Приготовление окрашенных препаратов бактерий: Приготовление окрашенных препаратов складывается из нанесения

Приготовление микроскопических препаратов

Приготовление окрашенных препаратов бактерий: Приготовление окрашенных препаратов складывается из нанесения

Для изучения микроорганизмов производят микроскопирование как живых, так и убитых микробов в неокрашенном и окрашенном виде.

Микроскопический препарат готовят на предметном стекле – пластинке из тонкого стекла (76х26 мм) с хорошо отшлифованными краями.

Предметные стекла, употребляемые при микробиологическом исследовании, должны быть кристально чисты и абсолютно обезжирены. На поверхности обезжиренного стекла вода легко расплывается и не образует капель шаровидной формы.

Новые стекла перед употреблением кипятят в 1%-ном растворе соды 10 мин, промывают водой, слабой соляной кислотой и хорошо прополаскивают в дистиллированной воде.

Стекла, бывшие в употреблении, необходимо обработать раствором серной кислоты в течение 2 ч, хорошо промыть в воде и прокипятить 10 мин в 4%-ном растворе соды.

Ополоснутые затем дистиллированной водой стекла протирают чистой полотняной тряпочкой.

В лаборатории всегда следует иметь запас готовых для работы стекол. Хранить предметные стекла лучше всего в банке с притертой пробкой, погруженными в смесь спирта с эфиром, взятых в равных объемах. Из банки предметные стекла достают пинцетом. Покровные стекла – вырезанные квадратом или прямоугольником тонкие стеклышки (толщиной 0,15-0,17 мм) размерами 18х18 мм, 20х20 мм, 18х24 мм.

Исследование микроорганизмов в живом виде

Микроорганизмы можно микроскопировать как в живом, так и в мертвом (фиксированном) состоянии на специально приготовленных препаратах. Плесневые грибы и дрожжи лучше рассматривать в живом виде в препарате «раздавленная» капля.

Клетки этих микроорганизмов относительно крупные, и обычно при микроскопировании в живом виде хорошо выявляются их форма, размеры, некоторые детали внутреннего строения, а также характер размножения (почкование, деление, спорообразование и т.д.).

Бактерии ввиду их малых размеров чаще рассматривают в мертвом виде на фиксированных окрашенных препаратах. При этом получается более ясное представление о форме и размерах клеток, о способности их к спорообразованию. В живом виде в «раздавленной» капле бактерии рассматривают в том случае, когда выясняют их способность к движению.

Препарат «раздавленная» капля. На обезжиренное предметное стекло прокаленной петлей наносят каплю стерильной воды, в которую той же петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры микроорганизма (дрожжей или бактерий), взятой с твердой питательной среды.

Из жидкой среды культуру берут вместе с каплей жидкости, а при надобности добавляют каплю стерильной воды. Суспензия культуры микробов на стекле должна давать лишь слабую муть.

При микроскопировании дрожжей в каплю жидкости на стекле добавляют петлей небольшое количество метиленовой сини (до голубого окрашивания) и всю эту смесь тщательно размешивают.

Прижизненная окраска дрожжей метиленовой синью применяется для того, чтобы выявить мертвые клетки, легко окрашивающиеся в синий цвет. Живые клетки остаются неокрашенными, так как не пропускают краску через свою оболочку.

Приготовленный на предметном стекле препарат дрожжей накрывают покровным стеклом и рассматривают с объективом 40Х. В таком препарате обычно хорошо видны прозрачные овальные или круглые клетки дрожжей с ядрами и оболочками, которые хорошо заметны в клетках живых дрожжей. Мертвые клетки, как правило, более мелкие по сравнению с живыми м окрашены в синий цвет.

Препарат живых бактерий готовится подобно препарату дрожжей, но бактерии можно рассматривать и без добавления краски.

На поверхность покровного стекла наносится капля иммерсионного масла, и препарат рассматривается с иммерсионным объективом 90 X, лучше всего в затемненном поле (т.е. с прикрытой диафрагмой).

Если культура бактерий подвижная, то хорошо видны быстрые разнохарактерные движения отдельных клеток.

Для приготовления препарата плесневых грибов очень осторожно (чтобы не разрушить органов спороношения) специальной иглой (можно препаровальной) или ботаническим пинцетом снимают кусочек пленки гриба и переносят его в каплю воды, предварительно нанесенную на предметное стекло.

Препарат осторожно, слегка придавливая, накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом с объективом 8Х. При этом увеличении хорошо различается строение органов спороношения плесневых грибов. Для подробного изучения отдельных деталей строения (гиф, сумок и т.д.) препарат рассматривают с объективом 40X.

При этом обязательно следует регулировать освещение с помощью диафрагмы для получения более четкого изображения рассматриваемых деталей.

При приготовлении препаратов в раздавленной капле нужно помнить следующее:

1. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться его ребром к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить стекло.

2. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не переливалась за края и не попадала на верхнюю сторону покровного стекла. Избыток воды снимают кусочком фильтровальной бумаги.

3. Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под покровным стеклом, обычно не мешают наблюдению. Но если пузырьков много, препарат следует приготовить заново.

4. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микроорганизмы не заслоняли друг друга.

5. Приготовленные препараты рассматривают немедленно (особенно живых бактерий), так как в противном случае вода высыхает и клетки бактерий теряют подвижность.

6. Бактериологическую петлю (или иглу) перед каждым очередным пассажем и после него (нанесение капли воды на стекло, снятие культуры с агара и ее размешивание, взятие краски и т.д.) следует обязательно докрасна прокаливать в пламени горелки.

После прокаливания петлю быстро охлаждают на воздухе (держат 2-3 сек, ни к чему не прикасаясь) и приступают к выполнению очередного этапа работы.

Исследование микроорганизмов в фиксированном и окрашенном виде

Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предметное стекло платиновой петлей наносят материал (рис. 62). Если он жидкий, то каплю, взятую петлей, непосредственно равномерно распределяют по поверхности предметного стекла тонким слоем на площади примерно в 1 см2.

Если же изучается агаровая культура, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильной воды, в которой тонким слоем распределяется исследуемая культура. Получается так называемый мазок.

Все манипуляции по приготовлению мазка необходимо выполнять с соблюдением правил асептики (над пламенем горелки стерилизуют петли, концы сосудов с исследуемым материалом, ватные пробки и пр.). Сделав мазок, его сушат при комнатной температуре, поместив на специальный сушильный столик (рис. 63).

Хороший мазок после сушки должен давать едва заметный налет. Препарат с густым мазком для наблюдения малопригоден.

Для ускорения высыхания можно осторожно подсушить мазок над пламенем горелки. Предметное стекло в этом случае над пламенем горелки держат так, чтобы мазок был обращен вверх.

Фиксация мазка. Предметное стекло с высушенным мазком, обращенным вверх от пламени горелки, проводят 3-4 раза на границе между светлой и темной частью пламени. Цель фиксации – убить микробные клетки, прикрепить их к стеклу и облегчить окрашивание. Мертвые клетки гораздо лучше воспринимают краску, чем живые.

Препарат в общей сложности не должен находиться в пламени более 2 сек. Излишнего нагревания мазков нужно избегать, так как при этом сильно изменяется структура клеток, мазок будет плохо окрашиваться. При недостаточной же фиксации мазка его можно смыть при последующей окраске. Практически достаточность нагревания определяют прикладывая предметное стекло к руке.

