Результаты морфологического исследования через 1 месяц

Морфологические методы исследования

Результаты морфологического исследования через 1 месяц

Практически во всех случаях точный диагноз онкологического заболевания может быть установлен только на основании результатов исследования образца опухолевой ткани, полученной у пациента. Наиболее часто с этой целью используются следующие методы получения биологического материала:

  • Пункция (прокол) опухоли тонкой иглой;
  • Биопсия опухоли при помощи толстой иглы, в ходе которой можно получить столбик опухолевой ткани;
  • Эндоскопическая биопсия, во время которой в тело человека вводится специальная подвижная тонкая трубка (эндоскоп) при помощи которой осуществляется забор опухолевого материала;
  • Удаление во время хирургическое операции всего новообразования или его части

​В большинстве случаев забор опухолевой ткани осуществляется с использованием того или иного метода обезболивания (анестезии).

Пункция

Во время пункции возможно получить небольшое количестве клеток для цитологического исследования. Во время выполнения этого вмешательства врач вводит в опухоль тонкую иглу и при помощи шприца забирает небольшое количество материала. После этого полученная ткань (жидкость и содержащиеся в ней клетки) помещается на специальное предметное стекло.

Данный метод исследования называется цитологическое исследование (цитология), он дает возможность получить информацию об отдельных клетках, из которых состоит исследованная ткань. Пункция является наименее травматичным методом получения материала для исследования, однако его информативности в некоторых случаях может быть недостаточно.

К примеру, отрицательные результаты пункции не всегда означают отсутствие опухолевого роста.

Для цитологического исследования также может быть использована слюна, мокрота, моча, жидкость, скопившаяся в брюшной или плевральной полости (асцит или плеврит), а также мазки или смывы из половых путей, дыхательных путей и т.д.

Также используют отпечатки с патологических образований (язв, эрозий).

В последнем случае предметное стекло прикладывается к интересующей зоне, после чего изготавливается материал, аналогичным образом может быть взят мазок-отпечаток при котором с патологического образования соскребается материал при помощи шпателя, скальпеля или других инструментов.

Биопсия

В отличие от пункции при проведении биопсии удается получить значительно большее количество опухолевой ткани, данный вид забора материала применяется для получения материала для гистологического исследования материала. В ходе его выполнения можно получить точную информацию о строении опухолевой ткани.

В отличие от вышеописанного цитологического исследования результаты данного вида исследования отличаются большей точностью, кроме того, больший объем материала позволяет точнее установить диагноз (например, выявить точный подвид опухолевых клеток), и, в случае наличия необходимости, провести дополнительные иммуногистохимические методы обследования (подробнее описано ниже).

Несмотря на указанные преимущества, выполнение биопсии является более травматичной процедурой для организма, чем выполнение пункции.

В некоторых случаях проведение данного исследования может быть невозможно вследствие наличия высокого риска травматического повреждения близко расположенных к опухоли сосудов, например, при опухолях расположенных в области поджелудочной железы, в связи с чем пункция может быть единственным доступным методом получения материала для исследования.

Виды биопсии

Биопсия может осуществляться как под контролем зрения врача («на ощупь») так и под контролем специального оборудования, например ультразвукового аппарата или компьютерной томографии.

В наиболее сложных случаях, например, при биопсии новообразований, расположенных в головном мозге, используются специальные методы фиксации пациента, препятствующие смещению опухоли при заборе материала (стереотаксическая биопсия).

Существуют следующие основные виды биопсии:

  • Трепан-биопсия – забор столбика ткани при помощи полой трубки с заостренным краем. Наиболее часто применяется для биопсии костей и близких к ним по плотности опухолей;
  • Core-биопсия – забор столбика опухолевой ткани из мягких тканей при помощи специальной полой трубки с заостренным краем (толстой иглы). Для этого часто используются системы, напоминающие по своему устройству гарпун. Этот метод нашел очень широкое применение при исследовании новообразований молочной железы и других органов;
  • Щипковая биопсия – получение материала для исследования при помощи специальных щипцов;
  • Инцизионная биопсия – забор для исследования части новообразования. К инцизионной биопсии относится удаление части опухоли;
  • Эксцизионная (тотальная) биопсия – удаление и забор для исследования всего патологического образования. В некоторых случаях при небольших размерах опухоли целесообразным является её полное удаление с последующим проведением гистологического исследования. Если в ходе проведения этого исследования была удалена вся опухоль, этого может быть достаточно для того, чтобы считать пациента излеченным от онкологического заболевания. К эксцизионной биопсии может относиться и удаление опухоли в ходе хирургической операции.
  • Петлевая биопсия – забор материала при помощи специальной петли. Применяется при новообразованиях ЛОР-органов, гинекологии, а также при эндоскопических исследованиях. В качестве примера можно привести петлевую биопсию полипа в толстой кишке.

