Поверхностное культивирование микроорганизмов: Процесс культивирования продуцента начинается с момента засева

Поверхностное культивирование

Поверхностное культивирование микроорганизмов: Процесс культивирования продуцента начинается с момента засева

Культивирование микроорганизмов на твердых питательных средах -поверхностное культивирование) приблизительно можно представить в виде следующей последовательности технологических операций.

Предварительно простерилизованный и измельченный твердый питательный субстрат засевается выращенной в отделении «чистой культуры» заводской лаборатории культурой соответствующего микроорганизма. Далее среду с посевным материалом направляют в раздаточное устройство где с помощью механических дозаторов осуществляется загрузка кювет (лотков) для выращивания.

Перед загрузкой кюветы тщательно моют и стерилизуют острым паром. Загруженные кюветы помещают в специальные растительные камеры, где для нормального роста культур микроорганизмов поддерживаются соответствующие условия.

В качестве субстратов, используемых для культивирования микроорганизмов на твердых питательных средах, применяют, как правило, нестандартное сырье – различные отходы пищевой промышленности.

Среди них наиболее часто используют пшеничные отруби, свекловичный жом, проросшие ячменные зерна (солод), шелуха от некоторых сельско- хозяйственных культур (риса, гречихи, подсолнуха). В качестве разрыхлителя субстрата часто используют древесные опилки.

Все эти виды субстратов отличает низкое содержание азотсодержащих веществ, поэтому в качестве добавок к ним добавляют такие азотсодержащие соли, как сульфат аммония и различные добавки микроэлементов и ростовых факторов.

Перед использованием готовый субстрат подвергают тщательной стерили-зации, чтобы обеспечить максимально возможное подавление посторонней микрофлоры. Микробиологический контроль при этом обычно ведут по наличию спор бактерий, так как именно они наиболее устойчивы к различным методам стерилизации. Наиболее часто стерилизацию проводят обработкой острым паром (более 120 С).

Однако это часто приводит к комкованию среды, что резко ухудшает процесс стерилизации таких комков на всю глубину, и кроме того, этот процесс является весьма длительным, энерго- и материалоемким.

Поэтому на ряде производств в последнее время стали использовать для стерилизации принципиально другие методы, например уничтожение микроорганизмов γ– или рентгеновскими лучами.

Выращенный в отделении «чистой» культуры посевной материал перед засевом подвергают микробиологическому и биохимическому контролю на отсутствие посторонней микрофлоры и соответствие его паспортным технологическим данным.

Посевной материал считается пригодным для засева основных аппаратов, если он обеспечивает при нормальной длительности культивирования на производственной среде необходимое по паспорту накопление целевого продукта или нужную ферментативную активность.

Поскольку практически все продуценты культивируемые поверх- ностным способом являются аэробами, то им для дыхания необходим интенсивный подвод воздуха.

Очистка используемого воздуха и его стерилизация осуществляется с использованием волокнистых фильтрах. Перед растительными камерами всегда устанавливают кондиционеры для поддержания необходимой температуры и влажности. В связи с использованием воздуха в качестве теплоносителя расход его достигает значительной величины.

Поэтому практически любая технологическая схема подготовки и циркуляции воздушного потока предусматривает его рецикл, в котором участвует до 90% воздуха.

При этом циркулирующий воздух проходит через воздухоохладитель, а часть отработанного воздуха очищается на фильтрах от пыли и микробных клеток, а затем выбрасывается в атмосферу.

Проблема регулирования теплообмена в процессе культивирования имеет не менее важное значение, чем обеспечение подвода воздуха. В ходе своего роста большинство культур выделяют значительное количество тепла.

В то же время известно, что уже при температуре 38-40 С наступает угнетение вегетативного развития многих культур, а при 43-45 С может происходить полная инактивация их ферментных систем. Проблема усложняется тем, что выделение тепла в течение всего периода культивирования происходит неравномерно.

В начале культивирования выделение тепла обычно в 10-20 раз больше чем в конце процесса. Поэтому необходим постоянный контроль за температурой внутри ростовой камеры и эффективный отвод избыточного тепла.

Решение проблемы теплообмена существенно упрощается благодаря тому, что так же неравномерно в ходе культивирования происходит и потребление кислорода (воздуха), при этом максимум потребления кислорода совпадает с максимумом тепловыделения.

В конце культивирования потребление кислорода становится минимальным, одновременно уменьшается и выделение тепла. Это позволяет использовать холодный воздух, подаваемый в ферментер для съема и отвода выделяющегося в ходе культивирования тепла.