При этом должен чувствоваться легкий ожог.

Окраска мазков. В лабораторной практике пользуются простыми и сложными методами окраски микробов. Сложные, или дифференциальные, способы окраски, как уже указывалось, применяются для детального изучения структуры клеток.

При простой окраске препаратов на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо красящего раствора (метиленовой сини, разведенного фуксина и пр.). Для получения более чистых препаратов рекомендуется красящий раствор наливать на отрезок фильтровальной бумаги, которой покрывают мазок. Раствор краски в среднем выдерживают на мазке 2-3 мин (в зависимости от вида краски).

Фуксин красит интенсивно, причем окрашиваются одинаково хорошо все виды бактерий. Продолжительность окрашивания раствором фуксина вполне достаточна на протяжении 1-2 мин. Щелочную метиленовую синь оставляют для окрашивания мазка на 2-3 мин. Она красит менее сильно, но препарат получается более изящный, к тому же различные бактерии приобретают окраску различной интенсивности.

При окраске метиленовой синью у крупных клеток (например, дрожжевых) дифференцируется ядро и цитоплазма. Раствор генцианвиолета держат для окраски 3-5 мин.

По истечении указанного срока краску сливают с предметного стекла.

Если на мазок помещалась фильтровальная бумага, ее нужно осторожно снять пинцетом и затем промыть мазок легкой струей дистиллированной воды (можно и водопроводной).

Струю воды следует направлять на ребро предметного стекла, а не на мазок. Промытый препарат высушивают на воздухе при комнатной температуре или с помощью полосок фильтровальной бумаги.

На сухой мазок наносят каплю кедрового масла. Не следует кедровое масло наносить на влажный (а тем более на мокрый) мазок. При этом возникает эмульсия воды в кедровом масле и четкость изображения в микроскопе резко снижается.

Сущность сложных методов окраски заключается в том, что препарат окрашивают не одной, а двумя и большим количеством контрастных красок. В микробиологической практике сложный метод окраски микробов по Граму имеет весьма важное значение при дифференциации микробов.

Техника окраски микробов методом Грама состоит в следующем. На фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый раствор генцианвиолета на 1-2 мин. Затем краску сливают. Сняв бумажку и не промывая препарат водой, наносят на мазок раствор Люголя также на 1-2 мин (мазок чернеет).

По истечении указанного времени раствор Люголя сливают с предметного стекла и погружают стекло в стаканчик со спиртом для обесцвечивания. Предметное стекло слегка покачивают в спирте, выдерживая 30-60 сек. Быстро промывают мазок водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином в течение 1-2 мин.

Фуксин сливают, препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Выполнить окраску микробов по Граму можно, пользуясь модификацией этого метода, предложенной Синевым. Вместо раствора карболового генцианвиолета используют фильтровальную бумагу, пропитанную этим раствором и высушенную.

На фиксированный мазок накладывают полоску такой бумаги, наносят несколько капель стерильной воды, так чтобы бумажка оказалась смоченной, и окрашивают препарат в течение 2 мин.

Затем бумажку снимают, на препарат наливают раствор Люголя и далее поступают так же, как указано выше при окраске по Граму.

По отношению к окраске по Граму все бактерии разделяют на две группы: грамположительные (грампозитивные) и грамотрицательные (грамнегативные).

Первые в результате окраски остаются окрашенными в фиолетовый цвет; вторые – обесцвечиваются спиртом и при дополнительном окрашивании фуксином приобретают красный цвет.

Объясняется это тем, что у грамположительных бактерий в цитоплазме клеток содержатся специфические белки и магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которые с генцианвиолетом и йодом образуют комплекс фиолетового цвета, не разрушающийся под действием спирта.

У грамотрицательных бактерий магниевая соль рибонуклеиновой кислоты в клетках отсутствует, и такого комплекса при окраске генцианвиолетом и йодом в цитоплазме не образуется. Генцианвиолет и йод в дальнейшем легко обесцвечиваются спиртом.

Приготовление красящих растворов

При бактериологическом исследовании для окраски микробов применяются основные анилиновые краски. Чаще всего употребляются: основной фуксин (красная краска), метиленовая синь (синяя краска), генцианвиолет, кристаллвиолет, метилвиолет (фиолетовые краски). Эти краски продаются в виде аморфных или кристаллических порошков, из которых готовят красящие растворы.

Исходным материалом для приготовления необходимых рабочих красок являются насыщенные спиртовые растворы указанных красителей. Спиртовые растворы готовят впрок и сохраняют в склянках с притертыми пробками. Сами по себе спиртовые растворы для окраски микробов не применяются.

Насыщенный спиртовой раствор красителя получают растворением 1 г его в 10 мл 96%-ного этилового спирта (этанола). Краска обычно полностью не растворяется, и на дне флакона остается небольшой осадок. Полученный спиртовой раствор настаивают 3-5 дней, ежедневно взбалтывая.

Рабочий водно-спиртовой раствор краски получают смешивая 1 мл насыщенного спиртового раствора с 10 мл дистиллированной воды. Для повышения красящей способности в качестве протравы к водно-спиртовым растворам красок добавляют карболовую кислоту.

Рецепты приготовления наиболее употребительных красок.

Карболовый фуксин Циля. 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина смешивают со 100 мл 5%-ной карболовой кислоты. Можно приготовить красящий раствор и непосредственно из сухого красителя. Для этого 1 г основного фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты.

Для лучшего растирания рекомендуется добавить несколько капель глицерина. Затем понемногу приливают 10 мл 96%-ного спирта. К равномерно растертой массе постепенно приливают 100 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют на 1-2 суток. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Фуксин Циля стоек и может сохраняться очень долго.

Его употребляют для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий, трудно воспринимающих краску.

Фуксин Пфейфера (разведенный фуксин). 1 мл карболового фуксина Циля смешивают с 9 мл дистиллированной воды. Раствор нестоек, поэтому его приготовляют непосредственно перед окраской препаратов. Используют для простой окраски мазков и дополнительной окраски их по методу Грама.

Карболовый генцианвиолет. 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианвиолета смешивают со 100 мл 5%-ной карболовой кислоты или 1 г генцианвиолета растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты, постепенно добавляют 10 мл 96%-ного спирта и 100 мл дистиллированной воды.

Щелочная метиленовая синь (по Лефлеру). К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл 1%-ного раствора едкого кали (КОН). Раствор фильтруют. Краска очень прочная, причем красящая способность старой краски выше, чем свежеприготовленной.

Водный раствор метиленовой сини. 1 г метиленовой сини растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Раствор Люголя. 2 г йодистого калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды, прибавив 1 г кристаллического йода. Объем доводят водой до 300 мл. Раствор Люголя должен иметь слабощелочную или нейтральную реакцию. При кислой реакции его нейтрализуют (по лакмусу) двууглекислой содой. Раствор следует хранить в склянках из темного стекла, предохраняя от действия света.

Приготовление пропитанной генцианвиолетом фильтровальной бумаги для окраски микробов по Граму в модификации Синева. Раствор карболового генцианвиолета помещают на сутки в термостат при 37 °С, затем фильтруют через бумажный фильтр.