В зависимости от расположения опухоли биопсия может быть выполнена как снаружи через кожу, так и изнутри организма. С этой целью в организм могут вводиться эндоскоп, который представляет собой тонкую гибкую трубку, оснащенную видеокамерой и различными манипуляторами.

При помощи эндоскопических методов может быть осуществлена биопсия новообразований, расположенных в просвете желудочно-кишечного тракта (гастроскопия и колоноскопия), например, полипов толстой кишки, бронхов (бронхоскопия), мочевыводящих путей (цистоскопия), грудной клетки (торакоскопия) и брюшной полости (лапароскопия).

Выполнение гистологического исследования

Гистологическому исследованию в обязательном порядке подвергается любой удаленный материал, в том числе – после хирургического удаления опухоли в ходе оперативного этапа лечения. Изучение послеоперационного материала позволяет уточнить диагноз, распространенность процесса и его стадию, оценить наличие вовлечения в болезнь лимфатических узлов и т.д.

После получения материала для исследования любым из вышеуказанных способов он отправляется на исследование к специалисту по морфологическому изучению опухолей – патологоанатому (или патоморфологу), который обрабатывает полученную ткань необходимым образом и проводит её исследование. Так как ткань опухоли подвержена естественным процессам разрушения, необработанный материал может стать непригодным для дальнейших исследований. В первую очередь с целью обеспечения сохранности ткани проводится её обработка специальным фиксирующим раствором, например формалином.

После этого ткань запечатывается в парафин (воскоподобный материал) в результате чего образец опухолевой ткани становится пригодным для исследования и хранения в течение длительного времени.

Таким образом создаются так называемые «опухолевые блоки». Опухолевый блок – кусочек опухолевой ткани, запечатанный в парафин.

Как правило, изготавливается множество блоков, содержащих разные участки опухолевой ткани.

После этого с части или со всех или с части изготовленных блоков делаются тонкие срезы, пригодные для исследования под световым микроскопом («опухолевые стекла»).

Эти стекла врач-патоморфолог изучает под микроскопом, в некоторых случаях – после специальной окраски, которая позволяет лучше оценить те или иные детали строения опухоли.

В ходе изучения опухолевой ткани врач старается установить наличие или отсутствие признаков злокачественности опухоли, степень её злокачественности, вид клеток, из которых она возникла и т.д.

Иногда, в тех случаях, когда необходимо получение максимально быстрого ответа вместо запечатывания опухолевой ткани в парафин, применяется её быстрая заморозка с последующей «нарезкой» и изучением под микроскопом. Этот процесс занимает около 15-20 минут.

Данный метод применяется при необходимости интраоперационного исследования материала, когда непосредственно в процессе выполнения оперативного вмешательства хирургу необходимо получить гистологическую информацию, например, о наличии или отсутствии опухолевых клеток по краю резекции (отреза) для того, чтобы убедиться в радикальности выполненного вмешательства.

Результаты морфологического исследования

По результатам исследования врач-патоморфолог составляет цитологическое или гистологическое заключение, в котором отражаются результаты изучения образца опухолевой ткани под микроскопом, а также результаты гистохимических и молекулярных исследований, если они проводились. Как правило, гистологическое заключение может содержать следующую информацию:

  • Краткие сведения о пациенте, для того, чтобы исключить возможные ошибки, связанные с правильной идентификацией больного;
  • Информация о внешнем виде опухоли, например, её цвете, размерах, форме, внешних особенностях и виде на разрезе (макроскопическое описание);
  • Результаты микроскопического исследования опухоли, данные о наличии или отсутствии злокачественных клеток в изученных образцах, степени их злокачественности (как сильно клетки опухоли отличаются от нормальных клеток, как быстро они могут делиться и распространяться), данные о наличии или отсутствии роста клеток по краю резекции опухоли, вовлечении в процесс лимфатических узлов и т.д.
  • Патоморфологический диагноз, в котором отражается подвид опухоли. Врачи-патоморфологи в своих заключениях могут использовать следующие термины:
    • Гиперплазия – в образце обнаружены только нормальные клетки (т.е. нет признаков злокачественности), однако их количество значительно превышает норму. Данное состояние может указывать на наличие повышенного риска развития злокачественного новообразования;
    • Атипия – в образце обнаружены клетки, отличающиеся от нормальный, но не являющиеся злокачественными. Наличие подобных клеток означает повышенный риск развития рака;
    • Дисплазия – выявлен рост большого количества атипичных клеток в органе. Может быть предраковым состоянием;
    • Карцинома – в образце обнаружены клетки, являющиеся злокачественными, опухоль происходит из эпителиальных клеток (слизистая оболочка). Данный термин является синомимом слова «рак». Могут использоваться дополнительные уточнения, например «аденокарцинома».
    • Саркома – разновидность злокачественной опухоли, которая в отличие от рака опухолей исходит не из эпителия, например, слизистых оболочек, покрывающих внутренние полости органов, а из тканей иного происхождения, например костей (остеосаркома), мышц (лейомиосаркома), жировой ткани (липосаркома) и т.д. Саркомам присущи те же клинические характеристики, что и раковым опухолям, они способы к инфильтрирующему росту с разрушением окружающих тканей, метастазированию и т.д. Саркомы могут возникать практически в любой части тела.
    • Лимфома – злокачественная опухоль из клеток лимфатической системы (лимфоцитов);
    • Лейкоз – злокачественная опухоль, исходящая из клеток-предшественников нормальных клеток крови, исходящая из костного мозга;
  • В случае исследования послеоперационного материала – состояние краев резекции опухоли. Негативный край резекции означает, что опухоль была удалена полностью и по линии её удаления нет признаков наличия злокачественных клеток, позитивные – наличие клеток опухоли по краю резекции, что может означать неполное удаление опухоли.

Как правило, проведение гистологического исследования занимает до 10 дней. Обязательно сохраните у себя копию гистологического заключения, а также убедитесь в сохранности стекол и блоков

Дополнительные методы исследования

В ряде случаев для установления точного диагноза может понадобиться определение подвида опухоли, а также наличия в ней экспрессии (выработки) определенных белков, которые могут быть использованы в качестве «мишеней» для противоопухолевой терапии.

С этой целью врач-патоморфолог может дополнительно провести иммуногистохимическое исследование (ИГХ).

Суть ИГХ исследования заключается в обработке опухолевой ткани специальными антителами, которые связываются со своими белками-мишенями на поверхности опухолевых клеток.

После выполнения определенных процедур это приводит к тому, что эти белки становятся видны при микроскопическом исследовании опухоли, если они ей продуцируются.

Врач-патоморфолог может оценить «набор» белков, которые вырабатываются опухолью, а также степень экспрессии того или иного белка. ИГХ является незаменимым методом в следующих случаях:

  • Определить откуда исходит опухолевый процесс в том случае, если имеет место первично-множественное метастатическое поражение органов или метастазы исходят из невыявленного первичного очага;
  • Провести дифференциальный диагноз между различными видами злокачественных опухолей, например, меланомой, саркомой, раком и лимфомой;
  • Определить точную разновидность лейкоза или лимфомы.

ИГХ очень широко применяется при обследовании больных раком молочной железы. Всем пациенткам с этим диагноз проводится определение наличия в опухоли экспрессии рецепторов гормонов, эстрогена и прогестерона, а также скорости деления клеток (индекс Ki-67) и выраженности экспрессии белка HER2-neu.

Это необходимо для того, чтобы понять, какие именно механизмы запускают процессы деления опухолевых клеток. Избирательно подавляя эти механизмы можно блокировать процессы роста и деления опухолевых клеток.

