Реакция связывания комплемента: Реакция связывания комплемента (РСК). Сложная двухэтапная реакция, в

Реакция связывания комплемента. Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухэтапная серологическая реакция

Реакция связывания комплемента: Реакция связывания комплемента (РСК). Сложная двухэтапная реакция, в

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухэтапная серологическая реакция.

В ней используют пять ингредиентов, составля­ющих две системы: антиген, антитело, комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащей специфические к ним антитела (вторая, или индикаторная, гемсистема).

При этом взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, который адсорбирует комплемент, но визуально обнаружить это невозможно.

В качестве индикатора связывания комплемента на комплексе антиген–антитело на втором этапе используют гемсистему, кото­рая, являясь иммунным комплексом, тоже способна адсорбировать его. В конечном итоге возможны два вариан­та результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу и комплемент адсорбируется образовав­шимся комплексом, лизиса эритроци­тов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену, и наоборот, комплемент, оставаясь сво­бодным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз.

Как и другие серологические ре­акции, РСК можно использовать для выявления специфических антител по известному антигену или для определе­ния антигена по известным антителам.

Общая характеристика ингредиен­тов РСК.

1. ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА перед постановкой реакции прогрева­ется на водяной бане 30 мин для инактивации ее собственного комплемента и разводится начиная с 1:5.

2. АНТИГЕНОМ могут быть культуры бактерий, их лизаты, вирусы и вирус–содержащие материалы, экстракты па­тологически измененных органов и тканевые липиды.

3. КОМПЛЕМЕНТ – сыворотка мор­ских свинок, полученная в день опыта. В настоящее время используется производственный сухой комплемент.

4. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин.

Постановка основного опыта РСК. В 1 пробирку вносят СЫВОРОТКУ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ, во вторую – сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ), в третью – антиген, комплемент и тот же раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ АНТИГЕНА).

Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 1ч. Одновременно готовят гемолитическую систему, которую затем добавляют во все три пробирки после извле­чения штатива из термостата.

Смешав гемсистему с ингредиентами трех пробирок, последние вновь ставят в термостат на 1 ч, и спустя это время учитывают результаты РСК.

При учете РСК интенсивность реакции обозначается плюсами: «++++»– резко положительная реакция с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно; «+++», «++» –положительная реакция, отличается нарастанием окраски жид­кости вследствие гемолиза и уменьшения количества эритроцитов в осад­ке; «+» – слабоположительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов. Отрицательная реакция обозначается знаком «–», при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно–розовую окраску («лаковая кровь»).

РСК – весьма сложная, но очень чувствительная специфическая реакция. Широко применяется в диагностике сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.

Иммуноферментный анализ.

Метод был разработан в начале 70-х гг независимо друг от друга тремя группами учёных. Метод напоминает РИА, но в его основу положено маркирование Аг или Ат, вступающего в реакцию, ферментом.

Взд метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды.

В настоящее время созданы многочисленные модификации этого метода, но наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный). Различают:

1) ПРЯМОЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА. В этом случае:

1. сыворотку с Ат инкубируют с Аг, фиксированным на твёрдом субстрате (чаще всего это пластиковая микропланшетка).

2. Ат, не связавшие Аг, удаляют многократным промыванием.

3. Вносят меченную ферментом сыворотку к Ат, связавшим Аг.

4. Определяют ко-во фермента–маркёра, связавшегося с Ат.

2) КОНКУРЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА.

1. Вносят сыворотку. Если в ней есть специфические Ат, то они связываются с Аг, фиксированном на твёрдом субстрате. Если специфических Ат нет, то Аг оказывается не связанным.

2. При добавлении специфических к фиксированному Аг Антител в первом случае им будет не с чем взаимодействовать (большинство Аг уже связаны) Þ содержание маркёра низкое. Во втором случае специфические Ат будут связываться с Аг и при отмывании они не будут смываться Þ высокое содержание маркёра.

Аналогично м.б. фиксированы АНТИТЕЛА, и различные фирмы выпускают именно планшеты с уже фиксированными Ат.

По сравнению с классическими методами выявления Аг этот метод позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с Ат, а не вторичные проявления (агглютинацию, преципитацию или гемолиз). Метод очень ЧУВСТВИТЕЛЕН (достаточно концентрации 1нг/мл).

