ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №3 Тема: Выделение ДНК на сорбент из крови

Выделение днк

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №3 Тема: Выделение ДНК на сорбент из крови

Выделение днк

Пространственная модель строения молекулы ДНК.

Свойства ДНК 1. ДНК хорошо растворима в воде (лучше всего процесс растворения происходит в слабощелочных средах) и слаборастворима в растворах с высоким процентным содержанием спиртов. 2.

Цепочки в молекуле ДНК соединены водородными связями по принципу комплементарности – нековалентные водородные связи характеризуются непрочностью , легко разрываются – процесс денатурации, и восстанавливаются – процесс ренатурации. 3.

Денатурация молекул ДНК происходит под воздействием температур в диапазоне 80 -90 0 С, в щелочных и сильнокислых средах, в присутствии формамида и мочевины.

Соединение по принципу комплементарности в молекуле ДНК

В клетке молекула ДНК находится в структуре хроматина (комплексная структура: ДНК + гистоновые белки, связь осуществляется за счет щелочных аминокислот молекул гистоновых белков и кислотных остатков сахарофосфатного остова ДНК)

Комплекс ДНК и гистоновых белков Хромосомы эукариот имеют сложное строение. Основу хромосомы составляет линейная (не замкнутая в кольцо) макромолекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) значительной длины (например, в молекулах ДНК хромосом человека насчитывается от 50 до 245 миллионов пар азотистых оснований).

В растянутом виде длина хромосомы человека может достигать 5 см. Помимо неё, в состав хромосомы входят пять специализированных белков – H 1, H 2 A, H 2 B, H 3 и H 4 (так называемые гистоны) и ряд негистоновых белков.

Последовательность аминокислот гистонов высококонсервативна и практически не различается в самых разных группах организмов.

В процессе хранения выделенной ДНК разрушаются фосфодиэфирные связи – под воздействием ионов тяжелых металлов, свободных радикалов, эндонуклеаз. Как следствие – наблюдается деградация ДНК. В буфере (ТЕ-буфер) выделенная ДНК хранится значительно лучше, чем в дистиллированной воде.

ДНК в биологических материалах Жидкая кровь – 20000 -40000 нг/мл Пятна крови – 250 -500 нг/см 2 Жидкая сперма – 150000 -300000 нг/мл Тампон с содержимым влагалища – 10 -300 нг Вырванный волос – 1 -750 нг Выпавший волос – 1 -10 нг Жидкая слюна – 1000 -10000 нг/мл Моча – 1 -20 нг/мл Кость – 3 -10 нг/мг Мягкие ткани – 50 -500 нг/мг

Работа с биологическими объектами на этапе осмотра объектов и выделения ДНК • использование УФ, работа в ламинарных боксах; • смена перчаток; • осмотр объектов и выделение ДНК производится в разных помещениях; • в целях осуществления внутреннего лабораторного контроля препараты обозначаются по стандартной схеме, обязательной для каждого сотрудника лаборатории: индивидуальная буква эксперта + №экспертизы + №объекта. В случае работы с препаратами после дифференциального лизиса к названию препарата добавляются обозначения sp и ep (спермальная, эпителиальная фракции);

• препараты ДНК, выделенные из биологических следов (экспертизы) и образцы ДНК проверяемых лиц (справки, экспертизы) исследуются раздельно на всех стадиях , исключая этап оценки количества выделенной ДНК. Исследование образцов ДНК проверяемых лиц в лаборатории проводится 1 -2 экспертами из числа наиболее опытных сотрудников. Эти сотрудники осуществляют весь цикл исследования образцов.

Описание упаковки, методов исследования, результатов оформляется ими в виде отдельного приложения к экспертизе, которое ими подписывается. Образцы приеме экспертизы нумеруются, номер и ФИО проверяемого лица вносятся в специальный журнал регистрации образцов. Под этими номерами образцы исследуются весь цикл.

Образцы обозначаются согласно их номерам в журнале регистрации с добавлением окончания RS.