Например, если установлено, что процессы роста опухолевых клеток стимулируют эстрогены и/или прогестерон, лишив злокачественные клетки «доступа» к ним можно добиться выраженного противоопухолевого эффекта.

Наличие в опухоли повышенной экспрессии белка HER2-neu ассоциировано с высокой её агрессивностью и быстрым ростом. Это требует применения специальных препаратов, избирательно воздействующих на этот сигнальный путь. Наиболее часто с этой целью применяется трастузумаб – моноклональное антитело, связывающее HER2-neu.

В отдельных случаях применяются дополнительные молекулярные методы изучения опухоли. В этом случае проводится дополнительное изучение генома злокачественных клеток. При некоторых заболеваниях это может дать ценную информацию для лечения.

К молекулярным методам исследования относится флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Эти методы исследования являются наиболее точными, но их проведение может потребовать дополнительного времени, кроме того они являются достаточно дорогостоящими.

Получение второго мнения

В некоторых случаях, особенно при лечении редкого заболевания, полезным может оказаться получение второго мнения (консультации другого специалиста) по результатам гистологического исследования.

Для этого вам понадобиться получить изготовленные стекла и опухолевые блоки и предоставить их на консультацию в выбранное вами учреждение.

Дополнительно следует предоставить актуальную выписку из вашей истории болезни и результаты предыдущих гистологических исследований, так как это может дать врачу ценную информацию.

Обратите внимание: проведение дополнительных исследований с целью получения второго мнения может быть платным.

Внимание! Информация в данном разделе не является заменой квалифицированного мнения врача, представлена исключительно в образовательных целях и не является руководством к действию.

Источник: https://www.russcpa.ru/patsientam/o-rake/morfologicheskie-metody-ssledovaniya/

Изучение остеоиндуктивной активности остеопластических материалов, содержащих рекомбинантный морфогенетический белок кости rhBMP-2, в экспериментальных моделях Долинер Михаил Эллевич

Результаты морфологического исследования через 1 месяц

к диссертации

Введение

1.Обзор литературы .11

1.1. Воспалительные и не воспалительные процессы в альвеолярных отростках верхней и нижней челюстей .11

1.2. Виды материалов для замещения костных дефектов 14

1.3. Носители и фиксация на них BMP .25

2. Материалы и методы исследования 29

2.1. Технология получения rhBMP-2 29

2.2.Технология получения остеопластического материала 29

2.3. Получение эксплантационного материала в эксперименте на культуре клеток-предшественников стромальных фибробластов костного мозга 30

2.4. Подготовка остеопластического материала с выращенными на его поверхности костномозговыми стромальными клетками к электронному сканирующему микроскопированию 32

2.5. Описание эксперимента на лабораторных животных 33

2.6. Описание экспериментальных групп 34

2.7. Техника операции .34

2.8. Оценка состояния животных после операции .37

2.9. Компьютерная томография 38

2.10. Морфологическое исследование .41

2.11. Документирование 42

2.12. Статистический анализ полученных данных .42

3. Результаты собственных исследований 43

3.1. Эксперимент со стромальными клетками-предшественниками костного мозга 43

3.2. Результаты сканирования 44

3.3. Оценка клинических признаков в эксперименте на лабораторных животных 47

3.4. Результаты морфологического исследования через 1 месяц .55

3.5. Результаты морфологического исследования через 2 месяца 61

3.6. Результаты морфологического исследования через 3 месяца 65

3.7. Оценка костеобразования во всех группах в течение всего срока наблюдения 71

3.8. Результаты компьютерной томографии 73

4. Обсуждение 77

Выводы 84

Практические рекомендации 85

Список сокращений 86

Список литературы

Виды материалов для замещения костных дефектов

Проблема восстановления костной ткани является актуальной задачей в современной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, о чем свидетельствуют непрекращающиеся поиски новых и совершенствование известных остеопластических материалов для восстановления дефектов костной ткани. (Анастасов А.Н., 2002; Беззубов А.Е., 2010)

Существует ряд воспалительных и не воспалительных процессов в челюстно-лицевой области, ведущих к деструктивным изменениям и образованию дефектов и полостей в костной ткани челюстей.(Леус П.А., 2002; Лобко С.С., 1997)

Выделяют несколько основных причин редукции альвеолярного гребня, сопровождающейся уменьшением объема и снижением высоты альвеолярного отростка верхней челюсти (Робустова Т.Г, 2003.

