Разработка пористых матриц-носителей с использованием метода

Разработка пористых матриц-носителей с использованием метода двухфотонной фотополимеризации

Разработка пористых матриц-носителей с использованием метода

С начала 1990-х годов было известно, что воздействие на разные материалы ультракоротких лазерных импульсов, в частности фемтосекундных, значительно эффективнее, нежели воздействие лазерных импульсов большей длительности или лазерного излучения в непрерывных режимах.

Во-первых, фемтосекундные лазерные импульсы несут много большую пиковую мощность.

В обычных световых источниках света напряженность электрического поля световой волны находится в пределах 1 В/см, так что удлинение диполя при таких воздействиях не превышает 10в-16 м, много меньше характерных размеров атомов и молекул (10в-10-10в-8 м).

В то же время, напряженность электрического поля световой волны фемтосекундных лазерных импульсах достигает 10в8 В/см, что вполне достаточно для непосредственного разрыва химических связей.

С использованием фемтосекундных импульсов легко могут быть запущены различные нелинейные эффекты, в частности многофотонное поглощение, широко используемое при лазерных технологиях обработки материалов. Многофотонное поглощение реализуется лишь в очень малом 3D-oбъемe в окрестности фокуса.

И этот объем не превосходит λ3, где λ — размер длины волны. Тем самым при использовании фемтосекундных лазеров может достигаться при точечной экспозиции высокое 3D-пространственное разрешение.

Во-вторых, когда материалы находятся под воздействием фемтосекундных лазерных импульсов, энергия фотонов выделяется много быстрее, нежели электроны могли бы передать ее решетке, или атом-молекулярные колебания могли бы ее передать через эмиссию фононов, так что такое возбуждение оказывается как бы «теплоизолирующим».

Это обеспечивает идеальность оптического возбуждения в случае фотохимических или фотофизических реакций, для которых трудно-локализуемые термические эффекты крайне нежелательны.

В дополнение к этому, у многих диэлектрических материалов существует окно прозрачности в спектральной красной-ближнеинфракрасной области, которое не перекрывается ни электронным зона-зона-поглощением, ни поглощением атом-молекулярных колебаний.

Обычно длина волны фемтосекундных лазеров приходится на это окно прозрачности, например 680-1000 нм для титан-сапфирового лазера. Поэтому излучение фемтосекундного лазера может проникать во внутренние области структур, содержащих материал с определенными областями оптической прозрачности и инициировать различные процессы. Фотополимеризация начинается с поглощения кванта света фотоинициатором (PI), который распадается с образованием 2 радикалов (R•), которые, в свою очередь, разрывают непредельные связи мономера (Mn), обеспечивая постоянное образование радикалов и рост цепи олигомера (RMn).

PI → РI• → R * R * + Mn ->RMn.

Процесс начала полимеризации (сшивки) и последующего роста цепи идентичен как для полимеризации, индуцируемой с помощью традиционных источников света (например УФ-источников и т.д.), так и в случае использования нелинейных эффектов (например 2ФП).

Основное отличие этих методов заключается в том, что в первом случае полимеризация инициируется поглощением одного фотона, а во втором — возбуждение происходит при поглощении нескольких фотонов (т.е.

при практически одновременном поглощении 2 фотонов, что достигается с использованием ультракоротких лазерных импульсов).

На пространственное разрешение, с которым получаются структуры, оказывает влияние целый ряд факторов, среди которых: размер лазерного пятна, длина волны, мощность лазерного источника, частота и продолжительность лазерного импульса, а также его интенсивность. Если говорить о создании 3-мерных матриц, помимо вышеописанных факторов на линейные размеры структур влияет скорость и погрешность перемещения образца.

Эффект многофотонного поглощения применяется в различных областях технологии, в том числе для создания 3-мерной оптической памяти, изомеризации фотохромных материалов, проведения кавитационных процессов, создания оптических волноводов и т.д. Однако наибольшее распространение этот эффект получил в связи с разработкой метода 2-фотонной полимеризации (2ФП).

Оказалось, что с использованием этого метода можно получать структуры с пространственным разрешением порядка 100 нм. При этом для создания таких структур могут применяться композиции, которые подвергаются полимеризации при освещении обычным УФ-светом, хотя механизм возбуждения молекул в обычной полимеризации и 2ФП разный.

Такой подход позволяет получать скаффолды, избегая термических воздействий на полимерный материал и без использования легколетучих органических растворителей.