Фильтрат выливают в тарелку и погружают в него нарезанную полосками фильтровальную бумагу на 1-2 мин. Пропитанная краской бумага подсушивается, нарезается кусочками (2х4 см) и сохраняется в темных склянках с притертой пробкой.

Срок хранения неограниченный.

Примечание. Свежеприготовленные карболовые растворы красок имеют на поверхности пленку с металлическим блеском. Эти растворы стойкие и сохраняются довольно долго. Однако при слишком длительном хранении они могут стать непригодными; в этом случае металлический блеск на поверхности их пропадает, а на дне образуется мелкий порошкообразный осадок.

Источник: http://www.spec-kniga.ru/tehnohimicheski-kontrol/osnovy-mikrobiologicheskogo-kontrolya-konservnogo-proizvodstva/mikroskop-i-tekhnika-mikroskopirovaniya-prigotovlenie-mikroskopicheskih-preparatov.html

Приготовление и микроскопирование препаратов микрорганизмов

Приготовление окрашенных препаратов бактерий: Приготовление окрашенных препаратов складывается из нанесения

Цель занятия – освоить методы приготовления и особенности исследования препаратов живых и фиксированных клеток.

Ход работы. Выполняются задания:

Задание 1. Ознакомиться с морфологическим составом и характеристиками микроорганизмов.

Задание 2. Приготовление и микроскопирование препаратов «раздавленная» и «висячая» капля.

Для выполнения работы в соответствии с методическими указаниями приготовить на предметных стеклах препараты «раздавленная капля» и «висячая капля» из культур молочнокислых бактерий или заквасок. Просмотреть с объективом 40 под микроскопом. Зарисовать.

Задание 3. Приготовление окрашенных препаратов. На предметных стеклах приготовить мазки из культур молочнокислых бактерий или заквасок, по 2 мазка из каждой культуры. Освоить технику приготовления окрашенных препаратов. Окрасить первые мазки простым методом с применением метиленовой сини, а вторые – по методу Грама.

Задание 4. Микроскопирование препаратов, окрашенных по методу Грама. Просмотреть окрашенные препараты с иммерсионным объективом 90. Зарисовать цветными карандашами.

Методические указания

Оборудование и материалы: биологические объекты, микроскоп, предметные стекла, иммерсионное масло, бактериологические петли, фильтровальная бумага, предметное стекло с лункой, покровные стекла, спиртовки, растворы основных красок: фуксин Пфейффера, краска Грама, раствор Люголя, раствор метиленовой сини, вода дистиллированная, спирт 96 %.

Для изучения микроорганизмов пользуются сложными оптическими приборами – микроскопами. Микроскопы, применяемые в лабораториях, бывают оптические (монокулярные, бинокулярные), люминесцентные, а также электронные.

Оптический микроскоп состоит, в свою очередь, из механической и оптической частей (рис. 2). Механическая часть состоит из штатива, тубуса, предметного столика и винтов. Штатив включает основание, которое служит опорой микроскопа, и тубусодержатель, используемый для крепления подвижного тубуса и в качестве ручки для переноса микроскопа.

Рис. 2. Устройство светового микроскопа: 1 – основание микроскопа; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – окуляр (чаще х7); 5 – револьвер микроскопа; 6 – объективы (сухой: х8, х20, х40; иммерсионный х90); 7 – предметный столик; 8 – конденсор; 9 – макрометрический винт; 10 – микрометрический винт; 11 – винт конденсора; 12 – зеркало

Тубус – это зрительная труба микроскопа. В верхнее отверстие тубуса свободно вставляется окуляр, а на нижнем его конце находится вращающийся вокруг своей оси барабан револьвера, в который ввинчиваются объективы. Вращая барабан револьвера, можно быстро центрировать объективы в процессе работы с микроскопом, т. е.

ставить объективы в оптическую ось тубуса микроскопа. На револьвере напротив объектива имеется желобок, в который входит ступица (пружинка), закрепляющая объектив в центрированном положении. При попадании ступицы в желобок ощущается щелчок и требуется некоторое усилие для выведения револьвера из этого положения.

Предметный столик предназначен для размещения изучаемого препарата. Препарат закрепляют имеющимися на столике пружинными клеммами. В центре предметного столика есть отверстие для прохождения лучей света, освещающих препарат.

Предметный столик можно передвигать в двух взаимно перпендикулярных направлениях с помощью двух винтов, симметрично расположенных на краях, или в разных направлениях посредством боковых винтов.

Вместе со столиком передвигается и препарат, что позволяет рассматривать его в разных местах.

Винты (микрометрический и макрометрический) позволяют передвигать тубус вверх и вниз для установления находящихся на нем объективов на необходимом расстоянии от препарата (так, чтобы препарат находился в фокусе данного объектива).

При вращении винтов по часовой стрелке тубус опускается, а против часовой стрелки – поднимается. Макрометрическим винтом пользуются для предварительной установки объектива, т. е. установки его на такое удаление от препарата, при котором препарат становится видимым.

При работе с объективами 40 и 90 для точной их установки используют также микрометрический винт, полный оборот которого передвигает тубус всего на 0,1 мм.

Этот винт имеет сложное устройство и может испортиться при неправильном обращении с ним, его можно поворачивать не более чем на 180° в ту или другую сторону.

Оптическая часть микроскопа состоит из осветительной и оптической систем. Осветительная система микроскопа находится под предметным столиком и состоит из зеркала и конденсора с диафрагмой.

Зеркало отражает лучи света от источника и направляет их в сторону конденсора. Зеркало двухстороннее: одна сторона плоская, другая вогнутая.

При дневном освещении пользуются плоским, а при искусственном (электрическом) освещении – вогнутым зеркалом.

Зеркало имеет две взаимно перпендикулярные оси, позволяющие установить его в разнообразных положениях для наилучшего отражения света от источника.

Конденсор служит для лучшего освещения препарата и состоит из нескольких линз, благодаря которым он собирает отраженные от зеркала световые лучи в сильный световой пучок и направляет их через отверстие предметного столика на препарат, а затем в объектив. Конденсор с помощью винта (кремальеры конденсора) можно продвигать вверх и вниз.

Чем ниже опускается конденсор, тем слабее освещается препарат, и наоборот. При микроскопировании неокрашенных препаратов (с объективами 8 и 40) конденсор опускают так, чтобы лучше были видны микробы, а при микроскопировании окрашенных препаратов и работе с объективами большего увеличения его поднимают вверх до предела.

Диафрагма находится под конденсором и служит для регулирования количество света, поступающего в конденсор. Так называемая ирисовая диафрагма состоит из ряда подвижных металлических пластинок, которые сдвигаются и раздвигаются, в результате чего отверстие диафрагмы может изменяться.

Оптическая система микроскопа состоит из объективов и окуляров. Объектив представляет собой систему линз, заключенных в металлическую оправу. Линза, обращенная к объекту, называется фронтальной. Объектив обладает определенной увеличительной (разрешающей) способностью. Чем больше кривизна линз, тем короче фокусное расстояние и больше разрешающая способность объектива.

Объектив дает действительное, увеличенное, обратное изображение объекта и выявляет его детали. Биологические микроскопы М-10, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3 имеют три объектива, дающих разное увеличение.