), а именно: образование одонтогенных кист, травматичное удаление зубов, сопровождающееся повреждением стенок альвеолы, развитие осложнений инфекционно воспалительного характера после удаления зуба (альвеолита, остеомиелита), заболевания пародонта: а) пародонтит, пародонтоз, сопровождающиеся резорбцией костной ткани альвеолярной части челюстей со снижением высоты межзубных, межкорневых перегородок; б) деструктивные формы периодонтита, сопровождающиеся резорбцией костной ткани вокруг апикальной части корней зубов и компактной пластинки дна верхнечелюстной пазухи.(Аснина С.А., 2004; Бакиев Б.А., 1985)

Длительное отсутствие функциональной нагрузки на альвеолярную часть челюсти после удаления зубов, некомпенсированной путем своевременного съемного протезирования так же ведет к атрофии костных структур и деформации альвеолярного отростка, по типу так называемой горизонтальной резорбции.(Безруков В.М., 2000; Кулаков А. А., 1997, 2008; Попов В.Ф., 2009) Позднее вертикальная потеря кости стабилизируется на уровне 0,1 мм в год. Эта резорбция может ускоряться, и плотность кости будет уменьшаться из-за системных факторов, таких как гормональный дисбаланс, метаболические факторы, воспаление и системные заболевания. Возраст и пол так же влияют на объем потери кости. (Mullender, 2005; Лосев Ф.Ф., 2000). Возникает остеопороз, при котором происходит перестройка архитектоники костной ткани (регрессивная трансформация губчатой кости в компактную).

Данные дефекты костной ткани, ее возрастная утрата или патологические состояния затрудняют реабилитацию пациентов не только посредством имплантации из-за недостатка объема костной ткани, но и могут доставлять трудности при протезировании в связи с плохой фиксацией съемных протезов.

Необходимость в классификации ограниченных костных дефектов в области адентии возникла давно. Сведения о вмешательствах, направленных на регенерацию кости при наличии таких дефектов, стали появляться в литературе с 1957 г.

Успешное устранение значительных костных дефектов (т.е. дефектов таких размеров и формы, когда вероятность самопроизвольной регенерации кости в области дефекта чрезвычайно мала) требует соблюдения определенных биологических принципов.

При этом становится возможным получение запланированного объема кости.

Сохранение всех стенок лунки после удаления зуба означает, что «костный конверт» остался интактным. Потеря большей или меньшей части окружающей альвеолу кости означает, что защитный механизм стабилизации кровяного сгустка нарушен и может понадобиться применение специальных методик для получения достаточного объема кости.(Кузнецова Н.Н., 2005)

Окончатый дефект Окончатым называют ограниченный со всех сторон дефект альвеолярного гребня с вестибулярной или язычной стороны, который образуется при установке имплантата в недостаточно широкий гребень. (Коротких Н.Г.

, 2004) Щелевидные дефекты Щелевидный дефект образуется при установке имплантата, когда обнажается не более 50% его диаметра от шейки в апикальном направлении. Щелевидный дефект I класса образуется, когда имплантат не выступает за наружную границу «костного конверта».

Щелевидным дефектом II класса называют такой дефект, когда имплантат выступает за наружную границу «костного конверта». (Барер Г.М.

, 1996) Дефицит ширины альвеолярного гребня Дефицит ширины альвеолярного гребня характеризуется тем, что при установке имплантата обнажение его будет более 50% диаметра от шейки в апикальном направлении.

При дефиците ширины альвеолярного гребня 1-го класса имплантат не выступает за наружную границу «костного конверта». Дефицит ширины альвеолярного гребня II-го класса характеризуется тем, что имплантат выступает за наружную границу «костного конверта». (Григорьян А.С., 1997)

Получение эксплантационного материала в эксперименте на культуре клеток-предшественников стромальных фибробластов костного мозга

Весь эксперимент на животных проводили в условиях вивария МГМСУ им. Евдокимова. (зав. вивария Комова Л.В.)

В исследовании использовали биокомпозиционный материал на основе недеминерализованного костного матрикса «Остеодент» в виде гранул в чистом виде и соединенный с рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости (rhBMP-2).