В процессе культивирования наблюдается непрерывное снижение влаги в твердом субстрате. В начале процесса влажность питательной среды достигает 58-60%, к моменту окончания процесса эта величина может снизиться до уровня 30%.

Это отрицательно сказывается на развитии микроорганизма и как следствие на выходе целевого продукта.

Поэтому для производственных условий важно в течении всего времени культивирования поддерживать величину влагосодержания на уровне не ниже 55-50%, что достигается предварительным увлажнением (кондиционированием) воздуха, подаваемого в растительные камеры..

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/4_8332_poverhnostnoe-kultivirovanie.html

Поверхностный метод культивирования продуцентов ферментов

Поверхностное культивирование микроорганизмов: Процесс культивирования продуцента начинается с момента засева

Приповерхностном методе культура растетна поверхности твердой увлажненнойпитательной среды.

Мицелий полностьюобволакивает и довольно прочно скрепляеттвердые частицы, клетки получают питаниеза счет содержащихся в этих средахвеществ и используют для дыхания кислородвоздуха, поэтому для их нормальногообеспечения кислородом приходитсяприменять рыхлые по своей структуресреды с очень небольшой высотой слоя.Это приводит к необходимости иметьбольшую поверхность контакта рыхлойсреды с воздухом и при отсутствиимеханизации придает всему процессунеинтенсивный характер, требует большихзатрат ручного труда.

Так,например, для завода, вырабатывающего1 т поверхностной культуры плесневыхгрибов на пшеничных отрубях, придвухсуточном росте требуется более1000 отдельных кювет, на которых тонкимслоем раскладывается засеянная конидиямигриба питательная среда. Мойка,стерилизация, перемещение кювет внутрицеха, их заполнение и освобождениесоставляют ту основную трудность,которая характерна для данного метода.

Выращиваниепроизводственной культуры происходитобычно в неасептических условиях, однакокак сама среда, так и кюветы первоначальнодолжны быть надежно стерилизованы. Этотребование является безусловным, крометого, перед каждой новой загрузкойдолжны дезинфицироваться растильныекамеры, а также все мелкое оборудованиеи инвентарь.

Поверхностныйметод имеет и преимущества, самое главноеиз них — значительно более высокаяконечная концентрация фермента наединицу массы среды.

Например, дляосахаривания 100 кг крахмала в спиртовомпроизводстве требуется 5 кг поверхностнойкультуры плесневых грибов или около100 кг культуральной жидкости.

Поверхностныекультуры можно быстро и относительнолегко высушить, их легко перевести втоварную форму и транспортировать, еслине требуется дополнитель­ной очисткифермента. Положительной сторонойповерхностного метода является такжеменьшая потребность в электроэнергиипо сравнению с глубинным методом.

Нарис. 6 приведена принципиальнаятехнологическая схема поверхностногометода выращивания.[2]

Посевнойматериал.

Дляповерхностного метода производства онможет быть подготовлен в виде культуры,выращенной на твердой питательнойсреде, спорового материала или мицелиальноймассы продуцента, выращенной глубиннымметодом. Посевную культуру получаютвыращиванием микроорганизмов во всевозрастающем количестве в три или четыреэтапа.

Исходнуюмузейную культуру продуцента, находящуюсяна твердой агаризованной среде, пересеваютсначала на 1 —1,5 г увлажненных стерильныхпшеничных отрубей в пробирку.

Выращиваниепроводят в термостате до обильногоспорообразования.Второй этап осуществляют на той же средеи при тех же условиях, но в колбах,содержащих до 100 г рыхлой среды.

Аналогичени третий этап, но здесь выращиваниепроводится в сосудах с 500 г среды.

Напоследнем, четвертом этапе выращиваниеведут на посев­ных кюветах, еслиматериал нужен в виде культуры, илиотделяют конидий от основной массымицелия и субстрата на специальномвибросепараторе, если необходимы споры,или, наконец, в инокуляторе объемом 8—10л на жидкой питательной среде, еслиинокулят нужен в виде мицелиальноймассы.

Можнопродлить срок хранения посевногоматериала, если спороносящую культуруподсушить до влажности 10—12%, отделенныеконидии поместить в герметичную тару,а мицелиальную массу охладить до 4—6°С.

Приготовлениепитательных сред.

Основойпочти каждой твердой среды являютсяпшеничные отруби как источник необходимыхпитательных и ростовых веществ. Вувлажненном состоянии отруби создаюттребуемую структуру среды.