Определяют: Хламидии, клостридии, ВИЧ и др.

8. Реакция фагоцитоза.

Фагоцитоз осущ-ся микрофагами и макрофагами. Стадии фагоцитоза: приближение, прилипание, погружение, переваривание.

Оценка функциональной активности фагоцитирующих клеток.

Колич. оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов производят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром 1,0-2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.

Фагоциты смешивают с фагоцитируемым материалом в соотношении 1:10 или 1:100 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании.

Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка.

В мазках, фиксированных краской Май-Чрюнвальда и окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток (ФП – фагоцитарный показатель) и кол-во поглощенных частиц на 1 клетку (ФЧ – фагоцитарное число).

У здорового человека ФП=40-80%, ФЧ=1-5.

9. Диагностикумы.

Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий.

Феномен реакции проявляется предварительно через два часа (при 37 0 С), окончательный результат учитывается при комнатной температуре через 18-20 часов. Для диагностики представляет интерес положительная реакция только в опре-деленном титре сыворотки, который служит диагностическим.

Так, при бруцеллезе диагностический титр 1:200, а при туля-ремии -1:100. Для выявления антител можно ставить экспрессные реак-ции агглютинации (время учета несколько минут). Например: 1. Кровяно-капельная реакция при туляремии.

В каплю цельной крови больного на специальном стекле наносят кап-лю дистиллированной воды (для гемолиза) и каплю туляре-мийного диагностикума. Реакция происходит в течение 1-2 минут, хорошо видны агглютинаты в виде белесых комочков. 2. На стекле проводится экспрессная реакция агглютина-ции по Хеддельсону при бруцеллезе.

Данные реакции не позволяют определить количество ан-тител в сыворотке.б) для идентификации чистой культуры возбудителей ин-фекционных болезней. С этой целью используются иммунные диагностические

агглютинирующие сыворотки, выпускаемые институтамивакцин и сывороток, путем иммунизации животных целымимикробными клетками. Для достоверности сыворотки лучше использовать адсор-бированные, чтобы в них содержались только антитела, соот-ветствующие определенному виду или типу микроорганизма.

Принципы получения иммунных сывороток.

Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену. В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами.

В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, – их высокая специфичность и достаточное содержание антител. По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические – к одному конкретному антигену. Получить моноспецифические сыворотки можно:

1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены,

2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности.

Для этого используют:

1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ -АТ и выделением антител;

2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные анти-

тела. Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой)

принадлежности и авидности, поскольку синтезируются разными клонами лимфоцитов, вовлеченными в иммунный ответ Идентичными по всем характеристикам являются антитела к одной антигенной детерминантной группе, продуцируемые клеточным клоном, происходящим из одного лимфоцита, т. е.

моноклональные антитела. Для иммунизации животных готовят корпускулярные или

растворимые антигены различной степени очистки в зависимости от задач исследования. Получение сыворотки, отвечающей предъявляемым требованиям, во многом зависит от кратности, сроков и способов

введения антигенов. Способы введения антигенов животным могут быть различными (внутривенные, подкожные, внутрикожные и другие). Хорошо комбинировать внутривенное и локальное введение антигенов.

Количество антител в полученной сыворотке устанавливают титрованием ее в соответствующей серологической реакции с гомологичным антигеном.

Дата добавления: 2016-07-29; просмотров: 867 | Нарушение авторских прав

Рекомендуемый контект:

Похожая информация:

Поиск на сайте:

Источник: https://lektsii.org/6-61799.html

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента: Реакция связывания комплемента (РСК). Сложная двухэтапная реакция, в

Реакция гемолиза.

Реакция гемолиза (РГ) –это разрушение эритроцитов при действии антител при участии комплемента.

Компоненты РГ.

1. Антиген – 3% взвесь эритроцитов на изотоническом растворе хлорида натрия;

2. Антителогемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам (гемолизины);сыворотку получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана;

3. Комплемент – система белков крови, которые адсорбируюся на комплексе антиген-антитело и формируют мембраноатакующий комплекс, который разрушает антиген, т.е. разрушает эритроциты или, по-другому, вызывает лизис эритроцитов (гемолиз). В качестве комплемента используется свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок.