Это позволяет избежать: 1) перекрестной контаминации препаратов ДНК и образцов (кросс-контаминация); 2) ошибок, допущенных при постановке ПЦР или фореза, когда данные ДНК проверяемого лица могут ошибочно попасть в лунку, обозначенную как препарат ДНК, выделенной из объекта, изъятого на месте происшествия.

Примечание: в качестве контроля в случае несовпадения данных ДНК лица и ДНК следа в рамках одного уголовного дела, полученный из следа генотип проверяется по всей плашке с образцами для выявления возможного совпадения (контроль ошибки при постановке ПЦР или фореза с образцами) • обязателен контроль выделения ДНК.

Препарат для обработки рабочих поверхностей столов и ламинаров в помещениях для выделения и амплификации ДНК (DNA-Exitus Plus, Appli. Chem) – средство борьбы с контаминированием.

Методы выделения ДНК 1. Выделение ДНК с использованием Chelex-100 2. Выделение ДНК на сорбентах 3. Метод органической экстракции 4. FTA-card

Цели выделения ДНК – разрушение цитоплазматических и ядерных мембран; – гидролиз протеинов, образующих комплекс с ДНК; – устранение ингибиторов ПЦР*

Выделение ДНК Требования к методу: – безопасность; – экономичность; – быстрота и простота выполнения; – работа с различными субстратами; – низкие потери ДНК; – высокое качество ДНК; – возможность автоматизации.

Выделение ДНК с использованием Chelex-100

Chelex-100 • Chelex-100 – хелатирующий агент; • представляет собой сополимер стирола и дивинилбензола с аминодиацетатными группами; • имеет макропористую структуру; • обладает свойствами ПАВ (детергент); • является ионообменной смолой (связывает ионы двухвалентных металлов); • нерастворим в воде; • устойчив в широких диапазонах р. Н.

Структура Chelex-100

Набор «DNA Purification System» (Promega)

Протеиназа К Протеиназа K (протеаза K, эндопептидаза K) Протеиназа K— сериновая протеаза широкого спектра. Обнаружена в 1974 году в экстракте грибка Engyodontium album. Протеиназа К способна расщеплять кератин, основной белок волос, отсюда и пошло её название.

Основные участки в пептиде, распознаваемые и гидролизуемые протеиназой, — пептидные связи, соседствующие с карбоксильной группой алифатических и ароматических аминокислот с закрытой альфа-амино-группой. Структура Протеиназа К состоит из 279 аминокислот.

В молекулярной биологии протеиназа К применяется для удаления белковой примеси в препаратах нуклеиновых кислот. Кроме этого, протеиназа К быстро расщепляет и инактивирует нуклеазы в препаратах ДНК. Протеиназа К устойчива ко многим денатурирующим агентам, таким как додецил-сульфат натрия и мочевина, и сульфгидрильным реагентам.

Денатурирующие агенты повышают доступность пептидных связей белков для протеиназы К и, таким образом, ускоряют их гидролиз (добавление 0, 5 -1% додецил-сульфат натрия или 1 -4 М р-ра мочевины увеличивают активность протеиназы К). Протеиназа К работает в широком диапазоне p. H (4 -12), её оптимум – p. H 7, 5 -12, 0.

Начало инактивации протеиназы К (при нагревании до 50 0 С) наступает через 10 мин после начала реакции. Расщепление протеиназы К ускоряется при снижении концентрации ионов Са 2+ и увеличении количества ионных детергентов (например, SDS)

Приготовленный раствор протеиназы К хранят при -20 0 С. Неоднократные циклы заморозки-разморозки раствора протеиназы К значительно снижают ее активность.

