Приготовление сывороток и растворов для иммунолюминесцентной окраски

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Приготовление сывороток и растворов для иммунолюминесцентной окраски

Сущность иммунофлуоресцентной микроскопии заключается в появлении специфического свечения комплекса антиген-антитело в случаях сине — и ультрафиолетового света при условии использования антител, соединенных с флуоресцирующим красителем.

На предметное стекло с мазком из исследуемого материала или гистологическим срезом наносят специфическую сыворотку, меченную флуоресцирующим красителем. Если в препарате содержатся микроорганизмы, специфически родственные меченому антителу, то происходит их связывание.

Возникающая комбинация достаточно прочна и сохраняется в процессе тщательного промывания препарата от избытка меченой сыворотки.

Присутствие специфически локализованного свечения, выявляемого под люминесцентным микроскопом, указывает на наличие антигена; при его отсутствии свечения в поле зрения микроскопа не наблюдается.

Наиболее часто применяют два метода иммунофлуоресцентного окрашивания: прямой и непрямой.

При прямом методе на препарат наносят флуоресцирующий конъюгат, разведенный до требуемого титра, при непрямом — препарат обрабатывают иммунной нефлуоресцирующей сывороткой.

Антитела, преципитированные на антигене, выявляют обработкой флуоресцирующей сывороткой, иммунной к γ-глобулинам того вида животного, от которого получена нефлуоресцирующая сыворотка.

Метод иммунофлуоресценции высокочувствителен и позволяет обнаруживать минимальные количества микроорганизмов в исследуемом материале. Указанный метод незаменим при диагностике смешанных бактериально-вирусных заболеваний насекомых, когда число образующихся в пораженных клетках включений незначительно, а также при анализах яиц, личинок младших возрастов и мелких насекомых.

При вирусных заболеваниях методы обычной микроскопии не всегда позволяют уверенно дифференцировать вирусные тельца-включения от белковых клеточных включений и некоторых продуктов метаболизма. Так, в кишечнике пилильщиков в фазе имаго обнаруживается масса образований белковой природы, которые окрашиваются по методам Швецовой и Похила аналогично полиэдрам.

В микробиологии насекомых метод иммунофлуоресценции впервые применен для обнаружения риккетсий Провачека в кишечнике платяной вши.

В дальнейшем с помощью иммунофлуоресценции неоднократно обнаруживались энтомопатогенные микроорганизмы в различных насекомых.

Применение метода флуоресцирующих антител позволило обнаружить полиэдренный антиген в яйцах тутового шелкопряда и определить его локализацию.

Приготовление иммунных сывороток. Для получения качественных антител против инклюзионных вирусов используют высокоочищенные от посторонних примесей полиэдры и гранулы из больных или погибших насекомых. Если насекомые крупные (гусеницы последних возрастов коконопрядов, шелкопрядов, некоторых совок и др.

), то целесообразно использовать гемолимфу. Гемолимфу больных насекомых смешивают с равным объемом воды, тщательно взбалтывают и многократно центрифугируют. Значительно чаще изолируют тельца-включения из мертвых инфицированных личинок насекомых.

Для этого трупы гомогенизируют, смешивают с тройным количеством водопроводной воды и оставляют на 2—3 недели при температуре 30°С для более полной дезинтеграции тканей личинок и освобождения вирусных включений. Гомогенат фильтруют через несколько слоев марли, и фильтрат центрифугируют в течение 15—20 мин при 4 тыс.

об/мин до просветления надосадочной жидкости. Осадок многократно промывают и в дальнейшем очистку ведут в градиенте плотности сахарозы.

Для получения иммунных сывороток обычно используют кроликов, так как в Институте микробиологии и эпидемиологии им.

Гамалеи АМН СССР налажено массовое производство меченной изотиционатом флуоресцеина ослиной сыворотки против γ-глобулинов кролика, которую применяют при непрямом методе окрашивания препаратов.

Обескровливают кроликов на 10-е сутки после последней инъекции. Для стимуляции продукции антител животным вводят в мышцу бедра одновременно с последней инъекцией адъювант Фрейнда.

Получение флуоресцирующих антител. Для получения желаемого эффекта при использовании метода флуоресцирующих антител необходимо выделение из сывороток глобулиновых фракций. Их выделяют высаливанием насыщенными растворами химически чистого сернокислого аммония.