Для повышенияактивности некоторых ферментов к отрубямдобав­ляют свекловичный жом какматериал, богатый пектином ицеллюлозой,соевый шрот для повышения содержаниябелков и индукции протеазы, соевую мукуили другие включающие жиры материалыдля индукции липазы, пивную дробину,обогащенную крахмалом, для стимулированиябиосинтеза амилолитического комплексаи др.

Дополнительноевведение в отруби растительных отходов— овсяной или рисовой шелухи, соломы,кукурузных кочерыжек и древесных опилок— может улучшить структуру среды,особенно в случае мелких отрубей. Этиотходы вряд ли выполняют роль индукторов,так как большая часть веществ в нихнаходится в нерастворимом состоянии илигнифицирована.

Улучшая структуру иоблегчая доступ воздуха, такие материалыобедняют среду и понижают активностьполучающихся ферментов.

Устранить этовлияние можно прибавлением источниковминерального азота и фосфора, а такжематериалов, богатых ценными органическимивеществами, например солодовыми ростками,упаренным картофельным соком, кукурузнымэкстрак­том и др.

Таким образом, каки при глубинном методе, изменяя составсреды, учитывая физиологическиеособенности продуцента и индуцибельностьсинтезируемых им ферментов, удается визвестных пределах управлять процессомкультивирования.

Источник: https://studfile.net/preview/5193834/page:4/

4. Способы культивирования микроорганизмов

Поверхностное культивирование микроорганизмов: Процесс культивирования продуцента начинается с момента засева

Ферментация(культивирование)– это вся совокупность последовательныхопераций от внесения в заранееприготовленную и термостатированнуюпитательную среду посевного материала(инокулята) до завершения процессовроста и биосинтеза вследствие исчерпыванияпитательных веществ среды.

Известномножество процессов культивированиямикроорганизмов. Они различаются:

1.посодержанию кислорода– на аэробныеи анаэробные;

2.поколичеству ферментеров– на одно-,дву- и многостадийные;

3.поналичию или отсутствию перемешивания– на динамическиеи статические;

4.посостоянию питательной среды– на поверхностные и глубинные.

При поверхностномкультивировании посевной материалвысевают на поверхность питательнойсреды, распределенной небольшим слоем(около 10 см) в металлических кюветах.

Приглубинномкультивировании погружение клетокмикроорганизмов осуществляют за счетпостоянного перемешивания в течениевсего процесса ферментации. Глубинныйспособ является более выгодным дляпромышленности по сравнению с поверхностнымспособом, так как позволяет осуществлятьполную механизацию и автоматизациюпроцесса, избегать инфицированиятехнологического процесса постороннеймикрофлорой.

Классификацияпроцессов культивирования микроорганизмовпо способу действия (периодический,непрерывный и промежуточные) представленана рис. 2.

1.При периодическомспособе культивирования стерильнаяпитательная среда засевается исходнойкультурой продуцента, и далее в этой жеемкости микроорганизмы при определенныхусловиях проходят через все стадиироста и развития популяции (кривые ростакультуры мы рассмотрели ранее в п.1.).

Когда процесс культивированиязаканчивается, емкость для выращиванияосвобождают, и цикл возобновляется,начиная от засева питательной средыисходной культурой продуцента.

Притаком способе культивирования (егоможно назвать «закрытой» системой,когда хотя бы один из компонентов неможет поступать в нее или выводитьсяиз нее) скорость роста биомассы всегда должна стремиться к нулю либо из-за недостатка питательных веществ, либоиз-за накопления в среде токсическихметаболитов.

Ранееприменялось культивирование наповерхностиплотныхпитательных средв пробирках, колбах, матрасах, бутылях.Выращиваемая в этих условиях культурагетерогенна (разнородна) в физиологическомотношении, так как клетки на различныхучастках поверхности и в разных слояхнаходятся в различных условиях иразвиваются неодинаково. Этот способиногда применяется для наращиваниябиомассы.

Внастоящее время в промышленностииспользуют жидкиепитательные среды,применение которых позволило избежатьнедостатков плотных питательных среди увеличило выход процесса за счетиспользования больших емкостей длякультивирования (ферментеров).

Применениежидких питательных сред потребовалоперемешивания культуры с цельювыравнивания условий роста микробов вразных частях рабочего сосуда иаэрирования (насыщения кислородом). Дляэтого используются мешалки,качалки,бутыли с барботажемгаза.

Периодическийспособ выращивания микроорганизмовиспользуется для получения посевногоматериала на некоторых этапах, а такжепри микробиологическом производствеаминокислот, в производстве вакцин ит.д.

2.Промежуточныеспособы культивирования.