Если в пробирку поместить в определенных количествах эритроциты, гемолитическую сыворотку и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет разрушение (гемолиз) эритроцитов, в результате чего смесь из темно-красной станет розовой (“лаковая кровь”).

Реакция гемолиза используется в качестве индикатора при постановке реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК)– это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая, 2-ая – гемолитическая система.

Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент.

Видимого эффекта при этом не наблюдается, поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е.

в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система.

РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний.РСК также используется для сероидентификации.

Компоненты РСК.

1. Антиген– экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым).

2. Антитело – сыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации).

3. Эритроциты баранаантигены гемолитической реакции.

4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антителак эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана.

5. Комплемент– свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная).

6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Постановка РСК.

Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56°С в течение 30 мин.

РСК проводят в 2 фазы.

I фаза – специфическая: в одной пробирке готовят специфическую систему – смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37°С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин.

II фаза – индикаторная: в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин.

Учет результатов РСКпроводятпри безупречных результатах в контролях.

Положительная реакция(человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания – антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект– образование осадка эритроцитов.

Отрицательная реакция(человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – “лаковая кровь”.

В диагностике инфекционных заболеваний также используютсяреакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой, реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА).

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: https://studopedia.ru/3_68667_reaktsiya-svyazivaniya-komplementa.html

Реакции связывания комплемента. (РСК)

Реакция связывания комплемента: Реакция связывания комплемента (РСК). Сложная двухэтапная реакция, в

Сложные двухэтапные серологические реакции. Используют 5 ингредиентов, составляющих 2 системы.

а) антиген, антитело, комплемент

б) эритроциты барана, сенсибилизированные гемолитической сывороткой содержащей специфическое к ним антитело. Общее правило постановки реакции:

Исследуемая сыворотка подогревается на водяной бане до 50 градусов в течение 30 минут для активации собственного комплемента и разводится, начиная с 1:5 и т.д.

Антигеном является культуры бактерий, их лизиты, вирусы и вируссодержащие материалы

Комплемент – сыворотка морских свинок (сейчас применяют сухой комплемент)

Гемолитическая система состоим из смешанных в равном объеме гемолитической сыворотки в тройном тигре и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку.

Реакцию ставят в объеме 2,5 миллилитров, из каждого ингредиента добавляя рабочую дозу, содержащую 0,5 мл.

В первую пробирку вносят сыворотку антиген и комплемент (первая система) Во вторую – сыворотку, комплемент и изотонический раствор. Вторая и третья пробирка – контрольные. Пробирки ставят в термостат на I час при температуре 37 градусов.

Одновременно готовят гемолитическую систему, смешивая поровну гемолитическую сыворотку в тройном титре и 3% взвесь эритроцитов барана, которые добавляют по I мл во все три пробирки, после извлечения штатива из термостата.

Затем их вновь ставят в термостат на 1 час.

https://www.youtube.com/watch?v=j8yLSRsymfU

Реакцию отмечает +.

1. + -слабоположительная реакция, жидкость равномерно окрашена, на дне пробирки не значительное количество эритроцитов.

2. ++ положительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки небольшое количество эритроцитов.

3. +++ положительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки большое количество эритроцитов.

4. ++++ резко положительная реакция, жидкость прозрачная, эритроциты повреждены все.

5. – реакция отрицательная, полный, гемолиз эритроцитов, жидкость интенсивно окрашена.

РСК, несмотря на её сложность, очень чувствительная специфическая реакция и широко применяется для диагностики многих инфекционных заболеваниях.

Реакции иммунофлюоросцентции. ( РИФ).

Выделяют прямую и непрямую РИФ.

А). Прямая РИФ – простая реакция, но требующая большое количество меченых антимикробных сывороток.

Б). Непрямая РИФ – более сложная, но нужна одна меченая сыворотка.

При этом антиген с начало обрабатывают обычной иммунной сывороткой, а затем к иммунному комплексу добавляют меченую флюоросцентную сыворотку

Обычно идентификация антигена на первом этапе проводят иммунной кроличьей сывороткой. На втором этапе используется меченая сыворотка, полученная путем иммунизации иммуноглобулином кроликов и других животных.