Весь процесс состоит из следующих этапов: сыворотку смешивают в равных объемах с раствором сернокислого аммония, который добавляют по каплям при постоянном перемешивании смеси; выпавший осадок отделяют центрифугированием или фильтрацией, растворяют в физиологическом растворе, равным по объему исходной сыворотке, и диализируют против физиологического раствора (для этого раствор глобулиновых фракций в герметично перевязанном целлофановом пакете помещают в сосуд с физиологическим раствором, который меняют несколько раз в сутки); диализ проводят до полного удаления из раствора сернокислого аммония. Для контроля применяют химическую пробу на сульфатные анионы с использованием хлористого бария или реактива Несслера. Все операции с сывороткой и глобулиновыми фракциями выполняют на холоде.

Метку полученных глобулиновых фракций осуществляют изотиоционатом флуоресцена. Предварительно необходимо определить содержание белка в растворе глобулина (используют биуретовый метод как наиболее простой).

В зависимости от результатов биуретовой реакции готовят 1%-ный раствор белка концентрированием или разбавлением раствора, добавляют 10% 0,5-молярного раствора карбонатного буфера с pH = 9,0 и медленно на холоде вносят порошок изотиоционата флуоресцена из расчета 0,05 мг порошка на 1 мг белкового раствора. Колбу со смесью помещают на магнитную мешалку и держат в течение 10—12 ч при температуре 4° С. Избыток связавшегося с белком красителя удаляют диализом против физиологического раствора в течение 1—2 суток. Полученный конъюгат центрифугируют и консервируют мертиолятом в отношении 1 : 10 000.

При иммунофлуоресцентных исследованиях материала нередко возникает неспецифическое свечение. Особенно часто спонтанная флуоресценция наблюдается при исследовании фиксированных препаратов. Для исключения неспецифического свечения сыворотку обрабатывают обезвоженным порошком, приготовленным из тканей здоровых насекомых.

Для этого личинок, у которых предварительно удаляют кишечник, гомогенизируют с равным объемом 0,15 молярного раствора хлористого натрия, добавляют 4 объема ацетона и взбалтывают. Затем центрифугируют 5 мин при 2000 об/мин.

Надосадочную жидкость отсасывают, а осадок повторным центрифугированием промывают 2—3 раза солевым раствором, затем 2 раза ацетоном и фильтруют. Фильтровальную бумагу с осадком высушивают 10—12 ч при температуре 37° С. Высушенный порошок хранят в холодильнике в закрытых флаконах при —4° С.

Для адсорбции сыворотки смешивают 1 мл раствора флуоресцирующих антител с 0,1 г приготовленного порошка, сильно встряхивают в течение 30—60 мин и центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин.

Приготовление и окраска препаратов. Методом иммунофлуоресценции можно исследовать нативный и фиксированный материалы. Вирусные антигены выявляются также в парафинированных срезах.

Приготовление препаратов предъявляет особые требования к стеклам. Предметные стекла толщиной не более 1,2 мм тщательно обезжиривают и отбирают без царапин. Покровные стекла применяют наименьшего размера (15X15 мм) и толщиной не более 0,18 мм.

Исследованный тканевый материал должен сохранить структуру и свойства антигенных субстанций. Обычно для иммунофлуоресцентной микроскопии исследуют мазки из больных и погибших насекомых, кляч-препараты и гистологические срезы.

Для исследования мумифицированных насекомых приготовляют водную суспензию и удаляют грубые остатки тканей фильтрованием через несколько слоев марли. Мазки готовят из фильтрата. При минимальном содержании антигена в материале микроорганизмы концентрируют центрифугированием в течение 20—30 мин со скоростью 3000 об/мин.

Прямую окраску препаратов флуоресцирующей сывороткой осуществляют следующим образом. На помещенный во влажную камеру препарат наносят флуоресцирующую сыворотку в рабочем разведении, которое подбирают эмпирически — 1:8; 1:16.

Окраску продолжают 10—15 мин при температуре 37° С; затем сыворотку удаляют и препарат промывают дистиллированной водой в течение 3—5 мин.

В случае непрямой окраски исследуемого материала на препараты наносят иммунную сыворотку в соотношении 1:10; 1:20; 1:40 и оставляют при комнатной температуре на 15 мин во влажной камере.