На оправу каждого объектива нанесена цифра, показывающая увеличение, даваемое данным объективом: на одном 8, на другом 40, на третьем 90 (на объективах других моделей микроскопов могут быть нанесены другие цифровые или буквенные обозначения).

Фокусное расстояние объектива 8 равно 9 мм, 40 – 0,65 мм и объектива 90 – 0,15 мм.

Объективы подразделяются на сухие и иммерсионные (масляно-погружные). При рассмотрении препарата с помощью сухих объективов (8 и 40) между их фронтальной линзой и препаратом находится воздух.

При работе с иммерсионным объективом (90) для предотвращения рассеивания света пространство между фронтальной линзой объектива и препаратом заполняют кедровым (иммерсионным) маслом (нижнюю часть объектива погружают в каплю масла), которое имеет показатель преломления, приблизительно равный показателю преломления стекла.

Окуляр состоит из двух линз, заключенных в металлическую оправу. Нижняя линза называется собирательной, верхняя – глазной. Окуляр увеличивает изображение, данное объективом, т. е. дает мнимое изображение, поэтому чем в большей степени увеличивает окуляр, тем менее четким будет изображение.

Биологические микроскопы имеют 3 окуляра с увеличением в 7, 10 и 15 раз. Таким образом, общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра.

Например, при работе с объективом 8 и окуляром 10 общее увеличение будет равно 80, с объективом 40 и окуляром 10 – 400 и при работе с объективом 90 и окуляром 10 – 900.

Пользуясь оптическим микроскопом, можно рассмотреть предмет величиной не менее 0,2 мкм (1 мкм – 1 микрометр, равный 0,001 мм), так как разрешающая способность объектива не может быть больше половины длины волны воспринимаемого глазом света.

Реальная разрешающая способность объектива равна частному от деления средней длины волны воспринимаемого глазом света на числовую апертуру данного объектива, которая указана на нем и характеризует количество проходящего через объектив света. Например, разрешающая способность объектива 8 0,55 мкм: 0,20 – 2,75 мкм; объектива 40 0,55 мкм: 0,65 – 0,85 мкм, объектива 90 0,55 мкм: 1,25 – 0,44 мкм.

Методика приготовления неокрашенных препаратов

Препараты микроорганизмов готовят на чистых и обезжиренных предметных стеклах длиной 76 мм, шириной 26 мм и толщиной 1-2 мм. Часто используют и покровные стекла 18×18 или 20×20 мм и толщиной 0,15-0,17 мм.

Если нужно исследовать микроорганизмы в живом виде, готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля».

Для приготовления первого препарата на середину предметного стекла наносят каплю жидкой культуры (бактерий, дрожжей) или стерильной водопроводной воды, в которую бактериологической петлей вносят немного исследуемых микробов из их колоний на плотной среде. Каплю осторожно накрывают (раздавливают) покровным стеклом.

Капля должна тонким слоем заполонить пространство между предметным и покровным стеклами, но не должна выступать за края покровного стекла. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой.

Для приготовления препарата «висячая капля» взвесь микробов петлей наносят на центральное место покровного стекла и к нему прикладывают предметное стекло с «луночкой» (углублением) так, чтобы капля оказалась под центром «луночки». Перед этим вокруг «луночки» наносят тонким слоем вазелин.

После перевертывания предметного стекла луночкой вверх капля будет «висеть» над ней. Для изучения грибов с помощью двух препаровальных игл берут небольшой кусочек мицелия, который вносят в каплю воды или ее смеси с глицерином, осторожно расщепляя иглами.

Неокрашенные препараты бактерий и дрожжей микроскопируют, используя объектив 40, а плесневых грибов – объективы 8 и 40.

Для приготовления препарата дрожжей или бактерий с прижизненной (витальной) окраской клеток на предметное стекло наносят крупную каплю красителя метилового голубого по Лефферу или каплю фуксина Пфейффера и в эту каплю вносят суспензию микроорганизмов.

Затем петлей или пипеткой краску перемешивают с суспензией микроорганизмов, кладут на эту каплю покровное стекло и слегка его придавливают.

Получают «раздавленную каплю» живых окрашенных микробов, которую микроскопируют так же, как и обычную «раздавленную каплю».

В окрашенном виде клетки микробов видны более ясно и четко, чем в неокрашенном, при этом мертвые клетки окрашиваются быстро, а живые – плохо. Применяя специальные красители – флуорохромы (например, примулин) и люминесцентную микроскопию, можно дифференцировать (различать) живые и мертвые клетки дрожжей.

Техника микроскопирования неокрашенных препаратов

Микроскоп вынимают из футляра и переносят, не наклоняя, на рабочее место, держа его одной рукой за тубусодержатель, а другой – за ножку штатива. Помещают микроскоп на рабочем столе тубусодержателем к себе от края стола на расстоянии 3-5 см.

Устанавливают хорошее равномерное освещение поля зрения микроскопа, для чего, глядя в окуляр, зеркалом направляют луч света от источника в объектив, настройку освещения производят, используя объектив 8. Конденсор должен быть поднят вверх, а диафрагма открыта. Поле прения микроскопа должно быть хорошо и равномерно освещено во всех точках.

На предметный столик помещают исследуемый препарат мазком или каплей вверх и закрепляют клеммами. Рассматривают препарат, используя объектив 8, а затем переходят к большим увеличениям.

При работе с объективом 8 расстояние между препаратом и объективом (фокусное расстояние) составляет около 9 мм, с объективом 40 – 0,65 мм и с объективом 90 – около 0,15 мм.

Тубус микроскопа вместе с центрированным объективом осторожно опускают вниз с помощью макрометрического винта, наблюдая сбоку, с таким расчетом, чтобы фокус объектива был ниже рассматриваемого препарата. При работе с объективами 40 и 90 необходимо приблизить объектив почти вплотную к препарату, не касаясь его.

Затем, глядя в окуляр, с помощью того же винта, медленно вращая его на себя, поднимают тубус до тех пор, пока в поле зрения не появится изображение объекта. После этого вращением микрометрического винта точно фокусируют объектив, чтобы изображение предмета было четким. Микрометрический винт можно поворачивать не более чем на пол-оборота.

Для получения наилучшего изображения препарата необходимо регулировать интенсивность его освещения, опуская или поднимая конденсор, открывая или прикрывая диафрагму. Обычно при рассматривании препарата в объектив 8 конденсор несколько опускают, при работе с объективом 90 – поднимают вверх.

Препарат рассматривают в нескольких местах, передвигая предметный столик с помощью боковых винтов.

В процессе микроскопирования препарата медленно (на 1/4 оборота) вращают микрометрический винт по часовой стрелке и против нее так, чтобы можно было рассмотреть препарат во всей его толще.

Если какое-либо место препарата, рассматриваемое при малом увеличении, требуется просмотреть при большем увеличении, то необходимо это место поставить в центре поля зрения, а затем центрировать соответствующий объектив.

Неокрашенные препараты («раздавленная» и «висячая» капли) микроскопируют с объективами 8 и 40. Для этого устанавливают освещение поля зрения как указано выше, а затем опускают конденсор на 1-0,5 см, добиваясь наилучшей видимости неокрашенных клеток.