2.1.Продленныйпериодическийпроцесс, как и периодический, предусматриваетодноразовую загрузку и разгрузкуферментера.

Однако цикл развитиямикроорганизмов в продленном периодическомпроцессе удлиняется либо за счет подпитки(периодического или непрерывногодобавления питательной среды), либо засчет длительного удержания клеток всистеме (диализнаякультура). В этом случае продлеваетсяэкспоненциальная фаза и фаза линейногороста.

Суть процесса диализ заключаетсяв том, что культура развивается впространстве, ограниченном полупроницаемоймембраной, а продукты метаболизмадиффундируют во внешний раствор. Наиболеепростой диализный метод – культивированиев целлофановых мешках, погруженных впитательную среду.

2.2.Многоциклическимипроцессами культивирования называюттакие, в которых цикл выращиваниякультуры повторяется многократно безмногократной стерилизации емкости.Многоциклическое культивирование можетбыть различным.

Его можно вести в одномферментере, многократно повторяя полныйцикл развития культуры без перерыва настерилизацию. Способы, осуществляемыев одном ферментере, называют одностадийными.

Возможны и многостадийныемногоциклические процессы, основанныена принципе повторного и последовательногопериодического культивирования,протекающего в нескольких ферментерах,соединенных в батарею, с целью длительногоиспользования культуры.

Один из вариантовтакого способа заключается в следующем:культура выращивается в одном биореактореи в то время, когда она проходит в своемразвитии экспоненциальную фазу, из нееберется инокулят (посевной материал)для засева следующего реактора. В первомреакторе культура доращивается донеобходимой фазы роста.

Когда культураво втором реакторе достигаетэкспоненциальной фазы, из нее такжеделается пересев в третий реактор ит.д. Поскольку культура все времяпересевается в экспоненциальной фазе,не происходит ее старения и вырождения.Кроме того, отмечается выигрыш вовремени, так как одновременно работаютнесколько ферментеров.

Многоциклическиепроцессы культивирования микроорганизмовприменяют как для получения биомассы,так и для производства продуктовмикробного синтеза – антибиотиков,внеклеточных ферментов, аминокислот.Применение данного способа позволяетв несколько раз сократить затраты трудана производство продукта по сравнениюс периодическим способом.

2.3.

В полунепрерывныхсистемах полная загрузка и разгрузкаферментера осуществляются однократно,однако в процессе роста культуры частькультуральной жидкости сливается, аосвободившийся объем заливается свежейпитательной средой. Таким образомфункционирует сливно-доливнаясистема.Различные варианты полунепрерывныхсистем используются в производстведрожжей, водорослей, антибиотиков илимонной кислоты.

3.При непрерывномспособе культивирования микроорганизмыпостоянно получают приток свежейстерильной питательной среды, а изаппарата непрерывно отбирается биомассавместе с образуемыми метаболитами(такой способ культивирования можноназвать «открытой» системой).

Принепрерывном культивировании микроорганизмыне должны испытывать недостатка впитательном субстрате, так как скоростьего притока сбалансирована со скоростьювыхода биомассы. Кроме того, культуране отравляется продуктами обмена веществ– в этом большое преимущество непрерывногоспособа культивирования по сравнениюс периодическим, преимущество «открытой»системы по сравнению с «закрытой».

Непрерывная ферментация может проходитьв гомогенной системе идеального смешения,системе полного вытеснения и ли системетвердожидкостного типа.

3.1.Гомогенныесистемы идеального смешения.

В системе идеального смешениямикроорганизмы растут в культуральнойсреде, постоянной по своему составу, и,следовательно, в каждый данный моментвремени находятся в одном и том жефизиологическом состоянии, то есть всостоянии установившегося динамическогоравновесия. По количеству ферментеровгомогенные системы могут бытьодностадийными, двухстадийными имногостадийными.

Дляполучения высоких концентраций биомассыиспользуют одностадийныесистемы свозвратом клеток, в которых клетки,отделенные от культуральной жидкостис помощью насоса, возвращают обратно вферментер.

Возврат клеток (рециркуляция)имеет важное значение в тех процессах,в которых за время пребывания в ферментереклетки не успевают реализовать своипотенциальные возможности в отношениисинтеза целевого продукта.

Многостадийныесистемысостоят из ряда последовательносоединенных ферментеров – батареи.Применение многостадийных системпозволяет получать культуру при любойскорости роста – от лаг-фазы доэкспоненциальной и стационарной.Многостадийное культивированиеприменяется при получении молочнойкислоты, этилового спирта.