Затем препарат тщательно промывают для удаления несвязавшейся иммунной сыворотки и подсушивают на воздухе. Сухую стандартную люминесцирующую антивидовую сыворотку растворяют в указанном на этикетке ампулы объеме дистиллированной воды. После растворения сыворотку центрифугируют 30 мин при 3000— 6000 об/мин.

Непосредственно перед меткой препарата люминесцирующую сыворотку разводят 0,15-молярного раствора хлористого натрия (рН = 7,2:7,4) в соответствии с рабочим разведением.

Метят антиген 15 мин, затем мазки тщательно промывают дважды в 0,15-молярном растворе хлористого натрия по 10 мин, ополаскивают в дистиллированной воде и подсушивают на воздухе.

Интенсивность свечения оценивается следующим образом:

++++ — очень яркая флуоресценция зелено-желтого цвета по периферии микроорганизма, четко контрастируемая с темным телом клетки;

+++ — яркая флуоресценция периферии клетки;

++ или + — слабое свечение периферии клетки, не контрастируемое с телом микроорганизма. Положительным результатом считается люминесценция, оцениваемая четырьмя и тремя крестами.

Как и при методе прямой окраски, параллельно окрашивают и просматривают контрольные препараты, т. е. препараты, заведомо не содержащие выявляемого антигена.

Полиэдренные тельца-включения ядерного и цитоплазматического происхождения, встречающиеся в патологическом материале, обнаруживают интенсивную люминесценцию по периферии; гранулы, меченные флуоресцирующими антителами, светятся отдельными точками.

Присутствие в исследуемых препаратах зелено-желтой люминесценции указывает на фиксацию флуоресцирующих антител на антигене, которым являются в рассматриваемых случаях инклюзионные вирусы. При анализах необходимо различать специфическую флуоресценцию антител с зеленоватой первичной флуоресценцией клеток и остатков тканей.

, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Источник: https://www.activestudy.info/immunofluorescentnaya-mikroskopiya/

Оборудование

Спектрофотометр-нефелометр

Хемилюминометр

Лабораторный микроскоп

Люминесцентный микроскоп

Центрифуга с горизонтальным ротором для выделения кле­точных популяций

96-луночные круглодонные и плоскодонные планшеты для иммунологических исследований

Титровальные планшеты

Автоматические пипетки-дозаторы с регулируемым объемом

на 10-50; 20-100; 100-500; 1000-5000 мкл

Пастеровские пипетки

Денситометр

Водяная баня

Магнитная мешалка

Камера Горяева

Счетчик форменных элементов крови

Пластиковые пробирки объемом 12 мл

Центрифужные пробирки

Термостат

СО2-инкубатор

Холодильник

Приготовление рабочих реактивов для микрометода определе­ния компонентов комплемента

Буфер хранить в холодильнике. Для приготовления рабочего раствора буфера (РРБ) к одному объему 5-кратного буфера добавить 4 объема дистиллированной воды.

Раствор “Глюгицир” для хранения эритроцитов (Гематологический научный центр, Москва).

Гемолитическая сыворотка (НПО “Биомед”, Пермь) перед проведением реакции разводится РРБ так, чтобы ее титр в 3 ра­за (тройной титр) превышал рабочий титр, указанный на эти­кетке. Например, при рабочем титре 1:3000 сыворотку следует разводить в 1000 раз.

Стандартную взвесь эритроцитов барана (109 кл/мкл) гото­вят из отмытых несколько раз холодным рабочим раствором веронал-мединалового буфера, центрифугируя по 5 мин при 3000 об/мин до получения совершенно бесцветной надосадочной жидкости. Лучше всего эритроциты барана в растворе “Глюгицир” залить РРБ и оставить на ночь в холодильнике до полного отстаивания.

Надосадок осторожно собрать пипеткой. К 1 объему осадка добавить 17 объемов РРБ. Для стандарти­зации взвеси эритроцитов барана 0,2 мл суспензии лизируют 2,8 мл дистиллированной воды. Оптическая плотность (ОП) лизата должна равняться 0,7 при длине волны 541 нм (в кювете толщиной 1 см против воды), что по концентрации гемогло­бина соответствует примерно 109 кл/мл.