А). Прямая РИФ.

На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки-отпечатки, подсушивают и фиксируют, затем наносят сыворотку и помещают во влажную камеру на 20-30 минут при температуре 37 градусов. Вынимают, уделяют избыток диагностической сыворотки, промывают 10-15 минут физиологическим раствором, ополаскивают дисцилированной водой и сушат, после чего исследуется в люминесцентном микроскопе.

Оценку производят +.

1. ++++ – очень яркое свечение вокруг микроорганизмов.

2. +++ – яркое свечение вокруг микроорганизмов.

3. ++ – обычная флюоресценция.

4. + – слабое свечение

Реакции лизиса (растворения)

Антиген – лизис обладает способностью растворять соответствующие микробные клетки. Лизисы способны на это только в присутствии комплемента.

Обнаружение возбудителей вирусных инфекций.

Наличие вируса в эмбрионе определяют с помощью 2 реакций:

Реакция связывания компонента.

Реакция гемагглютинации

Чаще применяется реакция гемагглютинации. В основе реакции лежит адсорбция вируса на поверхности эритроцитов, с дальнейшим их склеиванием. Активную гемагглютинацию вызывают вирусы гриппа, парагриппа и оспы. Иногда применяют реакцию торможения гемагглютинации – противоположную реакцию, тормозящую склеивание эритроцитов.

Наличие вирусов в культуре тканей чаще определяют с помощью двух реакции:

Реакция нейтрализации вирусов на культуре клеток.

Реакции торможения гемагглюнации (Р.Т.Г.А)

Реакция нейтрализации вирусов на культуре клеток.

Обычно используются нейтрализующие сыворотки.

Для этого полученный вирус накапливают в культуре клеток, и различные его разведения смешивают с не разведенной противовирусной сывороткой или делают наоборот – разводят сыворотку. Смесь инкубируют в термостате при 37 градусах 1-2 часа.

После этого смесью заражают культуру клеток, куриные эмбрионы или чувствительных животных и следят за реакцией. Отсутствие лизиса в культуре клеток тканей и патологических изменений в эмбрионе говорит о гибели вирусов, что и подтверждает достоверность поставленного диагноза.

Можно так же в серологической диагностике Р.Н.В. вводить вирусонейтролизующие антитела в организме больного человека с помощью известных диагностических штампов вирусов.

Обычно применяют метод «парных сывороток». О заболевании говорит 4-х и более кратное нарастание титра сывороток.

Реакция гемагглютинации.

В лунках планшета готовят 2-х кратно возрастающее разведение материала. Жидкость, в объеме 0,5 миллилитров, добавляя 0.25 миллилитров эритроцитов. Для контроля такую же смесь эритроцитов готовят в изотермическом растворе. Смеси культивируют в инкубаторе при температуре 37 градусов 30-60 мин. Результаты РГА по характеру агглютинации эритроцитов +.

1. ++++ – эритроциты в виде звездочки в осадке.

2. +++ – осадок с просветом.

3. ++ – осадок с большим просветом.

4. + – хлопьевидный осадок.

5. – – эритроциты в осадке в виде пуговицы.

РГА является группоспецифической, и не дает возможность определить вид вируса. Для этого применяют реакцию торможения гемагглютинации.

Реакции торможения гемагглютинации (Р.Т.Г.А)

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных млекопитающих и птиц.

Вирусы гриппа и гепатита – эритроциты кур, морских свинок, человека.

Аденовирусы – эритроциты крыс и мышей и т.д.

Для обнаружения вирусов во взятом материале от больного применяют реакцию торможения гемагглютинации, т.е. реакцию противоположного типа (РГА)

РТГА также проводят на пластмассовых планшетах и чаще ее применяют для диагностики ОРВИ и гриппа с разными сыворотками. 4-х кратное нарастание титра подтверждает предполагаемый диагноз.

Иммунологические исследования.

Исследуется иммунологический статус организма. В лаборатории работают в перчатках, масках, строго соблюдая правила безопасности.

Кровь для иммунологического исследования берётся, так же как и для серологического, но, необходимо сохранить лимфоциты.

Для сохранения лимфоцитов в теплое время года пробирки помещают в лед.