Метод 2ФП дает возможность получать объекты с высоким пространственным разрешением, эффективно управлять пористостью получаемых структур, что делает этот метод одним из наиболее перспективных подходов к решению проблемы формирования полимерных матриксов заданной формы для нужд регенеративной медицины.

Возможности метода 2ФП особенно важны для обеспечения культивирования клеток и транспорта питательных веществ в создаваемых матриксах. He менее важным аспектом формирования 3-мерных матриксов для регенеративной медицины является регулирование отношения скоростей формирования живых тканей и скорости биорезорбции синтетических имплантатов.

Если скорость роста тканей будет значительно превышать скорость биорезорбции имплантатов, то произойдет резкое замедление процесса регенерации, поскольку новообразованной ткани будет просто некуда расти.

В обратном случае произойдет потеря требуемой архитектоники объекта, что, в свою очередь, приведет к гибели тканеобразующих клеток и разрушению формирующегося межклеточного матрикса.

Регулирование скорости биодеградации 3-мерных структур обычно достигается использованием различных соотношений сополимеров, входящих в их состав , или точным регулированием размеров стенок и пор. В то же время, на скорость формирования нативной ткани в организме влияет применение биологически активных соединений, например факторов роста.

Наиболее перспективным метод 2ФП выглядит для создания 3-мерных скаффолдов для задач регенерации нервной ткани. Помимо описанных выше общих недостатков методов создания 3-мерных структур (использование органических растворителей, высоких механических и термических нагрузок и т.д.) существуют дополнительные требования, предъявляемы к скаффолдом для восстановления нервной ткани.

Известно, что размер пор для таких структур не должен быть слишком маленьким (менее 5 мкм), чтобы нервные клетки могли диффундировать внутрь скаффолда, и не должны быть слишком большими (более 100 мкм), чтобы клетки имели возможность высеваться на поверхность структуры.

Большинство традиционных методов формирования 3-мерных структур не позволяют напрямую регулировать размеры пор и их распределение в скаффолде, например, при использовании метода электроспиннинга или метода сублимационной сушки. Метод 2ФП позволяет варьировать заданную структуру и создавать матрицы с шагом 500 нм.

Помимо этого, учитывая возможности послойного создания структур, метод 2ФП позволяет менять внутреннею структуру 3-мерных скаффолдов, что особенно важно при направленной регенерации нервной ткани. Помимо этого на настоящий момент существует еще целый ряд недостатков, не позволяющих использовать предлагаемые методы создания структур в практической медицине.

Для создания таких структур обычно используются различные синтетические фотополимеризующиеся композиции на основе биосовместимых и биорезорбируюмых полимеров, таких как хитозан, фибрин, гилауроновая кислота и т.д. Одной из наиболее распространенных основ для создания фоточуствительных композиций является полилактид.

Основными его преимуществами является средняя скорость биодеградации в ряду полигликолид-полилактид-поликапролактон. В работе было показано, что скорость 50% биодеградации микросфер полилактида, введенных в мышечную ткань лабораторных крыс, составляла 35 недель.

Другими материалами для создания 3-мерных скаффолдов являются композиции, содержащие как фрагменты органических веществ (в большинстве случаев содержащие реакционноспособные двойные связи), так и неорганические молекулы.

Такие композиции (гибридные системы) предоставляют возможность использования большого круга фотоинициаторов (большинство из которых растворимы в органических растворителях) для проведения процесса 2ФП. Помимо этого у ряда гибридных структур практически не изменяются заданные линейные размеры после проведения процесса 2ФП, в отличие от композиций описанных ранее.

Гибридные материалы обладают целым рядом дополнительных преимуществ, прежде всего удобным синтезом, не требующим специальной подготовки, высоким оптическим качеством исходной системы, химической и электрохимической инертностью, хорошей стабильностью во времени. Так, в работе была проведена сополимеризация алкоксидов кремния и циркония.

Полученный материал обладал повышенной механической прочностью. Другим преимуществом гибридных материалов является возможность включения разнообразных функциональных групп с использованием схем синтеза гость-хозяин или боковая цепь — основная цепь.

Например, присоединение хромофора, обладающего нелинейно-оптическими свойствами для создания электрооптической системы золь-гель. Например, в работе был осуществлен синтез гибридной системы с помощью процесса золь-гель, содержащей Zr с использованием нижеследующих материалов и этапов синтеза. Метакрилоксипропил триметоксисилан (МОПТМС, 99%, Polyscienceinc.

