватная фиксация ткани.

    Необходимо сделать криостатные срезы замороженной нефиксированной ткани, фиксировать их в различных фиксаторах, затем проводить ИГХ реакцию;

  • ошибки при осуществлении демаскирования антигенов;
  • антиген был разрушен до инкубации с первичной сывороткой.

    Следует провести блокирование эндогенной пероксидазной активности после проведения реакции с первичными антителами;

  • низкая концентрация первичных или вторичных антител.

    Для подбора оптимальной концентрации антител необходимо провести пробную ИГХ реакцию с их различными разведениями;

  • ошибки или пропуск одной из процедур иммунохимического окрашивания. Возможно использование вторичных антител, которые специфически не взаимодействуют с первичными.

    Если используются первичные мышиные антитела, необходимо применить вторичные антимышиные антитела;

  • слишком короткое время инкубации с первичными антителами;
  • слишком низкая температура при инкубации с первичными антителами;
  • старый субстрат.

    Свежий субстрат как правило представляет светло розовый раствор, появление коричневой окраски свидетельствует о том, что субстрат – старый;

  • слишком интенсивное смывание реагентов буфером привело к разведению реагентов;
  • несовместимость реагентов докрашивания или заключения срезов с продуктами реакции;
  • неполная депарафинизация срезов. Необходимо продлить время депарафинизации срезов, либо заменить ксилол;
  • антитела не работают из-за неправильного их хранения. Хранить антитела желательно в замороженном состоянии в небольших объемах при температуре минус 20 °C – минус 70 °C, избегая повторного замораживания и оттаивания антител.

Причины окрашивания только срезов с положительным контролем, в то время как исследуемая ткань не окрасилась, могут быть следующие:

  • в исследуемой ткани нет искомого антигена или его концентрация незначительна.

    Необходимо увеличить время инкубации первичных антител;

  • неадекватная обработка исследуемой ткани, вызвавшая денатурацию исследуемых антигенов;
  • образцы слишком долго фиксировались в формалине.

    В результате произошло маскирование антигена за счет кросс-связывания альдегидов и увеличения гидрофобности ткани.

    Возможно, для демаскирования антигена необходимо провести дополнительное нагревание срезов в микроволновой печи или обработку ферментом;

  • иммунореактивность уменьшилась или повредилась во время обработки тканей при высокой температуре. Не следует нагревать образцы выше 60 °C.

Срезы слетают с предметных стекол:

  • исключить детергенты из буфера для промывания срезов;
  • прогреть парафиновые срезы в термостате в течение 2 суток при температуре 37 °C;
  • нарушена морфология исследуемой ткани;
  • плохая фиксация ткани;
  • ткань повреждена из-за высокой концентрации или длительной обработкой детергентами (Triton X-100).

Источник: http://bono-esse.ru/blizzard/Lab/Onko/igh_3.html

Medic-studio
Добавить комментарий