С помощью иммунологических исследований определяется иммунологический статус при следующих инфекциях:

ВИЧ – инфекция;

Вирусные гепатиты;

Описторхоз;

Герпесные инфекции;

Коревая инфекция;

Грибковые заболевания;

Хломедиаз:

Иммунологические исследования очень сложные в своём проведении и дорогостоящие. Чаще применяется Реакция иммунноферментивного анализа (РИФА) и иммуноблотинга.

Реакция иммунноферментивного анализа (РИФА).

РИФА основана на соединенных иммунных белков с ферментами токсинов возбудителей и применяется в крупных ЛПУ и НИИ.

Реакция иммуноблотинга.

Также как и реакция РИФА применяется в основном для диагностики вирусных инфекций в крупных ЛПУ и НИИ.

Аллергические методы.

Аллергические методы лабораторной диагностики основаны на выявлении гиперсенсибилизации организма к определенным токсинам отдельных микроорганизмов при введении в организм небольших доз специфических аллергенов. Аллерген вводится в небольших количествах накожно и внутрикожно и очень редко на слизистую оболочку глаза.

При наличии специфической аллергической реакции через некоторое время в месте введения появляется специфическое аллергическое воспаление в виде гиперемии с инфильтрацией.

Реакция считается положительной, если участок воспаления через 24-48 часов более 1 сантиметра в диаметре.

Чаще этот метод лабораторной диагностики применяют для диагностики туберкулёза, токсоплазмоза, бруцеллеза, туляремии, орнитоза и сибирской язвы.

Биохимические методы исследования.

Биохимический анализ крови широко используется для диагностики многих заболеваний. Кровь на исследование берется из вены строго натощак. При нарушении этого условия, отмечаются искажения основных показателей, и такой результат становится не информативным, а также может спровоцировать на заведомо ложный диагноз.

В биохимическом анализе крови определяют следующие показатели: уровень глюкозы, белки (общий белок, гамма-глобулины, альфа-2-глобулины, альфа-глобулины, бета-глобулины, альфа-фетопротеин С-реактивный белок), мочевая кислота, бета-липопротеиды, холестерин, триглицериды, ферменты крови (амилаза, АЛТ, АСТ и другие) билирубин и т.д.

Основные правила сдачи крови для биохимического исследования:

1. Перед сдачей необходимо ограничить себя в курении (курение повышает количество эритроцитов и уровень глюкозы в крови);

2. Перед сдачей не употреблять алкогольные напитки (алкоголь увеличивает содержание мочевой кислоты и снижает уровень сахара в крови);

3. Перед сдачей уменьшить употребление кофе и крепкого чая (повышают количество лейкоцитов и эритроцитов, а также сахар крови);

4. Перед сдачей исключить физические нагрузки и напряжение (повышается содержание сахара);

5. Перед сдачей крови в течение 2 суток необходимо воздержатся от употребления жирной, жареной, острой и копченой пищи (способствуют повышению в крови калия, щелочной фосфатазы и триглицеридов).

6. Перед сдачей нежелательно голодать (голодание более 48 часов, приводит к увеличению содержания билирубина в крови, а свыше 72 часов способствует снижению сахара в крови до нижней границы нормы и одновременно повышается содержание мочевины и свободных жирных кислот);

7. Кровь не следует сдавать при приеме лекарств, и после проведения рентгенографии, физиотерапевтических процедур и других исследований.

7. Кровь на исследование нужно сдавать натощак (последний прием пищи не менее чем за 10 часов до взятия крови).

9. Перед проведением процедуры следует отдохнуть 10-15 минут и успокоиться.

10. Забор крови, на биохимическое исследование, должна проводить медицинская сестра процедурного кабинета в стерильных условиях и стерильным материалом. При необходимости забор может провести постовая сестра или лаборант с соблюдением всех мер инфекционной безопасности.

Требования к пробиркам.

Пробирки должны быть чистыми и сухими и храниться при комнатной температуре. Иглы должны иметь большой диаметр (чтобы не разрушить эритроциты). Гемолиз наступает при быстром заборе, при заборе при низких температурах и при длительной фиксации жгута на конечности. В некоторых пробирках может находиться реактив.

Далее пробирка с кровью и направлением в специальном контейнере передается в клинико-биохимическую лабораторию диагностического центра для проведения исследования.