) и метакриловая кислота (МК, 98%, Sigma-Aldrich) были использованы в качестве фотополимеризуемых мономеров. N-пропоксид Zr (ЦПО, 70% в пропаноле, Sigma-Aldrich) и алкоксисилановые группы МОПТМС использовались как части для формирования неогранической матрицы.

Различия в реакционной способности алкоксисилановых групп и соли циркония (Zr) предполагают трехстадийный процесс для формирования комбинированных неорганических структур. На первом этапе МОПТМС и ЦПО раздельно гидролизуются и стабилизируются МК. Далее гидролизованный МОПТМС медленно добавляли к комплексу Zr.

Гидролиз МОПТМС проводили с использованием 0,01-молярной соляной кислоты в соотношении 1:0,75. Поскольку МОПТМС не смешивается с водой, гидролиз идет в гетерогенной фазе. После 20-минутного перемешивания раствора и добавления метанола гидролиз алкоксисилановых групп был проведен в достаточной мере для перемешивания всех компонентов раствора.

Лиганды, обладающие высокой константой комплексообразования, иногда используются для контролирования протекания процесса гидролиза и последующей конденсации для прекурсоров металлов (в основном алкоксидов). В нашем случае в качестве лиганда использовалась МК, которая ковалентно связывалась с комплексом Zr через карбоксил.

Для выбранной системы использовалось соотношение 1:1, причем добавление MK осуществлялось постепенно, капельным методом. Реакция проходит с образованием комплекса Zr(ОC3H7)4-x(MK), поскольку используются эквомолярные количества исходных веществ. По прошествии 45 минут частично гидролизованный МОПТМС добавляли к Zr-комплексу.

После перемешивания в течении 45 минут к полученной смеси прибавляли воду в соотношении 2,5:5 эквимолярно. На последнем этапе к смеси прибавляли фотоинициатор 4,4’-бис(диэтиламино)бензофенон в расчете 1% масс, по отношению к массе полученного раствора. После перемешивания в течение 24 часов полученный раствор пропускали через мембрану с диаметром пор 22 мкм. Образцы пленок были приготовлены с помощью спин-коутера на стеклянных подложках. После распределения смеси по подложке в течение 12 часов проводился процесс отжига на плитке при температуре 40°С. При нагреве происходит процесс формирования неорганической матрицы.

Структуры были получены на установке 2-фотонной полимеризации с помощью метода прямого лазерного рисования. В работе использовался Ti-сапфи-ровый лазер (Chameleon, Coherent), позволяющий работать в импульсной системе с продолжительностью импульса 140 фс с частотой 80 МГц и пиком излучения на 780 нм.

На установке использовался 100-кратный объектив фирмы Karl Zeiss (Na=1,4). После формирования матрикса внутри гибридной системы проводился процесс вымывания непрореагировавшего материала. Для этого использовался изопропиловый спирт. Процесс проводился в течении 12 часов, после чего образцы помещались в этиловый спирт и хранились в нем.

Перед высадкой культур клеток на матриксы их выдерживали 48 часов в стерильном натрий-фосфатном буфере.

Трехмерная модель, выбранная для изготовления скаффолдов, представляла собой квадрат со сторонами 2 мм, состоящий из цилиндров со следующими характеристиками: высота 110 мкм, внутренний диаметр 100 мкм, внешний диаметр 160 мкм (рис. 7).

Было создано 3 ряда цилиндров, причем средний ряд цилиндров имел смещение относительно нижнего ряда на 80 мкм. Это было сделано для того, чтобы при заселении матриксов клетками, создать внутреннюю опору для дополнительного закрепления клеточного материала.

Размеры матрикса были выбраны специально для проведения экспериментов по высаживанию и росту клеток нервной системы.

Помимо создания биосовместимых структур возможности гибридной золь-гель-технологии позволяют создавать 3-мерные структуры, обладающие проводимостью. Известно, что с течением времени в процессе срастания обрубков нервов аксоны при удалении от ближайшего обрубка и органы-мишени, или мышцы, значительно теряют свою способность к регенерации.

Поэтому подходы к повышению регенеративной способности нервов являются необходимым условием для полноценного заживления после потери сегмента нервной ткани. Электрическая стимуляция в терапевтических целях на сегодняшний день является наиболее эффективным стимулятором регенеративных способностей, особенно при восстановлении нервной ткани.

Существует большое количество работ, описывающих удлинение нейритов и аксонов in vitro и регенерацию нервной ткани in vivo.