Если ОП отличается от 0,7, то конечный объем, до которого необходимо развести имеющийся объем взвеси (Уисходн), оп­ределяют по формуле:

Если ОП больше 0,7, то к исходному объему взвеси добав­ляют РРБ до конечного объема, если ОП ниже 0,7, то необ­ходимый объем буфера отбрасывают после центрифугирования взвси.

Приготовление рабочей суспензии ЕА-комплекса (сенсиби­лизированных эритроцитов) в концентрации 1,5-108 кл/мкл.

К 10 мл взвеси отмытых, как описано выше, эритроцитов барана в концентрации 1∙109 кл/мл добавляют 10 мл гемоли­тической сыворотки, разбавленной РРБ согласно наставлению по применению, тщательно перемешивают и оставляют на 30 мин при 37°С, периодически перемешивая. Взвесь доводят до концентрации 1,5∙108 кл/мкл, добавляя 46,7 буфера.

Смесь 0,2 мл сенсибилизированных эритроцитов с 2,8 мл воды долж­на иметь поглощение 1,0 при длине волны 412 нм. Эритроциты хранят в течение 7 сут при температуре 6±2 °С и перед каждой постановкой отмывают РРБ и стандартизуют.

Подготовка сухих реагентов. Реагенты представляют собой лиофилизированную сыворотку крови человека, в которой отсутствует тестируемый компонент. Реагенты выпускают во флаконах по 0,5 и 1,0 мл.

Комплект состоит из 5 флаконов для определения активности С1, С2, СЗ, С4 и С5-компонентов комплемента. Реагенты растворяют дистиллированной водой при легком встряхивании до объема, указанного на этикетке.

Непосредственно перед титрованием готовят рабочее разведе­ние реагентов с помощью РРБ, как указано на этикетке.

Растворы, реактивы

Фосфатный буфер (рН 7,2) на тридистиллированной авто-клавированной воде:

7,0 г NaС1

2,0 г Na2НРO4

0,3 г КН2РО4 до 1000 мл Н2O.

0,1 М веронал-мединаловый буфер (рН 8,6)

0,8 г веронала растворить при нагревании в 700 мл дистил­лированной воды, добавить 4,5 г мединала и общий объем довести до 1 л.

Приготовление реактивов для исследования фагоцитарной ак­тивности нейтрофилов и субпопуляций лимфоцитов

Гепарин: 1 мл стандартного раствора с активностью 5000 ЕД в 1 мл разводят в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия (1,0 мл концентрированного гепарина смешивают с 9,0 мл изотонического раствора хлорида натрия). Хранят в холо­дильнике. При взятии крови в пробирку вносят 0,2 мл (200 мкл) разведенного гепарина и 10 мл венозной крови. Конечная концентрация – 10 ЕД в 1 мл крови.

Инкубационная среда – 20 % раствор сыворотки крупного рогатого скота на 0,85 % стерильном растворе №С1 готовят в день проведения исследования. Не хранить!

Раствор Хенкса без фенолового красного (НИИ полиомие­лита и вирусных энцефалитов, Москва).

Раствор нитросинего тетразолия для НСТ-теста: 4 мг НСТ (“Sigma”, мол.м. 817,6) смешивают с 1 мл фосфатного буфера (рН 7,2–7,4) или стерильного изотонического раствора хлори­да натрия. Для лучшего растворения помещают в термостат на 30–40 мин при 37°С. Фильтруют! Готовят непосредственно перед использованием. Необходимый объем раствора опреде­ляют исходя из числа исследуемых образцов крови.

Краситель – 1 % раствор метилового зеленого: 1 г метило­вого зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды, фильтруют и хранят в холодильнике.

Недостаточно очищенный краситель имеет фиолетовый цвет, от которого можно изба­виться, экстрагируя примеси хлороформом. Для этого смешать водный раствор красителя с равным объемом хлороформа и после расслоения аккуратно слить водную часть.

Повторить 2–3 раза до получения чистого зеленого цвета красителя. Про­цедуру проводить в вытяжном шкафу.

Опсонизированный зимозан. Используется зимозан, выпус­каемый для определения пропердина (НПО “Биохим-реактив”, Олайне). Готовят смесь сывороток 10 доноров. Готовят навеску зимозана из расчета 20 мг на 1 мл сывороточного пула.

Зимозан суспендируют в изотоническом растворе хлорида натрия (на 1 г зимозана – 100 мл раствора) и кипятят на водяной бане 30 мин.