Рекомендуется: 1) разделение рабочего раствора протеиназы К на отдельные аликвоты; 2) приготовление рабочего раствора протеиназы К на основе «незамерзающего» буфера с глицеролом и использование в процессе работы с протеиназой К штативов для пробирок с хладагентами

Общая методика выделения ДНК с использованием Chelex-100 • К биологическому материалу добавляют суспензию Chelex-100 (лизис клеточных мембран в высокощелочной среде, «связывание» ионов двухвалентных металлов Са 2+ и Мg 2+ – кофакторов нуклеаз); • добавляют протеиназу К; • встряхивают (vortex), центрифугируют (для сброса капель со стенок и крышек пробирок); • термостатируют при 56 0 С (оптимальные температурные условия для работы протеиназы К – происходит гидролиз белков клеточных стенок, гистоновых белков и нуклеаз); • встряхивают (vortex), центрифугируют (для сброса капель со стенок и крышек пробирок, чтобы раствор, содержащий протеиназу К, не остался на крышках) • термостатируют при 99 0 С (разрушение, инактивация нуклеаз и протеиназы К – в случае попадания протеиназы К в пробирку, в которой будет ставиться ПЦР, может произойти гидролиз полимеразы); • встряхивают ( vortex) , центрифугируют в течение 2 -3 мин (осаждение частиц Chelex-100 – в случае попадания Chelex-100 в пробирку, в которой будет ставиться ПЦР, может произойти ингибирование реакции: Chelex-100 связывает ионы Мg 2+ – кофакторы полимеразы); • хранят препараты с выделенной ДНК при 4 0 С в течение нескольких дней. Для более длительных сроков применяют замораживание и хранение при – 20 0 С.

Преимущества выделения ДНК с использованием Chelex-100 – метод является одним из самых дешевых; – прост в исполнении, не требует значительных временных затрат; – отсутствуют потери, связанные с переносом ДНК из пробирки в пробирку

Недостатки выделения ДНК с использованием Chelex-100 – очистка ДНК «грубая» (не устраняется большинство ингибиторов); – в результате использования Chelex-100 получаем одноцепочечную ДНК (нестабильна); – метод подходит при работе не со всеми объектами (неприменим, например, с объектами, содержащими значительное количество белков – мышцами); – Chelex-100 является ингибитором ПЦР.

Действие ингибиторов ПЦР – изменение температуры отжига праймеров; – блокирование активных центров молекул полимеразы; – изменение пространственной структуры молекул полимеразы, разрушение молекул полимеразы; – связывание ионов Мg 2+ – кофакторов полимеразы.

Примеры ингибиторов ПЦР – ЭДТА (хелатирующий агент, связывает ионы Мg) – – антикоагулянт; – гепарин (связывает активные центры молекул полимеразы) – антикоагулянт; – гем – кровь; – гуминовые кислоты – почва; – избыток ионов Са 2+ и Мg 2+ (связываются с ДНК, изменяя температуру отжига праймеров) – кости; – Chelex 100 (связывает ионы Мg 2+ – кофаторы полимеразы); – полисахариды – каловые массы, фрукты; – соли желчных кислот – каловые массы; – индиго – джинсовая ткань; – мочевина (изменяет температуру отжига праймеров) – моча; – меланин – волосы; – вещества, используемые для дубления кож; – неорганические соли в высоких концентрациях (например, Na. Cl); – фенол, хлороформ; – гуанидинтиоцианат; – ПАВ (в том числе SDS); – мыльные растворы (сапонаты) – средства гигиены, порошки.

Выделение ДНК из крови 1) Вырезку (смыв, соскоб) помещаем в Э. пробирку, добавляем 1 мл дистиллированной воды. 2) Встряхиваем в течение 20 мин, центрифугируем (макс. число об. , 5 мин). 3) Удаляем супернатант, оставляя предмет-носитель и 50 мкл жидкости с осадком. 4) В случае, если полученный раствор имеет насыщенный цвет, промывку повторяем (2 -3 раза).

5) Добавляем 200 мкл 5% раствора Chelex 100 (наконечником с широким отверстием) и 3 мкл раствора протеиназы К. 6) Vortex, центрифугируем (макс. число об. , 15 сек) 7) Термостатируем при 56 0 С в течение 30 -40 мин. 8) Vortex, центрифугируем (макс. число об. , 15 сек) 9) Термостатируем при 99 0 С в течение 8 мин. 10) Vortex, центрифугируем (макс число об. , 2 -3 мин).