При микроскопировании «висячей капли» сначала находят ее край, проводя микроскопирование с объективом 8; препарат устанавливают таким образом, чтобы центр капли был в центре поля зрения объектива. После этого производят микроскопирование с объективом 40.

Приготовление окрашенных препаратов

Приготовление мазка заключается в следующем.

На середину чистого обезжиренного стекла наносят стерильной петлей жидкую бактериальную культуру или каплю стерильной водопроводной воды и вносят в нее бактерии, взятые из колоний кончиком стерильной бактериологической петли. Полученную слабо-мутную бактериальную суспензию равномерно распределяют тонким слоем на поверхности предметного стекла на площади 2 см2.

Высушивание мазка осуществляют при комнатной температуре или (для ускорения) в потоке теплого воздуха над небольшим пламенем горелки (мазком вверх), не допуская нагрева стекла.

Фиксацию мазка осуществляют термическим и химическим способами. При термическом способе стекло с высушенным мазком проводят 3-4 раза через пламя горелки той стороной, где нет мазка.

При химическом способе мазки микробов фиксируют метиловым спиртом, этиловым спиртом, смесью этилового спирта и эфира в пропорции 1:1 и другими веществами погружением предметного стекла с мазком в жидкость на определенное время.

Цель фиксации – убить клетки микроорганизмов и прикрепить их к стеклу. Мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Окрашивание мазка можно осуществить разными способами, которые делят на простые и сложные. При простом окрашивании препарата на охлажденный зафиксированный мазок наносят 2-3 капли раствора какой-либо краски. После окрашивания мазка в течение 30-60 с краску смывают струёй воды из промывалки.

Окрашенный препарат высушивают фильтровальной бумагой, прикладывая ее к мазку с обеих сторон. Микроскопируют окрашенный препарат в иммерсионной системе микроскопа. При сложных способах окрашивания применяют два или более красящих веществ. Эти способы эффективны при выявлении деталей строения микроорганизмов и их дифференциации.

Окраска по Граму имеет большое практическое значение для изучения микроорганизмов и их дифференциации.

Техника окрашивания по Граму.

1. На предметном стекле готовят фиксированный мазок (так же, как и для простой окраски).

2. На фиксированный мазок наносят 2-3 капли краски Грама (карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового) через полоску фильтровальной бумаги.

Через 1-2 мин ее снимают, а краситель сливают и аккуратно смывают водой. Если имеется фильтровальная бумага, заранее подготовленная и пропитанная краской Грама, то ее накладывают на мазок и наносят 2-3 капли воды.

Через 1-2 мин ее снимают и препарат аккуратно промывают водой.

3. Наносят 3-4 капли раствора Люголя и через 1 мин его сливают, не смывая водой.

4. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

5. Промывают препарат водой.

6. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

7. Микроскопируют препарат.

В результате окрашивания препарата по методу Грама одни виды бактерий (также дрожжи и актиномицеты) окрашиваются в фиолетовый цвет (Грам+), а другие в красный цвет (Грам-).

В фиолетовый цвет окрашиваются те микроорганизмы, в цитоплазме и цитоплазматической мембране которых содержатся вещества, прочно связывающие краску Грама+ йод (из раствора Люголя). Клетки таких микробов не обесцвечиваются спиртом за 20-30 с.

В красный цвет окрашиваются микроорганизмы, в цитоплазме которых нет веществ, прочно фиксирующих краску Грама+ йод. Такие клетки обесцвечиваются при обработке спиртом, поэтому окрашиваются фуксином Пфейфера.

Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового с йодом. Это зависит от различий в химическом составе и в проницаемости клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также от соотношения РНК и ДНК в их цитоплазме.

В клеточной стенке грамположительных бактерий наиболее выражен муреиновый (мукопептидный) слой, содержащий гликопептиды и тейхоевую кислоту. Пептидогликаны грамположительных бактерий структурно отличаются от грамотрицательных бактерий. Тейхоевые кислоты стабилизируют ионы магния на поверхности клеток.

У грамположительных бактерий на поверхности клетки имеется комплекс протеин-рибонуклеат магния; соотношение РНК и ДНК в их цитоплазме составляет 8:1; у грамотрицательных бактерий это соотношение равно 1:1. Изоэлектрическая точка цитоплазмы у грамположительных бактерий находится при рН 2,0-3,0; у грамотрицательных – около 5,0.

После обработки раствором йода, являющегося окислителем, происходит сдвиг изоэлектрической точки в кислую сторону, выраженный у грамположительных бактерий в большей степени, чем у грамотрицательных.

Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных бактерий создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом.

К грамположительным бактериям относятся стафилококки, стрептококки, коринебактерии дифтерии, микобактерии туберкулеза и другие, к грамотрицательным – гонококки, менингококки, кишечная палочка и т. д. Некоторые виды бактерий могут окрашиваться по Граму вариабельно в зависимости от возраста, особенностей культивирования и других факторов, изменяющих структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по Граму, состоит в переобесцвечивании или недообесцвечивании мазка спиртом.

В первом случае грамположительные бактерии могут утрачивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицательных бактерий) в результате последующей докраски мазка фуксином.

Во втором случае грамотрицательные бактерии могут сохранять синефиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания. Микроскопируют препарат в иммерсионной системе.

Техника микроскопирования окрашенных препаратов

Особенностью микроскопирования окрашенных препаратов является следующее: препарат кладут на предметный столик так, чтобы мазок был на верхней стороне стекла; микроскопирование производят при наилучшем освещении поля зрения (конденсор поднят вверх до предела) с иммерсионным объективом 90.

При работе с иммерсионным объективом 90 на препарат наносят каплю иммерсионного масла, а затем с помощью микрометрического винта осторожно опускают тубус с центрированным объективом 90 так, чтобы его фронтальная линза погрузилась в каплю масла, фокус был ниже препарата (мазка). Затем, глядя в окуляр, тем же винтом очень медленно поднимают тубус (на сотые доли миллиметра), пока не увидят изображение микробов. Точную остановку препарата в фокус объектива производят с помощью микрометрического винта.

По окончании работы удаляют салфеткой из мягкой ткани иммерсионное масло с фронтальной линзы объектива 90, для более полного удаления масла фронтальную линзу протирают салфеткой, смоченной смесью спирта и эфира в пропорции 1:1, или экстракционным бензином, а затем протирают объектив досуха. Только после этого можно ставить микроскоп в шкаф или ящик для хранения.

Контрольные вопросы

1. Какое лабораторное оборудование используется для изучения морфологических свойств микроорганизмов?

2. Какова цель приготовления окрашенных препаратов?

3. Какие краски применяют для окраски бактерий?

4. Каков порядок приготовления препарата (мазка) для окрашивания?

5. Каковы сущность и техника окраски препаратов по методу Грама?

Оформление отчета

Отчет должен содержать:

1. Цель работы.

2. Наблюдаемую микроскопическую картину исследуемых препаратов окрашенных микроорганизмов.

Приложение А

К лабораторной работе № 2. Приготовление растворов красок, применяемых для окрашивания препаратов микроорганизмов

Для окрашивания мазков применяют растворы различных красок.

Карболовый фуксин Циля готовят смешиванием 100 мл 5 %-го раствора кристаллической карболовой кислоты и 10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина основного.