Так, в ряде работ было показано, что электрическая стимуляция при приложении электрического заряда (постоянного или переменного тока) или при создании электрического поля повышает дифференцировку стволовых клеток, ускоряет рост нервной ткани и непосредственно влияет на рост аксонов.

Существует ряд технологий создания токопроводящих биосовместимых материалов, например электрическая стимуляция через электроды обоих концов обрыва нерва, покрытие золотыми наночастицами 3-мерного скаффолда, использование токопроводящих полимеров, таких как полипирол или полианилин.

В работе методом 2-фотонной полимеризации были изготовлены матриксы на основе токопроводящих гибридных золь-гель-систем. В качестве исходного соединения для создания таких систем был использован 3,4-эти-лендиокситиофен (ЭДТ).

Основным преимуществом его использования является его биологическая совместимость, оптическая прозрачность, в отличие от других прекурсоров, носителей заряда, которые имеют поглощение в видимой и ближней ИК-области спектра.

После проведения окислительной полимеризации ЭДТ был получен проводящий, биостабильный и биосовместимый полимер поли(3,4-этилендиокситиофен) (ПЭДТ). В качестве матрицы для 2-фотонной полимеризации был выбран полиэтиленгликоль-диакрилат (ПЕГ-ДА).

Этот материал является биосовместимым и может быть использован совместно с фотоинициатором для создания 3-мерных структур. При этом механические свойства фото-полимеризованного материала ПЕГ-ДА могут быть изменены при выборе различных олигомеров с разными молекулярными массами.

В качестве фотоинициатора был выбран водорастворимый Irgacure 2959 (Ciba). В ходе работ были получены биологически совместимые 3-мерные скаффолды с разными процентными соотношениями ПЭГ-ДА и ЭДТ. При повышении концентрации ЭДТ для проведения полимеризации требовалось повышение мощности лазера и времени экспозиции образца.

Для проведения процесса 2-фотонной полимеризации использовалась вторая гармоника (520 нм) фемтосекундного иттербиевого лазера femtoTRAIN (High Q Laser Production Gmb Н, Austria) с частотой 20 МГц и продолжительностью импульса 250 фс. Для получения достаточной доли полимеризованого компонента мощность лазера варьировалась от 6,5 до 20,5 мВ.

Для характеристики электрических свойств полученных микроструктур методом 2ФП были получены 3-мерные стержнеподобные тестовые структуры с двумя большими областями контактов и сегмента с размерами 450х50х50 мкм соответственно.

Стоит отметить, что изготовление структур на основе систем, содержащих ПЭДТ в количестве более 17%, было невозможно из-за появления видимых деформаций и недостаточной адгезии структур к подложке.

На кривой изменения проводимости видно, что с ростом концентрации ЭДТ значительно возрастает проводимость формированной гибридной системы.

Такой рост проводимости объяснялся авторами с помощью теории перколяции, которая связывает повышение проводимости материала с образованием токопроводящих путей.

Концентрацию токопроводящего материала, соответствующую порогу перколяции, обычно называют критическим содержанием проводящего материала.

Зависимость проводимости этих двухкомпонентных систем хорошо аппроксимируется функцией подгонки Белехрадека:

где σ — электропроводность, р — содержание проводящего наполнителя, рс — критическое содержание проводящего материала, t — топологический параметр. Топологический параметр характеризует размерность проводящих путей. Исходя из аппроксимации данных на рис. 10 топологический параметр и порог перколяции составили, соответственно, t=1,1 и 5% ПЭДТ.

Максимальная проводимость 0,04 См/см достигается при максимальной концентрации ПЭДТ 17% по объему. Таким образом, в работе была показана возможность формирования биостабильных матриксов на основе токопроводящих гибридных систем ПЭГ-ДА/ПЭДТ методом 2ФП. Проводимость такого материала достигала 0,04 См/см при максимальной концентрации ЭДТ 17% об.

, что дает возможность использовать изготовленные структуры для регенерации нервных тканей.

Таким образом, основным преимуществом метода 2ФП является возможность получения пространственных структур с высоким пространственным разрешением и заданной архитектоникой.

Полимеры, которые используются для создания матриксов, могут обладать разными свойствами, в том числе быть проводящими, биодеградируемыми и др.

За счет изменения архитектоники метод 2ФП позволяет получать скаффолды, обладающие различными механическим свойствами, изменяемыми в широком диапазоне.