Источник: https://infopedia.su/12xc1d8.html

Компоненты реакции связывания комплемента и принципы их стандартизации

Эритроциты.

Обычно используют эритроциты барана. Для их получения кровь барана берут стерильно в равный объем модифицированного р-ра Олсвера или консерванта крови 7Б. В день опыта отобранную стерильно из консерванта и отмытую буфером порцию эритроцитов используют для приготовления стандартной суспензии. Кабат и Мейер (E. A. Kabat, М. М.

Мауег, 1968) предлагают использовать в качестве стандартной суспензию, содержащую в 1 мл 1*109 эритроцитов. Оптическая плотность (OD) лизата, приготовленного путем разведения в 15 раз стандартной суспензии 0,1% р-ром Na2CO3, определенная на спектрофотометре при длине волны 541 нм в кювете с оптическим ходом 1 см, оказывается равной 0,700.

Для доведения заранее приготовленной 5% суспензии эритроцитов до стандартной концентрации проводят расчет по формуле:

V2 = V1(ОD/0,7),

где OD — оптическая плотность лизата приготовленной 5% суспензии, V1 — объем приготовленной 5% суспензии, V2 — объем, к к-рому должна быть приведена 5% суспензия для получения стандартной концентрации эритроцитов.

Гемолитическая сыворотка (гемолизин, амбоцептор) — сыворотка крови кроликов, иммунизированных суспензией эритроцитов или стромой эритроцитов барана.

Перед употреблением гемолитическая сыворотка для инактивации содержащегося в ней комплемента должна быть прогрета при f 56° в течение 30 мин.

За титр сыворотки принимают ее наибольшее разведение, дающее полный гемолиз определенной дозы стандартной суспензии эритроцитов в присутствии постоянного количества комплемента в стандартных условиях опыта.

Гемолитическую систему готовят, приливая к стандартной суспензии эритроцитов равный объем гемолитической сыворотки в разведении, превышающем ее титр в три-четыре раза. Гемолитическую систему употребляют в день опыта.

Комплемент. Источником комплемента служит обычно сыворотка крови морских свинок. Для предотвращения инактивации комплемента свежеприготовленную сыворотку крови следует лиофилизировать или хранить при t° ниже —50°. Активность комплемента сохраняется в течение нескольких недель при t° 3—5° в присутствии борной к-ты и сернокислого натрия.

В РСК используют дозированное количество комплемента, к-рое принято измерять в условных 100% или 50% гемолитических единицах (СН100, СН50), равных количеству комплемента, обусловливающему соответственно 100% или 50% лизис определенной порции стандартной гемолитической системы в стандартных условиях опыта.

Зависимость гемолиза от количества введенного в реакцию комплемента графически выражается S-образной кривой.

При этом 100% гемолиз находится в зоне, где сенсибилизированные эритроциты недостаточно чувствительны к прибавлению новых порций комплемента; 50% гемолиз соответствует средней части кривой, где степень лизиса сенсибилизированных эритроцитов резко изменяется при изменении количества использованного в реакции комплемента.

На основании этих данных для количественного выражения гемолитической активности комплемента целесообразно использовать СН50. Активность комплемента в СН50 может быть вычислена но одной экспериментальной точке в зоне частичного гемолиза с помощью таблицы, составленной с использованием формулы Крога. Формула Крога отражает зависимость между количеством фиксированного в опыте комплемента (X) и процентом гемолиза (у):

X = (y/[1-y])0,2

Процент гемолиза определяют по шкале гемолиза, приготовленной из лизата стандартной суспензии эритроцитов, лизированной тройным объемом воды.

Антигены. Используемые в РСК антигены должны быть проверены на отсутствие антикомплементарности и гемотоксичности, т. е. не должны связывать комплемент в отсутствие антител и лизировать эритроциты.

Антисыворотки перед употреблением должны быть прогреты при t 56° в течение 30 мин. для инактивации содержащегося в них комплемента и сорбированы эритроцитами для удаления естественных гемолизинов.

Методы определения антигенов и антител

Методы определения антигенов и антител могут быть условно разделены на две основные группы — серологические и количественные. Серологические методы РСК используют для диагностики различных инфекционных заболеваний.