Фуксин Пфейффера готовят в день его использования; одну часть фуксина Циля смешивают с девятью частями дистиллированной воды.

Метиленовый синий (голубой) по Леффлеру: к 100 мл водного раствора КОН (0,01 %) добавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора металенового голубого (10 г краски на 100 мл 96 %-го этилового спирта).

Краску Грама готовят растворением 1 г генцианвиолета в 10 мл 96 %-го этилового спирта; полученный раствор добавляют к 100 мл 5 %-го раствора очищенной карболовой кислоты и после выдержки в течение 24 ч фильтруют.

Удобно пользоваться генцианвиолетом на бумажках (по Синеву); тонкие листы фильтровальной или газетной бумаги (на стекле) обливают 1-2 %-м спиртовым раствором этой краски, листы высушивают при температуре 18-20 °С и разрезают на прямоугольники 2×4 см. Хранят бумажки в банке с притертой пробкой.

Раствор Люголя: 2 г йодистого калия растворяют в 5 мл дистиллированной воды, затем вносят 1 г йода и доводят объем дистиллированной водой до 300 мл.

Источник: https://lifelib.info/microbiology/biotechnology/2.html

Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Руководство к практическим занятиям по микробиологии ( малый практикум) Ульяновск 2003 удк 619 616. 9

Приготовление окрашенных препаратов бактерий: Приготовление окрашенных препаратов складывается из нанесения

Подборка по базе: ПКБ ЦТ.06.0046 Руководство по ремонту Ермаков.docx, Лекция по практическим печать.docx, Тексты к семинарским занятиям.doc, МУ к практическим работам Архитектура КС.docx, МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ И ЗАДАНИЯ К СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО ФИ, Adobe Photoshop. Руководство, практика..doc, Тополянский А.В.

, Вёрткин А.Л. – Пороки сердца. Руководство для , Методическое руководство по проведению экспертизы действующих но, 96 Руководство Код Красный – организация действий при пожаре (1), МУ к практическим.docx.
Цель занятия. Овладеть методикой приготовления мазка-препарата для микроскопии из микробной взвеси.

Ознакомиться с методами приготовления красящих растворов. Отработать методику простого метода окраски приготовленных препаратов.

Материалы и оборудование.

Набор красок, спирт ректификат 96,6%, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, предметные стекла, бактериологические петли, пинцеты, пробирки с микробными взвесями, микроскопы.

МИКРОСКОПИЯ БАКТЕРИЙ В ОКРАШЕННОМ ВИДЕНа предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.

Приготовление мазков. Исследуемый материал распределя­ют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обез­жиренного стекла.

Мазки готовят из культур микробов, патологического ма­териала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов. Приготовление препарата для микроскопии складывается из следующих этапов: 1.

Приготовление мазка на обезжиренном предметном стекле. 2.Высушивание препарата. 3.Фиксация мазка.4. Окраска мазка.В правильно приготовленном препарате микробные клетки должны быть расположены в один слой.

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды и из жид­кого патологического материала (моча и др.). Маленькую каплю исследуемой жидкости на­носят бактериальной петлей на предметное стекло и круго­выми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.2. Приготовление мазков из крови. На пред­метное стекло, ближе к одному из его концов, наносят кап­лю крови. Второе – шлифованное – стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно рас­пределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Толщина мазка зависит от величины угла между стеклами: чем острее угол, тем тоньше мазок. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и оди­наковую толщину на всем протяжении.

3. Приготовление толстой капли. На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца.

Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериальной петлей так, чтобы диаметр об­разующегося мазка соответствовал величине копеечной мо­неты. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови.

Кровь в “толстой капле” распределяется не равномерно, образуя неровный край.

4. Приготовление мазка из вязкого мате­риала (мокрота, гной). Мокроту или гной, нанесенные на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг другу. После этого свободные концы стекол захватывают 1 и 2 пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу. Получаются мазки с равномерно распределённым материалом, занимающим большую часть. 5. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидко­сти стала слегка мутноватой. После этого излишек микроб­ного материала на петле сжигают в пламени горелки и при­ступают к приготовлению мазка по описанному выше способу.

6. Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому ме­сту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами.

Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты. Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный при соскабливании материал распределя­ют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем пли бактериальной петлей.

Для изучения взаимного расположения элементов ткани и находящихся в ней микроорганизмов делают мазки-отпе­чатки.

Для этого вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают по­верхностью среза к предметному стеклу несколько раз по­следовательно, получая, таким образом, ряд мазков-отпе­чатков.

Рис. 4 Схема приготовления препарата-мазка

Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают и после высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются.

Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение средств, вызывающих коагуляцию белков

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или 1 и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки.

Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикла­дывают к тыльной поверхности левой кисти.

При правиль­ном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют химические вещества такие как: Безводный метиловый спирт. Этиловый (винный) спирт 96%. Жидкость Никифорова (смесь спирта и наркозного эфира в соотношении 1:1). Жидкость Карнуа (спирта 96% 60 мл, хло­роформа 30 мл, уксусной кислоты ледя­ной 10 мл)

Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.

Техника окраски мазков.

Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой, что предложено А. И. Синевым.

Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски.

Окраска мазков красящей бумагой. На высу­шенный и фиксированный препарат наносят несколько ка­пель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2х2 см.

В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется мето­дом окраски.

По окончании окраски бумагу осторожно сни­мают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.

Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь ма­зок.

При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание произ­водят через фильтровальную бумагу, задерживающую части­цы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор краси­теля.

Краски, применяемые в микробиологическойпрактике. Для окрашивания микробов используют анилиновые красители (основные, кислые и нейтральные). Микроорганизмы лучше окрашиваются основными красками. Для окраски препаратов готовят спиртовые, водно-спиртовые и водные растворы. В некоторых случаях добавляют в качестве протравы карболовую кислоту, щелочь и др. Наиболее часто употребляемыми красителями являются следующие:Синие – метиловый синий, водный синий, опаловый синий;красные – фуксин основной, конго красный, сафранин, нейтральный красный, фуксин кислый;

фиолетовые – метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, генцианвиолет;

зеленые – малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый, светло-зеленый; желто-коричневые – хризоилин, везувин.При простом методе окраски на фиксированный мазок наливают несколько капель какого-либо спиртоводного или водного раствора красок на 1—2 минуты; чаще всего для этой цели применяется фуксин 1: 10 или леффлеровская метиленовая синька.

Затем краску смывают дистиллированной водой и мазок обсушивают между двумя полосками фильтровальной бумаги. Обычно Фуксином I: 10 красят 10—30 секунд, а метиленовой синькой – 2-10 мин. Фуксин окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты.

Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Вообще же продолжительность окраски зависит от вида и качества красящего раствора, степени восприимчивости микроба к окраске и толщины мазка.

При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Фуксин и генцианвиолет относятся к более интенсивно окрашивающим краскам; метиленовая синька окрашивает зна­чительно бледнее.

Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Большинство микробов легко и быстро окрашивается водными или спиртоводными растворами красок.Для повышения красящей способности воздействуют на краску высо­кой температурой (нагреванием) до появления паров (вплоть до кипения).

Варьируя степень нагревания, можно получать различные степени силы окраски. Удлинение срока воздействия красящего раствора на объект также может в известной мере усилить степень окраски.