Источник: http://ladycaramelka.ru/nejrodegenerativnye-zabolevaniya/razrabotka-poristyx-matric-nositelej-s-ispolzovaniem-metoda-dvuxfotonnoj-fotopolimerizacii

Способ иммобилизации биологически активных веществ на матрицах пористых носителей

Разработка пористых матриц-носителей с использованием метода

Изобретение относится к методам модифицирования пористых систем для создания биологически активных композиционных материалов.

Для этого указанную матрицу помещают в фильтрационный прибор, наносят на нее находящийся в жидкой фазе раствор препарата и устанавливают разрежение на выходе фильтровального устройства, отличающийся тем, что величину разрежения выбирают ниже “точки пузырька”.

Кроме того, толщину наносимого слоя реагента определяют из условий заданной точности реакции, после чего уточняют величину разрежения, установленного на выходе фильтровального устройства, оценивают толщину наносимого слоя реагента, необходимую для обеспечения адекватного контроля результатов реакции, после чего уточняют величину разрежения, установленного на выходе фильтровального устройства, а указанную матрицу подвергают воздействию ультразвуковых колебаний, инфракрасного излучения, причем их мощность ограничивают с учетом деструкционной прочности иммобилизованных биологических веществ. Изобретение обеспечивает повышение точности и эффективности визуального колориметрического контроля результатов биохимических анализов при использовании пористых матриц с иммобилизацией на них биологических веществ, повышение точности и эффективности регулирования дозы лекарственного начала в лечебных повязках. 4 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к методам модифицирования пористых систем с целью создания биологически активных композиционных материалов.

Биологически активными являются реагенты биологической природы (ферменты, антитела, антигены) и биологические объекты (тканевые клетки и микроорганизмы), предназначенные для иммобилизации на пористых основах при изготовлении биосенсорных зон в диагностических изделиях, в том числе тест-полосках для экспресс-диагностики в медицине и экологии.