11) Храним при 4 0 С или -20 0 С.

Выделение ДНК из слюны 1) Вырезку (смыв, соскоб) помещаем в Э. пробирку. 2) Если вырезка имеет значительные размеры (фрагмент шапки-маски, платка, отрезок бумаги) – измельчаем, помещаем в центрифужную пробирку объемом 50 мл, заливаем дистиллированной водой или ТЕ- буфером, экстрагируем в течение 1 – 2 ч.

Затем пинцетом помещаем фрагменты вырезки в марлевый мешочек, закрепляем в той же пробирке, фиксируем крышкой пробирки и центрифугируем (5 -10 мин, макс. число об. ). Отбираем супернатант, оставляя в пробирке около 1 мл жидкости и осадка, суспендируем и переносим в Э. пробирку. Центрифугируем (5 мин, макс. число об.

), отбираем супернатант, оставляя около 50 – 100 мкл жидкости и осадка. 3) Добавляем 200 мкл 5% раствора Chelex 100 и 3 мкл раствора протеиназы К. 4) Vortex, центрифугируем (макс. число об. , 15 сек). 5) Термостатируем при 56 0 С в течение 30 -40 мин. 6) Vortex, центрифугируем (макс. число об. , 15 сек). 7) Термостатируем при 99 0 С в течение 8 мин.

8) Vortex, центрифугируем (макс. число об. , 2 -3 мин). 9) Храним при 4 0 С или -20 0 С.

Источник: https://present5.com/vydelenie-dnk/

ISSN 1996-3955 ИФ РИНЦ = 0,570

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №3 Тема: Выделение ДНК на сорбент из крови
1 Латыпова З.А. 1 Сарбаканова Ш.Т. 1 Аубекерова Л.С. 1 Касымова К.Т. 1 1 ТОО «Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт» Проведен подбор способа и отработана методика выделения ДНК для дальнейшего проведения ПЦР-ПДРФ анализа. В результате работы была получена ДНК из образцов крови животных.

Из приведенных способов выделения ДНК (способа экстракции ДНК из образцов крови животных: с применением набора реагентов «ДНК сорб», экстракция ДНК с применением реагента Prepman Ultra и выделение ДНК с помощью метода, основанного на сорбции ДНК на тонкодисперсной двуокиси кремния SiO2) наиболее оптимальным для выделения ДНК из крови животных является третий метод, основанный на сорбции ДНК на тонкодисперсной двуокиси кремния SiO2. тонкодисперсная двуокись кремния SiO2 1. Смазнова И.А. Характеристика аллельного полиморфизма гена BOLA-DRB3, влияющего на устойчивость к лейкозу, и генов молочной продуктивности у быков-производителей: дис…. канд. биол. наук. – СПб., 2014. – С. 50-63. 2. Ивахнишина Н.М., Когут Е.П., Островская О.В. Оптимальный метод выделения нуклеиновых кислот вирусов в секционном материале [электронный ресурс]. – Режим доступа: http:// www.fesmu.ru/SITE/files/editor/file/…/200804_39.pdf (дата обращения 12.12.2015).
3. Великов В.А. Молекулярная биология: практическое руководство. – Саратов, 2013 – С. 6–16.

Наиболее важным моментом при постановке ПЦР, от которого во многом зависит качество анализа, является первый этап, который включает в себя процесс выделения ДНК из образцов крови животных и определение чистоты выделенной ДНК. Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата чистотой, пригодной для постановки ПЦР ДНК.

Изучение генетической устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза КРС (ВЛКРС) основано на определении генетического полиморфизма гена BoLA-DRB3 и выявлении аллелей, ассоциированных с устойчивостью или чувствительностью к ВЛКРС и ответственных за формирование иммунной реакции к вирусу, при помощи ПЦР-ПДРФ анализа [1, 2, 3]. Наиболее важным моментом при постановке ПЦР, от которого во многом зависит качество анализа, является первый этап, который включает в себя процесс выделения ДНК из образцов крови животных и определение чистоты выделенной ДНК.