Мытье предметных и покровных стекол. Предметные и по­кровные стекла должны иметь абсолютно чистую поверхность и быть хорошо обезжиренными.

Капля воды, нанесенная на обезжиренное стекло, растекается равномерно, а на плохо обезжиренном стекле распадается на мелкие капельки. Пред­метные и покровные стекла рекомендуется мыть и ополаскивать в резиновых перчатках, чтобы не загрязнять их жиром, находящимся на поверхности кожи.

Стекла предметные и покровные, не бывшие в употребле­нии, моют в теплой мыльной воде и после споласкивания за­ливают смесью Никифорова.

Если стекла, выну­тые через 2—3 дня из смеси Никифорова, сохраняют следы жира, их складывают в фарфоровую чашечку, заливают 2—5 % раствором гидрокарбоната натрия или едкого натра, ставят на слабый огонь и кипятят, считая от момента закипания воды, в течение 20—30 мин. После кипячения в щелочном растворе стекла ополаскивают проточной водопроводной во­дой, опускают на 10—15 мин в 5—10% раствор хлористо-водородной кислоты и затем промывают проточной водой. Предметные и покровные стекла, бывшие в употреблении, загрязненные краской и иммерсионным маслом, обрабатыва­ют следующим способом:

-опускают на 2 ч в концентриро­ванную серную кислоту или хромовую смесь, затем тщатель­но промывают проточной водопроводной водой;-заливают 5% раствором гидрокарбоната натрия или щелочи (едкое ка­ли или едкий натр), ставят на слабый огонь и кипятит в те­чение 30—40 мин.

Источник: https://topuch.ru/rukovodstvo-k-prakticheskim-zanyatiyam-po-mikrobiologii--malij/index2.html

Микроскопия микробиологических препаратов

Приготовление окрашенных препаратов бактерий: Приготовление окрашенных препаратов складывается из нанесения

Микроскопическое исследование клинических образцов (мокроты, гноя, отделяемого из ран, ликвора и пр.

) является важным этапом микробиологического анализа, позволяющим получить предварительные данные о качественном и количественном составе микрофлоры в патологическом матери­але, а также оценить соответствие материала очагу воспаления. Иногда микроскопия помогает выявить микробы, не растущие на обычных питательных средах.

Микроскопия мазков из чистых культур бактерий позволяет определить их морфологию, что наряду с окраской по Граму является важным ориентиром в выборе направления последующей их идентификации.

При изучении микробиологических объектов чаще используют световую микроскопию окрашенных препаратов под иммерсией (объектив х 90).

При микроскопии в темном поле эффект создается при помощи специального конденсора-параболоида или обычного конденсора с прикрытой кружком черной бумаги центральной частью, а объект кажется светящимся на фоне темного поля зрения. Препарат готовят по типу раздавленной или висячей капли; применяется для индикации спирохет, боррелий, лептоспир.

Фазово-контрастная микроскопия может использоваться для изучения без предварительной обработки бесцветных, прозрачных объектов (живых клеток, срезов тканей и т.п.), детали строения которых оптически мало различаются между собой.

Суть метода заключается в том, что с помощью специального устройства конденсора и объектива разность фазовых колебаний, проходящих через биологический объект и окружающую среду световых волн, недоступных человеческому глазу, преобразует­ся в разность интенсивностей (амплитуд) света, благодаря чему детали строения объекта становятся видимыми. Метод аноптральной микроскопии является дальнейшим развитием метода фазового контраста (в его основе сохраняется тот же принцип) и отличается большей разрешающей способностью объективов и возможностью выявления минимальных оптических разностей плотности в неокрашенных препаратах.

Люминесцентная микроскопия позволяет получить цветное изображение самосветящихся объектов на черном фоне свысокой степенью их контрастности с помощью люминесцентного микроскопа.

Она основана на явлении флюоресценции (или люминесценции), когда некоторые вещества под влиянием падающего на них света испускают лучи с другой (обычно большей) длиной волны. Поэтому вещества, имеющие определен­ный цвет при обычном освещении, при освещении ультрафиоле­товыми лучами приобретают совершенно иную окраску.

Объект, не видимый в ультрафиолетовом свете, может пробрести яркий блеск после обработки его флюоресцирующим веществом (флюорохромом). В таком препарате сила свечения объектов бывает различной, но чаще всего она невелика, поэтому люминесцентную микроскопию следует проводить в затемненном помещении.

В зависимости от используемого флюорохрома применяют строго определенный набор светофильтров. Важно ис­пользовать специальное нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

Для обнаружения и идентификации бактериальных антигенов ис­пользуют меченые флюорохромом иммунные сыворотки в реакциях прямой и непрямой иммунофлюоресценции.

Приготовление препаратов для микроскопии

От качества приготовления препарата во многом зависит ре­зультат микроскопии.

Предметные и покровные стекла должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Это достигается разными способами, из которых наиболее доступны нижеследующие:

• стекла кипятят 15 мин в 1% растворе соды (или в мыльной воде), споласкивают водой, помещают в слабую соляную кислоту и, наконец, хорошо промывают водой;

   •    стекла обрабатывают жидкостью следующего состава: калия бихромат 20 г, серная кислота (техническая) 20 г, вода 200 мл; после 20 минут кипячения в этой смеси промывают стекло водой, а затем спиртом. Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси рав­ных количеств спирта и эфира, или в 96° спирте, или промытыми и вытертыми досуха.

Микроорганизмы можно исследовать в живом состоянии ив окрашенных препаратах.

а) Исследование микроорганизмов в живом состоянии про­водят для изучения формы и подвижности бактерий либо в

висячей, либо в раздавленной капле.

Для висячей капли необходимо иметь специальное предметное стекло с луночкой.

Маленькую капельку бульонной культуры наносят на покровное стекло; если исследуют агаровую культуру, то на покровное стекло предварительно наносят небольшую каплю воды или физиологического раствора, куда затем вносят петлей незначительное количество бактерий и размешивают их. Можно заранее приготовить взвесь культуры в физиологическом растворе и взять капельку из нее. И в том, и в другом случае на покровное стекло накладывают предметное стекло так, чтобы капля оказалась в луночке, края которой предварительно смазы­вают вазелином. Стерла слегка прижимают друг кдругу, в резуль­тате чего они склеиваются, образуя герметически закрытую камеру, в которой капля долго не высыхает. Препарат микроскопируют покровным стеклом кверху.

Для раздавленной капли пользуются простым предметным стеклом, куда наносят материал (физиологический раствор и культуру), накрывая его покровным стеклом.

Капельки нужно брать такой величины, чтобы они заполняли все пространство между стеклами и не выступали за края покровного (избыток материала удаляют фильтровальной бумагой). Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной.

Для микроскопии лучше использовать фазово-контрастную или ант-ропольную установку.

б) Исследование окрашенных препаратов позволяет не толь­
ко изучить морфологию бактерий, но и судить о некоторых деталях их химического строения, что достигается применением специальных красок.

Для приготовления препаратов из жидких культур каплю мате­риала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде берут петлей ничтожное количество и раз­мешивают в заранее нанесенной на стекло капле воды или физиологического раствора, размазывая по стеклу до диаметра мазка 1,5-2 см.