Известен, например, аналог предлагаемого – способ модификации микрофильтрационных материалов для очистки физиологически активных препаратов [1], при котором помещают в фильтрационный прибор исходный микрофильтрационный материал, наносят на него находящийся в жидкой фазе препарат и используют перепад давлений при работе фильтровального устройства, что совпадает с существенными признаками предлагаемого способа. При этом избыточное давление на входе фильтровального устройства устанавливают равным 0.2105 Па. Кроме того, в известном способе исходный материал предварительно обрабатывают раствором хлорида калия, в качестве модифицирующего агента используют латекс. Недостаток известного способа состоит в том, что используемое количество наносимого раствора достаточно велико – 50 мл, что не оправдано при использовании дорогостоящих биологически активных веществ, например ферментов. Кроме того, конкретно выбранное значение давления сужает диапазон параметров наносимых препаратов, ограничивая диапазон характеристик реализуемых устройств. Наиболее близким к предлагаемому является способ иммобилизации липидов из спиртового раствора на поверхность трековой мембраны [2], принятый в качестве прототипа. В способе-прототипе помещают в фильтрационный прибор исходный микрофильтрационный материал, наносят на него находящийся в жидкой фазе раствор препарата и устанавливают разрежение на выходе фильтровального устройства, что совпадает с существенными признаками предлагаемого способа. При этом исходный микрофильтрационный материал является трековой мембраной. Принцип действия изготавливаемых данным способом изделий состоит в том, что получаемая сложная двухслойная матрица (основа и слой реагента) на этапе эксплуатации также должна впитать анализируемую жидкость, именуемую аналитом – воду, раствор препарата, биологическую жидкость – слезу, кровь и т.п. и иммобилизованный в активной зоне реагент должен вступить в реакцию с аналитом. Результат реакции состоит в изменении цвета активной зоны и может быть подвергнут визуальному контролю или фотометрическому анализу. Недостатком известного способа, возникающим из-за ненормированности создаваемого разрежения, является возможность практически полного перекрытия поры раствором реагента и образование слоя заметной толщины на исходной матрице. Это явление особенно существенно, если реагент имеет высокую вязкость. Слой, формирующийся на основной матрице, резко снижает сечение поры, что ограничивает площадь контакта реагента с аналитом и заставляет повышать концентрацию реагентов, как правило, очень дорогих. Кроме того, недостаток известного способа состоит в том, что слабо развитая поверхность трековой мембраны снижает точность колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов, проводимых с помощью рассматриваемого способа. Кроме того, отсутствие дозировки наносимых реагентов и регулирования величины разрежения снижает эффективность известного способа, повышает стоимость производимой продукции, уменьшает его функциональную гибкость. Таким образом, анализ уровня техники показывает, что при иммобилизации биологических веществ весьма актуальным является следующий технический результат: – повышение точности колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов при использовании пористых матриц с иммобилизацией на них биологических веществ, в том числе лечебного назначения, – повышение эффективности колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов, – повышение экономической эффективности биохимических анализов, – повышение функциональной гибкости методов колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов. Перечисленные ранее недостатки прототипа устраняются и указанный выше технический результат реализуется в предлагаемом способе иммобилизации биологических веществ на матрице пористых носителей, при котором указанную матрицу помещают в фильтрационный прибор, наносят на нее находящийся в жидкой фазе раствор препарата (лечебного или аналитического) и устанавливают разрежение на выходе фильтровального устройства, что совпадает с существенными признаками известного способа. При этом величину разрежения выбирают ниже “точки пузырька”. Кроме того, толщину наносимого слоя реагента определяют из условий заданной точности реакции, после чего уточняют величину разрежения, установленного на выходе фильтровального устройства. Кроме того, оценивают толщину наносимого слоя реагента, необходимую для обеспечения адекватного колориметрического и визуального контроля результатов реакции, после чего уточняют величину разрежения установленного на выходе фильтровального устройства. Кроме того, указанную матрицу подвергают воздействию ультразвуковых колебаний. Кроме того, мощность указанных ультразвуковых колебаний ограничивают с учетом механико-деструкционной прочности иммобилизуемых биологических веществ. Кроме того, указанную матрицу подвергают воздействию инфракрасного излучения. Кроме того, мощность и частоту указанного инфракрасного излучения, ограничивают с учетом термо-деструкционной прочности иммобилизируемых биологических веществ. Итак, способом избежать потери чувствительности и снизить стоимость изготовления является предлагаемый в настоящей заявке динамический метод иммобилизации реагентов на основной исходной матрице с образованием вторичного слоя композиционной матрицы. Он состоит в том, что иммобилизация проходит в режиме фильтрования под давлением, превышающем давление вытеснения смачивающей основной материал жидкости. Классическое определение объемной скорости фильтрования по формуле Пуазейля дает следующую зависимость длительности фильтрования определенного объема жидкости: где l – длина пора, м; r – его средний радиус, м; – вязкость, Пас; Р – разность давлений на концах пора, Па;
Q – объемная скорость фильтрования, м3с-1. Известно также, что давление вытеснения смачивающей жидкости подчиняется следующему закону:
Pв = 4cos/d (2),
где – поверхностное натяжение, Нм-1,
– краевой угол смачивания матрицы пористой основы смачивающей жидкостью, рад.,
Рв – минимальное давление, достаточное для вытеснения жидкости из пор основы, Па,
d – диаметр поры, м. Таким образом, кратковременный контакт фильтруемого реагента с материалом основной матрицы позволяет сформироваться тонкому слою реагента на внутренней поверхности пор материала. Последнее позволяет более экономно расходовать материалы при изготовлении тест-полосок и других диагностических изделий. Кроме того, возможно прогнозирование скорости взаимодействия растворов аналита с биологически активными реагентами на основе наблюдения за временем растекания капли раствора аналита на пористом носителе. Расчеты основаны на том, что характеристики жидкости (вязкость, поверхностное натяжение) и суммарный эффект взаимодействия жидкости (краевые углы смачивания), учтены в соотношении и Пуазейля (1), и Лукаса-Вашберна [3] – уравнение (3). dl/dt = -rcos/4l (3).
Уравнение (3) преобразуется при интегрировании в (4). t = 2l2/rcos (4). В уравнениях (3) и (4) r – радиус поры (в данном случае – капилляра), м,

– поверхностное натяжение Нм-1,

– краевой угол смачивания матрицы пористой основы смачивающей жидкостью, рад.,
l – длина поры, м, – вязкость жидкости, Пас,
t – время движения жидкости на расстояние l. Эти соотношения дают возможность расчета режима взаимодействия аналитов с композиционным биологически активным материалом, каковым являются активные зоны биосенсоров, при их эксплуатации и в технологическом процессе изготовления биосенсоров путем иммобилизации биологически активных веществ на матрице. Процесс иммобилизации биологически активного вещества на заданном участке пленки при автоматизированном изготовлении тест-полосок для диагностики заболеваний человека, животных и растений или для экологических исследований сопровождается затем изготовлением нарезанных по шаблону полосок и их фиксацией в корпусе, содержащем “рабочие окна” и “окна контроля”. Знание времени движения аналита в поровом пространстве биоактивной зоны позволяет провести расчет конструкции изделия – расстояний от места введения аналита до обоих окон. В лабораторных условиях предлагаемый способ может быть применен в решении следующих задач: Отработка способов изготовления тест-полосок для измененных условий или ранее не использованных биологических жидкостей с целью оптимизации диагностического процесса; Отработка методов исследования скорости трансдермального переноса лекарственных препаратов;

Отработка экспресс-методов экологического контроля.