Синтез и соединение рекомбинантного морфогенетического белка с деминерализованным костным матриксом проводились на базе Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики Российской Академии Наук (ИТЭБ РАН) по методике, описанной зарубежными авторами (Malik D.K., 2007). Концентрация белка в имплантате составляла 0,6-0,8 мг/см.

В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс массой тела 400-500 г. Во всех случаях выполнялась операция по одной и той же методике.

В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс породы Wistar с массой тела 400-500 г в возрасте 4-5 месяцев. Животные были разделены на 3 группы: I-я – контрольная, II-я – группа сравнения и III-я – экспериментальная (по 18 крыс в каждой).

У животных II-ой группы (группы сравнения) дефект заполняли чистым недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», а у III-ей (экспериментальной) группы дефект заполняли недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», содержащим rhBMP-2. В контрольной группе дефект заживал под сгустком.

Из эксперимента животные выводились в следующие сроки: 1, 2, 3 месяца, по 6 крыс из каждой группы.

После выведения всех животных из эксперимента проводили КТ исследование черепа крысы. Следующим этапом выполняли сегментарную остеотомию свода черепа, после чего выделенный сегмент свода черепа фиксировали в формалине и помещали в пробирку для морфологического исследования. Исследования проводили в течение первых 10 дней после получения материала.

Все операции выполнялись под общим обезболиванием Золетил 100 0,2 мл. Во время операции животные фиксировались в положении на животе. После трехкратной обработки операционного поля 70% раствором спирта в области свода черепа крысы выполнялся кожный разрез длиной 3 см до кости.

Мягкие ткани гладилкой отсепаровывались от свода черепа и фиксировались пинцетом. В центре свода черепа при помощи физиодиспенсера с охлаждением стерильным физиологическим раствором при температуре 5С и трепана выполнялся бикортикальный костный дефект диаметром 8 мм. Рисунок 5.

Разрез в области свода черепа и формирование бикортикального

Образованный дефект высушивался при помощи стерильных марлевых салфеток и заполнялся чистым недеминерализованным костным матриксом либо насыщенным рекомбинантным морфогенетическим белком кости, заготовленным заранее (ортотопическая имплантация). Рана ушивалась узловыми швами наглухо. Кожный шов обрабатывался раствором бриллиантовой зелени.

В день операции и на следующий день все животные получали антибиотикотерапию: линкомицина гидрохлорид по 80 мг. в/мышечно. Животные содержались в клетках по 5 особей. Из эксперимента их выводили путем передозировки наркоза (соблюдались требования «Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах или в иных научных целях» от 18.03.1986 г.).

Повышение температуры тела Отек мягких тканей Увеличение регионарных лимфоузлов Наличие гиперемии Несостоятельность швов Наличие гематомы Нагноение раны Клиническую картину оценивали по набору этих клинических признаков по системе «Да» и «Нет», что соответствует числовым значениям «1» и «0», и заносили результаты в таблицы в процентах. Оценку течения раневого процесса у всех животных всех групп производили на 1-ые, 3-и, 5-ые и 7-е сутки после операции. На 7-ые сутки после операции снимали швы.

Для определения объема и качества восстановленного дефекта выполнялась компьютерная томография черепа крыс с последующей оценкой плотности костной ткани по шкале Хаунсфилда.

Компьютерная томография — это особый вид рентгенологического исследования, которое проводится посредством непрямого измерения ослабления или затухания, рентгеновских лучей из различных положений, определяемых вокруг обследуемого объекта.

Большинство КТ-сечений ориентированы вертикально по отношению к оси тела, которые называются аксиальными или поперечными срезами. Для каждого среза рентгеновская трубка поворачивается вокруг пациента, толщина среза выбирается заранее. Большинство КТ-сканеров работают по принципу постоянного вращения с веерообразным расхождением лучей.

При этом рентгеновская трубка и детектор жестко спарены, а их ротационные движения вокруг сканируемой области происходят одновременно с испусканием и улавливанием рентгеновского излучения. Таким образом, рентгеновские лучи, проходя через пациента, доходят до детекторов, расположенных на противоположной стороне.