Мазок высушивают на воздухе, затем его фиксируют (в этом случае мазок будет хорошо держаться на стекле, а убитые бактерии лучше воспринимают окраску). Самый простой и распространенный способ – фиксация жаром.

Держа стекло мазком вверх, его трижды проводят через пламя газовой или спиртовой горелки (время фиксации не должно превышать 5-6 сек, а время прямого воздействия пламени – 2 сек). Во избежание перегрева препарата контролем может служить прикосновение стекла к тыльной поверхности ладони (должно быть ощущение легко переносимого жжения).

Для фиксации можно использовать химические вещества: этиловый 95° спирт (время фиксации 10-15 мин), метиловый спирт (2-3 мин), ацетон (5 мин), смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира по Никифорову (10-15 мин) и др.)

Источник: https://apexlab.ru/articles/root/mikroskopija-mikrobiologicheskih-preparatov/

Методы приготовления и окрашивания микроскопических препаратов

Приготовление окрашенных препаратов бактерий: Приготовление окрашенных препаратов складывается из нанесения

Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми бактериями в окрашенном и неокрашенном состоянии.

С целью изучения формы и подвижности бактерий микроскопию микроорганизмов можно проводить в живом состоянии без окрашивания. Для этого готовят мазки «раздавленная» и «висячая» капля и наблюдают их с помощью темнопольной и фазово-контрастной микроскопии.

Приготовление мазка «раздавленная капля».На предметное стекло по центру наносят каплю или жидкой культуры или физ.раствора, в который вносят исследуемую культуру. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают с помощью покровного стекла.

Затем на покровное стекло наносим каплю иммерсионного масла и микроскопируем. При фазово-контрастной микроскопии мы будем наблюдать подвижность и форму бактерий темного цвета на светлом фоне.

При темнопольной микроскопии – подвижность и форму бактерий светлого цвета на темном фоне.

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют и после этого окрашивают.

Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой–либо одной краски (или метиленового синего или фуксина). Сложные методы предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения).

Предметные и покровные стекла, употребляемые для приготовления препаратов должны быть чистыми и хорошо обезжиренными (с помощью хозяйственного мыла).

Из жидких культур каплю материала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде петлей берут частичку, размешивают в заранее нанесенной на предметное стекло капле физиологического раствора и размазывают по стеклу.

Мазку дают высохнуть на воздухе, затем его фиксируют над пламенем спиртовки (горелки), держа стекло мазком вверх, и трижды проводят через пламя спиртовки. Время фиксации не должно превышать 5-6с. Кроме жара, для фиксации используют 96 град. спирт, погружая в него мазок на 15-20мин.

После фиксации мазок готов к окрашиванию.

Методика окраски по Граму.Особенностью окраски по Грамму является неодинаковое отношение различных микробов к красителям. Микробы, входящие в группу грамположительных, например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с красителями и йодом.

Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Это объясняется строением клеточной стенки грамположительных бактерий.

Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты.

Грамотрицательные бактерии (гонококки, менингококки, возбудители кишечных заболеваний) образуют с генциановым фиололетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином в красный цвет. Клеточная стенка таких бактерий представлена тонким слоем пептидогликана.

1. На фиксированный мазок наносят раствор генцианового фиолетового на 2мин.

2. Затем сливают краситель и, не промывая мазок, наливают раствор Люголя на 1мин.

3. Сливают раствор Люголя и наносят на 30сек 96 град спирт, пока не перестанет отходить краситель.

4. Мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают в течении 2 мин раствором фуксина.

5. После чего сливают краситель, мазок промывают водой и высушивают. Грамположительные бактерии окрашиваются в синий (фиолетовый) цвет, а грамотрицательные бактерии – в красный.

Методика окраски по Бурри-Гинсу.Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Данная окраска служит для выявления у бактерий капсул.

1. На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.

2. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и фиксируют над пламенем горелки.

3. Затем промывают дистиллированной водой и красят 5-10 мин фуксином.

4. Затем вновь мазок промывают водой и высушивают. При микроскопии бактерии окрашиваются в красный цвет, фон черный, а капсулы неокрашенные.

Методика окраски по Ожешко.Этот метод служит для выявления у бактерий спор. Споры имеют вид круглых или овальной формы образований, находящихся в теле микробной клетки.

Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное – спора находится в центре тела микроба, субтерминальное – спора расположена ближе к одному из ее концов, терминальное – спора располагается на конце палочки.

1. На высушенный нефиксированный мазок наливают 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2мин над пламенем горелки до закипания.

2. Остывший препарат промывают водой, высушивают и фиксируют над пламенем спиртовки.

3. Затем на мазок наносят раствор фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до отхождения паров.

4. После того как препарат остынет, обесцвечивают его 5% раствором серной кислоты, промывают водой и докрашивают метиленовым синим в течении 3-5 мин, затем промывают водой и подсушивают. Споры, окрашенные фуксином имеют красный цвет, тело микробной клетки – синий цвет.

Методика окраски по Цилю-Нильсенудля кислотоустойчивых бактерий (возбудители туберкулеза и проказы). Особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску. Для того чтобы окрасить кислотоустойчивые микроорганизмы, приходится применять более концентрированные растворы красителя в подогретом состоянии с протравами и удлиненным сроком окраски.

1. Фиксированный над пламенем спиртовки мазок окрашивают в течение 3-5мин фуксином Циля с подогреванием до появления паров.

2. Дают препарату остыть, промывают водой.

3. Обесцвечивают в течение 3-5 с в 5% растворе серной кислоты.

4. Препарат промывают водой.

5. окрашивают метиленовым синим в течение 3-5 мин.

6. Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.

При окраске препаратов по методу Циля-Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново- красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты становятся бесцветными и приобретают цвет дополнительного красителя (синий).

Тесты по теме:

1. Метод окрашивания для выявления капсул:

а) Ожешко

б) Бурри-Гинсу

в) Граму

г) Цилю- Нильсену

д) Нейссеру

2. Метод окрашивания для выявления спор:

а) Ожешко

б) Бурри-Гинсу

в) Граму

г) Цилю- Нильсену

д) Нейссеру

3. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются по методу:

а) Ожешко

б) Бурри-Гинсу

в) Граму

г) Цилю- Нильсену

д) Нейссеру

4. Дифференциально-диагностическая окраска бактерий:

а) Ожешко

б) Бурри-Гинсу

в) Граму

г) Цилю- Нильсену

д) Нейссеру

5. Перечислить грамположительные бактерии:

а) стафилококки, клостридии

б) кишечная палочка, сальмонелла

в) стрептококки, гонококки

6. Перечислить грамотрицательные бактерии:

а) менингококки, гонококки

б) кишечная палочка, стафилококки

в) стрептококки, сальмонеллы

7. Перечислить спорообразующие бактерии:

а) сибирская язва, клостридии

б) пневмококки, стрептококки

в) клебсиелла, стафилококки

8. Перечислить капсулообразующие бактерии:

а) пневмококки, клебсиелла

б) сибирская язва, стрептококки

в) шигеллы, сальмонеллы

Дата добавления: 2017-03-29; просмотров: 1533; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ

ПОСМОТРЕТЬ ЁЩЕ:

Источник: https://helpiks.org/9-8932.html

Medic-studio
Добавить комментарий