Отмывают центрифугированием два раза 0,85 % раствором хлорида натрия и добавляют к свежеприго­товленной сыворотке 10 доноров до конечной концентрации 20 мг/мл, инкубируют 45 мин при 37°С, периодически встря­хивая.

Затем трижды отмывают путем центрифугирования рас­твором без кальция и магния, чтобы избежать агрегации клеток и ресуспендируют взвесь до первоначального объема. Приго­товленный зимозан разливают на аликвоты по 250 мкл и хра­нят при – 40–70°С на протяжении нескольких месяцев.

Раствор для отмывания клеток без Са2+ и Mg2+.

NaCl 8 г, KCl 0,4 г, Na2HPO4 0,4 г, К2РO4 0,4 г, 1 г глюкозы, 2,7 г HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N12-этансульфоновой кислоты) дистиллированной воды до 1 л (pH 7,0). Все растворы стерилизуют через мембранный фильтр.

Взвесь латекса с размером частиц 0,8–1,4 мкр для исследо­вания поглотительной активности нейтрофилов готовят на фосфатном буфере или на стандартном растворе Хенкса из стандартной 10 % взвеси. Рабочая концентрация латекса – 0,1 % (0,1 мл 10 % взвеси разводят в 10 мл буфера или раствора Хенкса).

Раствор фиколла и верографина (или урографина) для вы­деления клеток. Градиент с плотностью 1,076 г/см2 готовят следующим образом: к 20 г фиколла (“Pharmacia”, Швеция) добавить 50 мл 76 % раствора урографина (ФАО “Ферейн”, Россия) и 280 мл дистиллированной воды.

Градиент с плотностью 1,118 г/см2 готовят из предыдущего раствора с плотностью 1,076 г/см2, добавляя в него 76 % рас­твор урографина под контролем ареометра.

Рабочий раствор люминола для ХЛ анализа.

0,56 мМ люми-нола (“Aldrich”, США) готовят следующим образом: 10 мг люминола растворяют в 80 мл раствора Хенкса без фенолового красного на магнитной мешалке в течение 18 ч в темноте при комнатной температуре, затем раствором Хенкса доводят объ­ем до 100 мл. Разливают на аликвоты по 3 мл и хранят при температуре от –18 до –20 °С в течение нескольких месяцев.

0,5 % краситель генциановый фиолетовый на 3 % уксусной кислоте для подсчета лейкоцитов готовят следующим образом: 3 мл ледяной уксусной кислоты (МХК “Лаверна”, Москва) переносят в 97 мл дистиллированной воды, добавляют 0,5 г генцианового фиолетового (МХК “Лаверна”, Москва) и раство­ряют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 3 ч при комнатной температуре, фильтруют через бумаж­ный фильтр и хранят в холодильнике несколько месяцев.

Приготовление агара для реакции иммунодиффузии

Для получения 1,5 % агара навеску добавить в соответствую­щий объем 0,1 М веронал-мединалового буфера. Колбу со смесью помещают в кипящую водяную баню, смесь периоди­чески перемешивают, не позволяя агару оседать на дно. Агар считается готовым, когда он приобретает стекловидную про­зрачность.

Материалы для исследования ИФ-статуса

Среда Игла однократная или двойная

Среда RPMI-1640

Гентамицин (0,08 мг/мл)

Глутамин (0,3 мг/мл)

Бычья сыворотка – 2% в среде

Культура клеток фибробластов человека М19

Вирус болезни Ньюкасла, штамм Канзас (ВБН)

Вирус везикулярного стоматита, штамм Индиана (ВВС)

Фитогемагглютинин Р (ФГА), “Difco”, США

Поли(И).поли(Ц), “Sigma”, США

ДЭАЭ-декстран, “Upsula”, Швеция

Гепарин

1 N HCl, 1 N NaOH

Индикаторная бумага

Референс человеческого ИФ-α, ИФ-ß, ИФ-γ

Антисыворотки к человеческим ИФ-α, ИФ-ß, ИФ-γ

Источник: https://petritest.ru/spravochnik-mikrobiologa/labinskaya-obshchaya-i-sanitarnaya-mikrobiologiya/16-4-oborudovanie-dlya-provedeniya-immunologicheskikh-issledovanij-prigotovlenie-rastvorov-i-reaktivov

Medic-studio
Добавить комментарий