Основнымаппаратом для выращивания непрерывнойгомогенной системы является ферментеридеального смешения с устройством дляпотока среды и слива культуры,поддерживающим постоянный уровеньсреды. Такой процесс называютнепрерывно-проточным, обеспечивающимодинаковую концентрацию всех продуктоввнутри ферментера и в вытекающейжидкости.

Непрерывно-проточноекультивирование дает возможностьподдерживать постоянные условия ростамикроорганизмов за счет лимитирования(ограничения) какого-то одного факторасреды.

В случае, когда лимитирующим ростфактором является химический составпитательной среды, процесс называютхемостатнымкультивированием.

В хемостате (ферментере,где протекает хемостатное культивирование)скорость разбавления питательной средыявляется постоянной в соответствии сзаданной плотностью популяции. Изменяяскорость разбавления, можно получатьрежимы, обеспечивающие различнуюскорость роста.

Другойпринцип управления процессом –турбидостат.В нем подача питательной средыосуществляется по команде фотоэлектрическогоэлемента, регистрирующего оптическуюплотность культуры в ферментере. Скоростьразбавления устанавливается автоматическив соответствии с заданной плотностьюпопуляции.

Хотятеоретически взаимосвязь междуконцентрацией биомассы и скоростьразбавления подчиняется одним и тем жезакономерностям в хемостате и турбидостате,методы управления процессами различны.

3.2.Системыкультивирования полного вытеснения.Открытая система полного вытесненияотличается от системы идеальногосмешения тем, что культура в ней неперемешивается, а представляет собойпоток жидкости через трубку. Наиболеераспространенным аппаратом длякультивирования в данном случае являетсятрубчатыйферментер.

Он может иметь различную форму (прямую,S-образную,спиральную) и устанавливается горизонтальноили вертикально. Система полноговытеснения представляет собойпространственный, проточный вариантпериодической культуры.

Такая культураза время посева до выгрузки проходитчерез все стадии периодической культуры,то есть фазы роста распределены не вовремени, а в пространстве, причем каждойчасти ферментера в установившемсярежиме соответствует определенныйотрезок кривой роста. Этот способкультивирования используется дляанаэробных процессов.

Посев осуществляетсянепрерывно на входе в ферментеродновременно с подачей среды. Этотпринцип может использоваться на стадииброжения при производстве пива.

3.3.Системытвердожидкостного типа.К системам твердожидкостного типаотносят многофазные системы, в которыхкультура растет на границе разных фаз:жидкость – твердая фаза – газ. В этихсистемах клетки удерживаются путемприлипания к твердой основе – наполнителюи размножаются на нем, образуя пленкубиомассы. Типичным примером являетсяпроизводство уксуса в стружечныхаппаратах.

Вданной системе лимитирующим факторомдля аэробных микробов являются кислороди субстрат (питательные вещества).

Втонких пленках каждая из прикрепленныхв поверхности клеток полностью обеспеченаэтими веществами и способна расти иразмножаться с максимальной экспоненциальнойскоростью.

По мере того, как клеткиобразуют более толстую пленку биомассы,рост их ограничивается (верхним слоямне хватает кислорода, нижним – питательныхвеществ).

Культивированиемикроорганизмов, образующих пленку избиомассы, осуществляется в ферментеретипа колонкис наполнителем.

В качестве наполнителя может использоватьсямакроноситель (кокс, прутья, стружка,стеклянные шарики и т.д.) и микроноситель(амберлитовые смолы, частички сефадексаи т.д.).

Клетки, культивируемые такимобразом, называют иммобилизованными.Использование иммобилизованных клетокимеет несколько преимуществ.

Во-первых,появляется возможность длительнойэксплуатации клеток в случае непрерывнойферментации.

Во-вторых,известны примеры повышения устойчивостиклеток к действию различных неблагоприятныхвнешних факторов (температуры, кислотности,концентрации токсичных веществ и других)в результате иммобилизации.

В-третьих,существенно упрощаются процедурывыделения используемых клеток икультуральной жидкости, содержащейцелевой продукт.

В-четвертых,благодаря применению иммобилизацииобычно снижаются энергозатраты напроцесс в целом: за счет уменьшения (аследовательно, и удешевления) размеровприменяемых ферментеров; а также засчет упрощения процедур выделения иочистки конечного продукта.

Впромышленной микробиологии системытвердожидкостного типа нашли применениепри очистке сточных вод, в производствеорганических растворителей и кислот ит.д.

Источник: https://studfile.net/preview/3218013/page:3/

Medic-studio
Добавить комментарий