В целях диагностики в исследуемых сыворотках крови можно определять антиген с помощью диагностической сыворотки.

Однако чаще в сыворотке крови больных или реконвалес-центов определяют специфические антитела, используя антигены-диагностикумы (см. Диагностикумы).

При постановке РСК с целью стандартизации условий реакции используют так наз. рабочие дозы комплемента и антигена, к-рые подбирают непосредственно перед постановкой основного опыта. В качестве рабочей дозы комплемента употребляют обычно 1,25—1,5 СН100 или 3—5 СН50 комплемента.

В качестве рабочей дозы антигена в нек-рых методиках используют его максимальное количество, к-рое не обладает антикомплементарностью. Ряд исследователей выявили зональный характер РСК и установили, что титр антисыворотки зависит от взятого в реакцию количества антигена. Избыток его, как и недостаток, приводит к занижению титра антисыворотки.

Поэтому для каждой серологической системы необходимо определить оптимальную дозу (или диапазон доз) антигена, при к-рой реакция с исследуемой сывороткой выявляет ее максимальный титр. Обычно ее подбирают, титруя разведения антигена с постоянным количеством заведомо положительной сыворотки и рабочей дозой комплемента.

Максимальное разведение антигена, связывающее комплемент, называют антигенной единицей. В качестве рабочей дозы при титровании сывороток используют 2—4 антигенные единицы.

При постановке основного опыта равные объемы увеличивающихся разведений титруемой сыворотки крови смешивают с рабочими дозами антигена и комплемента. Одновременно с опытными пробами ставят контроли антигена и сыворотки на антикомилементарность и контроль комплемента. Опытные и контрольные пробы инкубируют при t° 37° в течение 60 мин. или при t° 4° — 18—20 час.

, после чего ко всем пробам приливают одинаковое количество гемолитической системы и пробы вновь инкубируют при t° 37° в течение 60 мин. При наличии специфических антител в исследуемой сыворотке крови в опытных пробах по сравнению с контрольными наблюдается задержка гемолиза.

За титр исследуемой сыворотки крови принимается ее наибольшее разведение, при к-ром наблюдается задержка гемолиза. При определении в РСК антигена серию его разведений смешивают с диагностической антисывороткой (неразведенной или разведенной в незначительной степени) и рабочей дозой комплемента. Рабочую дозу диагностической сыворохки предварительно не подбирают, т. к.

показано, что титр антигена не определяется использованным разведением диагностической сыворотки.

Введение СН50 комплемента позволило разработать количественные методы РСК, по точности не уступающие методу количественной преципитации. В основе количественной модификации РСК лежит прием обратного титрования комплемента, предложенный независимо Мейером с соавт. в 1948 г. и А. Кониковым в 1953 г.

Сущность его заключается в том, что при постановке РСК во все опытные и контрольные пробы вносят одинаковое заведомо избыточное количество комплемента. После завершения фазы связывания комплемента (60 мин. при t° 37° пли 18—20 час. при t° 4°) в опытных и контрольных пробах титруют оставшийся несвязанным комплемент, выражая его количество в CH50.

Количество специфически связанного серологической системой комплемента определяют по разнице между свободным комплементом в контрольных и опытных пробах. Прием обратного титрования позволяет работать с антикомплементарными препаратами антигенов и иммунных сывороток при условии, что их антикомп-лементарность будет перекрыта избытком вводимого в реакцию комплемента.

При постоянном количестве антител зависимость связывания комплемента от количества введенного в реакцию антигена, выраженная графически, напоминает кривую образования специфического преципитата. Максимум связывания комплемента, как и максимум образования специфического преципитата, лежит в области оптимальных отношений антитела и антигена.

В области избытка антигена наблюдается задержка связывания комплемента. Отношение антител к антигену в точке максимального связывания комплемента — величина постоянная для каждой серологической системы. На основании этой закономерности И. А. Тархановой, А. П. Кониковым и В. В.

Акимовой (1957) был предложен количественный метод титрования антигенов в РСК по точке максимального связывания комплемента, аналогичный методам оптимальных пропорций для титрования антигенов и антител в реакциях преципитации и флоккуляции.