Целью исследования является отработка оптимального способа выделения ДНК из крови животных.

Материалы и методы исследования

В работе были исследованы 10 образцов крови коров черно-пестрой и 10 образцов алатауской породы. Выделение ДНК проводили согласно инструкции прилагаемой к наборам реагентов.

Электрофорез выделенной ДНК проводили при силе тока 50-100 мА, напряжении электрического поля 140 В, длительность разделения фрагментов ДНК – 30 минут.

Для визуализации фрагментов ДНК в агарозный гель добавляют бромистый этидий.

Результаты исследования и их обсуждение

Одни из способов выделения ДНК основаны на лизисе (разрушении) клеток путём добавления лизирующего раствора, сорбции ДНК на носителе (диатомовая земля, сорбенты на основе кремния, магнитный сорбент), многократной отмывке и ресорбции ДНК в элюирующий раствор. Эти методы удобны, однако, вследствие необратимой сорбции на носителе и многократных отмывок возможны потери ДНК.

Это имеет большое значение при незначительном количестве ДНК в исследуемой пробе. Кроме того, даже следовые количества компонентов лизирующего раствора могут ингибировать ПЦР. Другие методы выделения ДНК основаны на использовании ионообменников, которые сорбируют не ДНК, а примеси, ингибирующие реакцию.

Эти методы включают две стадии: кипячение исследуемой пробы и сорбцию примесей на ионообменнике. При массовом обследовании для получения статистических данных используют простые методы выделения с использованием детергентов или обработки исследуемого материала щелочами с последующей их нейтрализацией.

Однако эти методы из-за использования в реакционной смеси некачественного препарата ДНК могут приводить к ложноотрицательным результатам.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов. Поэтому перед нами стояла задача выбора оптимального способа экстракции ДНК из образцов крови по чистоте и концентрации.

Для выделения ДНК отобраны образцы крови коров черно-пестрой породы (10 голов) и алатауской породы (10 голов). При выделении реагентом Prepman Ultra, полученные образцы были недостаточно чистыми.

При выделении с использованием набора реагентов ДНК-сорб концентрация ДНК была низкой, что недостаточно для проведения амплификации со специфическими праймерами.

При использовании метода, основанного на сорбции ДНК на тонкодисперсной двуокиси кремния (SiO2), образцы оказались достаточно чистыми для проведения дальнейших исследований методом ПЦР.

При выделении ДНК из крови животных с помощью метода, основанного на сорбции ДНК на тонкодисперсной двуокиси кремния, в пробирки Эппeндорфа на 1,5мл вносят 150 мкл крови.

Затем добавляют 600 мкл лизирующего буфера (5 М гуанидинтиоционат, 20 мМ ЭДТА, 100 мМ ТРИС, рН 6,4, 1 % тритон Х -100), вносят 50 мкл суспензии «Cилика» фирмы Хеликон и интенсивно перемешивают содержимое пробирок на Vortex. Далее пробирки инкубируют в течение 5 мин при 65оС, периодически перемешивая содержимое пробирок на Vortex.

Полученную смесь центрифугируют 30 секунд при 5000 об/мин. Супернатант удаляют, не задевая осадок.

К осадку добавляют 500 мкл лизирующего буфера, содержимое перемешивают на Vortex, центрифугируют 30 секунд при 5000 об/мин, удаляют супернатант, к осадку добавляют 700 мкл солевого буфера [10 мл 10х солевого буфера (1 М NaCl, 1 М KCl) + 90 мл дистиллированной воды + 300 мл этанола].

Содержимое пробирок перемешивают на Vortex, центрифугируют смесь 30 секунд при 5000 об/мин. Затем повторяют добавление солевого буфера, перемешивание и центрифугирование при 10000 об/мин в течение 30 сек. Супернатант удаляют и высушивают осадок при 65оС – 5-7 мин. Добавляют 100 мкл деионизованной Н2О и инкубируют 5-7 мин при 65оС. Перемешивают пробирки каждые 1-2 минуты во время инкубации. Затем пробирки центрифугируют при максимальных оборотах (14000 об/мин) 10 минут и супернатант, содержащий ДНК, переносят в пробирки Эппендорфа.