Во всех этих случаях полезны предварительные сведения о том, как будет меняться режим взаимодействия жидкости и пористого материала при изменении физико-химических характеристик реагентов. Примеры. Для проведения иммобилизации биологически активных веществ в динамическом режиме собрана установка, состоящая из водоструйного насоса, вакуумметра и фильтродержателя фирмы Миллипор типа Sterifil 47 mm Filter Holder. Пример 1. Для проведения иммобилизации альбумина (модельного раствора) в динамическом режиме в фильтродержатель собранной установки помещают микропористую пленку Химифил, поверх фильтра наливают раствор альбумина в количестве 20 мл и проводят фильтрование. При этом устанавливают давление ниже точки пузырька, чему соответствует значение диаметра пор пленки согласно формуле (2). Варьируя концентрацию альбумина, фиксируют разные по толщине слои белка. Время фильтрации (1) возрастает с ростом вязкости, прямо пропорциональной концентрации альбумина. Затем сравнивают интенсивность окрашивания метиленовым синим – реагентоспособность пленок в зонах иммобилизации белка с той же характеристикой пленок, изготовленных обычным методом пропитки. Сравнение показывает, что масса иммобилизованного белка на фрагментах, используемых в динамическом режиме, в 5-6 раз меньше, чем на пленках, пропитанных обычным способом, при одинаковой реакции, определяемой с помощью ФЭК (фотоэлектроколориметра). Пример 2. Раствор холинэстеразы ранее описанным методом фиксируют в динамическом режиме на пористых пленках типа HAWP фирмы Миллипор. Параллельно те же инкубируют пленки в растворе холинэстеразы. После высушивания обе серии образцов пленок с иммобилизованным ферментом подвергают воздействию реактива Эллмана [4]. Цветовая реакция идет быстрее на пленках с иммобилизованным в установке ферментом при одной и той же концентрации фермента в растворах, но 4-5-кратно меньшем объеме израсходованного раствора фермента. С помощью описанных выше устройств можно иммобилизовать лекарственные препараты в динамическом режиме при создании повязок пролонгированного действия путем подачи в качестве фильтруемой жидкости лечебного раствора, для чего в фиксатор помещают образец повязки. На слой наносят определенное количество раствора, включают вакуумный насос и устанавливают давление, не превышающее “точку” пузырька. Вместо впитывания рассчитывают и выбирают оптимальный режим иммобилизации препарата по минимальному времени фильтрования (максимальной скорости фильтрования). Пример 3. Смесь глицерина, нашатырного и этилового спирта (смягчающий кожу препарат) в количестве 20 мл пропускают через нетканый материал, разрешенный к применению в хирургии. Параллельно в 100 мл пропитывают обычным способом такой же по площади фрагмент основы – хирургического нетканого материала. Затем проверяют экспертной оценкой эффективность действия на добровольце с трещинами в области пальцев рук (синдром “сухой кожи” – доброволец С., 61 год). Эффективность аппликаторов одинакова (оценка по успокаивающему действию со слов добровольца) при 5-кратной экономии препарата и повышенному удобству пользования. Таким образом, не затрачивая большие количества реагентов и лечебных препаратов, можно иммобилизовать биологически активные вещества на пористых носителях путем применения динамического режима. Можно также прогнозировать, как изменится скорость работы биологически активного вещества при повышении его концентрации, при изменении температуры в производстве других биосенсоров, что сократит этап предварительных исследований и снизит их стоимость. Приведенные примеры свидетельствует о перспективности предлагаемого способа и для изучения особенности иммобилизации препаратов, различных по аналитическому или медицинскому назначению, на пористых носителях. Далее покажем, что технический результат в предлагаемом способе реализуется именно за счет его существенных отличий. То, что величину разрежения выбирают ниже “точки пузырька” способствует равномерности нанесения реагента на поверхность пор и поров, т.к. исключает возможность “закипания” жидкой фазы. То, что толщину наносимого слоя реагента определяют из условий заданной точности реакции, после чего уточняют величину разрежения, установленного на выходе фильтровального устройства, позволяет ограничиться минимальным количеством реагентов, зачастую весьма дорогих, и таким образом снизить себестоимость изделий, повысить экономическую эффективность способа. Одновременно увеличивается и чувствительность, точность способа с учетом увеличения активной поверхности изделий, поскольку активное разрежение не позволяет порам закупориваться и способствует более равномерному растеканию жидкой фазы по стенкам пор. Последнее способствует дополнительному повышению экономической эффективности способа. То, что оценивают толщину наносимого слоя реагента, необходимую для обеспечения адекватного колориметрического и визуального контроля результатов реакции, после чего уточняют величину разрежения установленного на выходе фильтровального устройства, позволяет дополнительно снизить расход дорогостоящих реагентов с учетом особенностей колориметрического и визуального контроля результатов биохимических анализов, проводимых с помощью рассматриваемого способа. Дело в том, что визуально контролируемая зона изменения цветовой окраски имеет глубину порядка половины длины волны наблюдаемого кванта света. Соответственно, такого же порядка должна быть выбрана и глубина пропитываемого слоя, что позволяет существенно снизить расход дорогостоящих реагентов. Действительно, сопоставление обычно производимой пропитки на всю толщину подложки, например 1 мм, и глубины пропитки в предлагаемом способе – порядка 0,4-0,8 мкм, говорит о возможности улучшения рассматриваемого параметра на 3 порядка. То, что указанную матрицу подвергают воздействию ультразвуковых колебаний, также позволяет повысить равномерность нанесения реагентов на пористую матрицу. В результате повышается точность получаемых анализов, их достоверность. При этом мощность указанных ультразвуковых колебаний ограничивают с учетом механико-деструкционной прочности иммобилизуемых биологических веществ, поскольку биологические объекты могут разрушаться при достаточно жестких воздействиях. Нагревание матрицы, например, воздействием инфракрасного излучения, позволяет варьировать вязкость и поверхностное натяжение наносимых реагентов, что расширяет диапазон используемых биохимических материалов и объектов, повышает функциональную гибкость способа. При этом мощность и частота указанного инфракрасного излучения не должны быть слишком велики, чтобы избежать разрушения иммобилизуемых биологических веществ. Таким образом, показано, что именно существенные отличия предлагаемого способа обеспечивают достижение требуемого технического результата. Проведенные эксперименты показали реализуемость предлагаемого способа. Список литературы
1. Способ модификации микрофильтрационных материалов для очистки физиологически активных препаратов (авт. св. СССР 1801561, приоритет 06.03.93, кл. В 01 D 67/00). 2. Снегирева Н.С. и др. Модели кожи – биоактивные композиты для биомедицинских исследований. Механика композиционных материалов и конструкций, т. 3, 4, 1997 г., с.68 (прототип). 3. Хейфец Л.И., Неймарк А.В. Многофазные процессы в пористых средах. – М.: Химия, 1982. 320 с. 4. Ellman G. L., Courtney K.D., Andres V., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7, 1961, p.88-95.