Веерообразное расхождение происходит в диапазоне от 40 до 60, в зависимости от устройства аппарата, и определяется углом, начинающимся от фокусного пятна рентгеновской трубки и расширяющимся в виде сектора до наружных границ ряда детекторов. Обычно изображение формируется при каждом обороте в 360, полученных данных оказывается для этого достаточно.

В процессе сканирования во многих точках измеряют коэффициенты ослабления, формируя профайл затухания.

Исследование было выполнено в Красногвардейской ветеринарной клинике на аппарате ToshibaAsteionS4 по стандартной методике: толщина томографического среза 1 мм, обработка информации по программе мультипланарной и объемной поверхностной реконструкции в режиме сканирования томографических срезов Innerear, при напряжении на трубке 110 кв и 120 мАс.

Компьютерная томография

В качестве контроля адгезии фибробластов использовали препараты на предметном стекле. Адгезированные клетки распластывались, увеличивались в размерах, формировали монослой, в котором визуализировались плотные контакты между клетками, клетки начинали синтезировать коллаген и межклеточный матрикс.

На гладкой поверхности образцов «Остеодент» адгезированные фибробласты выглядели таким же образом, как на поверхности стекла.

На волокнистой поверхности материала «Остеодент» фибробласты адгезировались, но по сравнению с гладкой поверхностью хуже распластывались, плотность межклеточных контактов менее выражена, соответственно и синтез коллагена и межклеточного матрикса был меньше.

На шероховатой поверхности фибробласты адгезировались, но формирование межклеточных контактов и клеточного пласта было затруднено из-за гранул на шероховатой поверхности.

Таким образом, в результате проведенного исследования было установлено, что фибробласты способны адгезироваться к поверхности препарата «Остеодент», несмотря на наличие морфогенетического белка кости в составе остеопластического материала. Принципиальной разницы между порошком и гранулами препарата «Остеодент» по морфологическим свойствам и характером взаимодействия с фибробластами не выявлено. Для адгезии, распластывания и формирования пласта фибробластами определяющим фактором является рельеф поверхности – чем более гладкой является поверхность, тем больше фибробластов адгезируется.

Для оценки остеиндуктивной активности морфогенетического белка кости (rhBMP-2) в составе остеопластического материала «Остеодент» в рамках работы был запланирован и проведен эксперимент на лабораторных животных. Эксперимент на лабораторных животных проводился на базе вивария Московского Государственного Медико-Стоматологического Университета им. Евдокимова.

Дефект заживал под недеминерализованным чистым сгустком костным матриксом, недеминерализованным содержащим rhBMP-2 костным матриксом В послеоперационный период животным производили антисептическую обработку раны раствором хлоргексидина 0,05% на первые, третьи, пятые и седьмые сутки. У животных всех групп швы снимали на седьмые сутки после операции.

При осмотре фиксировали признаки послеоперационных воспалительных явлений и проводили оценку течения раневого процесса у всех животных на первые, третьи, пятые и седьмые сутки после операции и заносили результат в таблицы.

Клиническая картина была оценена по набору клинических признаков, которые оценивали по системе «Да» и «Нет», что соответствовало баллам 1 и 0, и выражали в процентном соотношении.

контрольной группе на первые сутки повышение температуры тела наблюдалось у 66,7% животных, отек мягких тканей у 72,2%, наличие гиперемии у 11,1%. На третьи сутки повышение температуры тела наблюдалось у 33,3%, отек мягких тканей у 55,6%, наличие гиперемии у 5,6%.

На пятые сутки повышение температуры тела определялось у 11,1%, отек мягких тканей у 33,3%, наличие гиперемии у 5,6%, наличие гематомы у 11,1%. На седьмые сутки повышение температуры тела было у 5,6%, отек мягких тканей у 11,1%, наличие гематомы у 11,1%.

Несостоятельность швов и нагноение раны не наблюдалось ни в один срок

В группе сравнения на первые сутки повышение температуры тела наблюдалось у 94,4% животных, отек мягких тканей у 83,3%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 27,8%.

На третьи сутки повышение температуры тела определялось у 77,8%, отек мягких тканей у 77,8%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 66,7%. На пятые сутки повышение температуры тела определялось у 38,9%, отек мягких тканей у 44,4%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 27,8%.