В области большого избытка антител обнаружена прямая зависимость между количеством связанного системой комплемента и количеством участвующего в реакции антигена, что было использовано рядом исследователей для количественного определения нек-рых антигенов в РСК.

Уодсворт и Молтейнер (Е. A. Wadsworth, F. Maltaner) и др. в 1938 г. и Райс (С. Е. Rice) в 1942 г. сообщили об обнаружении линейной зависимости между количеством связанного комплемента и содержанием антител в титруемой сыворотке в присутствии оптимального количества антигена.

На этом основании было предложено выражать титр антисывороток отношением количества комплемента, необходимого для 50% гемолиза в присутствии иммунной сыворотки и оптимального количества антигена, к количеству комплемента, к-рое необходимо для 50% гемолиза в присутствии только иммунной сыворотки. Однако в более поздних работах была выявлена отчетливая гетерогенность антител одной и той же специфичности в отношении способности связывать комплемент, поэтому количество связанного иммунной сывороткой комплемента не может служить достаточно точной мерой содержания в ней антител.

Одной из модификаций РСК является непрямая РСК, или реакция задержки связывания комплемента, предложенная в 1948 г. Райсом для обнаружения антител в сыворотках крови птиц и нек-рых млекопитающих.

Сыворотки крови этих животных после прогревания не связывают комплемент в обычной РСК, хотя, по данным других серологических тестов, содержат антитела, соединяющиеся с гомологичным антигеном.

Принцип непрямой РСК состоит в конкурентном связывании антигена антителами, не обладающими компле-ментсвязывающей активностью, что препятствует его последующему связыванию комплементсвязывающими антителами той же специфичности, но от другого вида. Непрямая РСК применяется в ветеринарии для определения орнитоза у птиц и ящура у крупного рогатого скота.

Другой модификацией РСК являются активные методы РСК, в к-рых используют комплемент и естественные гемолизины, содержащиеся в исследуемых сыворотках крови. Преимущество активных методов перед обычной РСК — титрование непрогретых иммунных сывороток.

Активные методы предназначены для определения антител, титры к-рых настолько низки, что они не определяются после температурной инактивации комплемента в исследуемых сыворотках. Впервые такой метод был описан в 1908 г. Н. А. Черногубовым.

К активным методам можно причислить и реакцию потребления комплемента, в к-рой используют комплемент титруемой сыворотки, но в индикаторной фазе используют обычную гемолитическую систему. Активные методы применяют при диагностике сифилиса, определении ауто- и гомоантител.

См. также Вирусологические исследования, Иммунодиагностика, Серологические исследования.

Библиография:

Иммунохимический анализ, под ред. Л. А. Зильбера, с. 79, М., 1968, библиогр.;

Калинин В. С. и Гинзбург С. И. Модификация реакции связывания комплемента и ее применение, М., 1946; Коников А. П. Модификация реакции связывания комплемента для количественного определения антигенов и антител, Журн. микр., эпид. и иммун., № 1, с. 57, 1953; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., М.

, 1968; Резникова Л. С. Комплемент и его значение в иммунологических реакциях, М., 1967, библиогр.; Руководство по иммунологии, под ред. О. Е. Вязова и Ш. X. Ходжаева, с. 316, М., 1973; Bordet J. е. Gengou О. Sur I’existence de substances sensibilisatrices dans la plupart de serums antimicrobiens, Ann. Inst. Pasteur, p.

289, 1901; Rice С. E. Some factors influencing selection of complement-fixa-tion method, J. Immunol., v. 59, p. 95, 1948; Wallace A. L., Osier A. G. a. Mayer М. M. Quantitative studies of complement-fixation, estimation of complement-fixing potency of immune sera and its relation to antibody-nitrogen content, ibid., v. 65, p.

661, 1950.

И. А. Тарханова.

Источник: https://xn--90aw5c.xn--c1avg/index.php/%D0%A0%D0%95%D0%90%D0%9A%D0%A6%D0%98%D0%AF_%D0%A1%D0%92%D0%AF%D0%97%D0%AB%D0%92%D0%90%D0%9D%D0%98%D0%AF_%D0%9A%D0%9E%D0%9C%D0%9F%D0%9B%D0%95%D0%9C%D0%95%D0%9D%D0%A2%D0%90

Medic-studio
Добавить комментарий