Таким образом, используя 3 разных метода, была получена ДНК из образцов крови животных.

Из приведенных выше способов выделения ДНК (способа экстракции ДНК из образцов крови животных: с применением набора реагентов «ДНК сорб», экстракции ДНК с реагентом Prepman Ultra и выделение ДНК с помощью метода, основанного на сорбции ДНК на тонкодисперсной двуокиси кремния). Наиболее оптимальным методом для выделения ДНК из крови оказался третий метод основанный на сорбции ДНК на тонкодисперсной двуокиси кремния.

Далее качество выделенных препаратов ДНК проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Электрофорез ДНК проводится на этапах выделения ДНК, амплификации и рестрикции ДНК. Для приготовления 1 % агарозного геля необходимы следующие компоненты: агароза и 5хТВЕ буфер. Состав 5хТВЕ буфера: 54 г Трис-ОН, 27,5 г борной кислоты, 20 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0.

Для приготовления агарозного геля 1 г порошка агарозы вносят в стакан со 100 мл Трис-боратного буфера (1 х ТВЕ) (для этого к 20 мл 5хТВЕ буфера добавляем 80 мл Н2О). Полученную взвесь нагревают в микроволновой печи до полного расплавления агарозы.

Затем раствор остужают до 50 оС и добавляют 5 мкл бромистого этидия (из водного раствора, содержащего 10 мг/мл и хранящегося при 40 оС в светонепроницаемом сосуде) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Бромистый этидий используется для обнаружения ДНК. Агарозу заливают в подложку камеры для горизонтального электрофореза и устанавливают гребёнку для образования ячеек.

Необходимо, чтобы между дном ячейки и основанием геля оставался слой агарозы толщиной 0,5–1,0 мм, т.е., чтобы дном ячейки служил агарозный гель. После того как гель полностью затвердеет (через 30–45 минут при комнатной температуре), осторожно удаляют гребёнку.

Помещают подложку в камеру, добавляют буфер для электрофореза, гель должен быть закрыт слоем буфера толщиной 2-3 мм. Для внесения образцов ДНК в ячейки геля используют буфер нанесения, содержащий 0,01 % бромфеноловый синий, 0,25 М ЭДТА, 50 % глицерина. Буфер нанесения смешивают с пробой в соотношении 1:1, а затем вносят в ячейку с помощью пипетки-дозатора.

Электрофорез проводят при напряжении 140 В, 30 минут. После электрофореза помещают гель в камеру прибора для фиксации анализа изображений «Биорад» и обрабатывают электрофореграмму. Для электрофоретического анализа используется 2 мкл ДНК (рисунок).

Как видно на рисунке, качество полученных препаратов выделенной ДНК удовлетворительное. Далее выделенная и очищенная ДНК используется для проведения ПЦР-ПДРФ анализа аллельного полиморфизма гена BoLA-DRB3.

Электрофореграмма выделенной и очищенной ДНК из 10 образцов крови коров черно-пестрой породы (образцы 26-51)

Заключение

Таким образом, количество и качество полученной ДНК характеризует метод выделения ДНК, основанный на применении двуокиси кремния SiO2, как наиболее приемлемый. ДНК не деградирована и её количество достаточно для проведения дальнейших молекулярно-генетических исследований.

Библиографическая ссылка

Латыпова З.А., Сарбаканова Ш.Т., Аубекерова Л.С., Касымова К.Т. ОТРАБОТКА ОПТИМАЛЬНОГО СПОСОБА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ КРОВИ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-ПДРФ АНАЛИЗА АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА BOLA-DRB3 // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2016. – № 1-4. – С. 555-557;
URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=8602 (дата обращения: 13.02.2020).

Источник: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=8602

Medic-studio
Добавить комментарий