Формула изобретения

1. Способ иммобилизации биологических веществ на матрице пористых носителей, при котором указанную матрицу помещают в фильтрационный прибор, наносят на нее находящийся в жидкой фазе раствор препарата в виде слоя определенной толщины, устанавливают разрежение на выходе фильтровального устройства, задают требуемую величину точности реакции и осуществляют колориметрический или визуальный контроль результатов реакции, отличающийся тем, что толщину наносимого слоя реагента определяют из условий заданной точности реакции и обеспечения адекватного колориметрического и визуального контроля результатов реакции, после чего уточняют установленную на выходе фильтровального устройства величину разряжения, выбранную ниже “точки пузырька”. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на указанную матрицу наносят находящийся в жидкой фазе раствор препарата, подвергая его воздействию ультразвуковых колебаний. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что мощность указанных ультразвуковых колебаний ограничивают с учетом механико-деструкционной прочности иммобилизуемых биологических веществ. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на указанную матрицу наносят находящийся в жидкой фазе раствор препарата, подвергая его воздействию инфракрасного излучения. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что мощность и частоту указанного инфракрасного излучения ограничивают с учетом термо-деструкционной прочности иммобилизуемых биологических веществ.

Источник: https://findpatent.ru/patent/219/2196823.html

Medic-studio
Добавить комментарий