На седьмые сутки повышение температуры тела определялось у 16,7%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 11,1%, несостоятельность швов у 11,1%, нагноение

В экспериментальной группе на первые сутки повышение температуры тела наблюдалось у 94,4% животных, отек мягких тканей у 72,2%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 27,8%, наличие гематомы у 5,6%.

На третьи сутки повышение температуры тела определялось у 83,3%, отек мягких тканей у 83,3%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 61,1%, наличие гематомы у 5,6%. На пятые сутки повышение температуры тела определялось у 33,3%, отек мягких тканей у 38,9%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 27,8%, наличие гематомы у 5,6%.

На седьмые сутки повышение температуры тела определялось у 11,1%, увеличение регионарных лимфоузлов у 5,6%, наличие гиперемии у 5,6%, несостоятельность швов у 5,6%, нагноение раны у 5,6%.

На первые сутки после операции в контрольной группе определялось повышение температуры тела, отек мягких тканей и наличие гиперемии. В группе сравнения и экспериментальной группе определялось также увеличение регионарных лимфоузлов, клиническая картина в этих группах схожа, однако повышение температуры тела и наличие гиперемии наблюдались чаще, чем в контрольной.

Результаты морфологического исследования через 1 месяц

Дефекты костной ткани, ее возрастная утрата или потеря в связи с патологическими состояниями не могут быть полностью устранены путем физиологической регенерации или посредством хирургического вмешательства.

В таких ситуациях используются биоматериалы или их синтетические аналоги. Имеющиеся методы далеко не всегда позволяют не только заполнить объем имеющегося дефекта, но и создать условия выполнения механической функции кости.

Иными словами, мы приблизились к созданию достаточного объема костной ткани, но структурные характеристики получаемого костного регенерата далеки от желаемого.

Возникшую проблему мы и попытались решить в представленном исследовании.

Метод, оказывающий влияние на механизмы ремоделирования костной ткани, связан с использованием рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости (rhBMP-2), который, в свою очередь, активизирует функцию остеобластов.

Изучение свойств и возможностей использования rhBMP-2 проводится в настоящее время в большинстве медико-биологических центров мира. На первом этапе исследования задача состояла в синтезе и получении непосредственно самого белка для планируемых исследований.

Эта задача была успешно решена в содружестве с Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН, лаборатория тканевой инженерии, руководитель лаборатории д.ф.-м.н Акатов Владимир Семенович. Белок был получен методом генной инженерии, который включал следующие этапы: 1. Генноинженерная сборка биологической конструкции; 2.

Введение созданной молекулы в клетки бактерии E.Coli; 3. Наработка достаточного объема бактериальной массы для получения необходимого количества белка; 4. Выделение белка из бактериальной массы и его биохимическая очистка. Проведенный анализ литературных данных позволил оптимально выбрать биоматериал, необходимый для совместного использования с rhBMP-2.

Таким материалом выступил «Остеодент», представляющий собой стерильный биопластический материал на основе костного ксеноколлагена, насыщенный сульфатированными гликозаминогликанами (сГАГ) для направленной костной регенерации, производитель ЗАО «ЭОЗ ВладМиВа»

В дальнейшем, получив необходимую композицию (биоматериал с rhBMP-2), мы приступили к лабораторным исследованиям.

В лаборатории стромальной регуляции иммунитета ФГБУ НИИ им. Н.Ф. Гамалеи под руководством д.м.н. проф. Р.К.

Чайлахяна был запланирован и успешно проведен эксперимент, целью которого ставилось выявление имеющееся митотической активности клеток-предшественников стромальных фибробластов костного мозга и визуально оценить их адгезивную активность на поверхности предложенного биоматериала, содержащего rhBMP-2.

Клетки-предшественники стромальных фибробластов костного мозга получали следующим методом: крыс усыпляли эфиром. С соблюдением правил асептики через разрез на задней части бедра выделяли бедренные и большеберцовые кости. Эпифизы костей обрезали и шприцом выдували костный мозг во флакон с питательной средой.

Фрагменты костного мозга пропускали через шприц с последовательно уменьшающимся диаметром игл при минимальном давлении в нем до получения гомогенной взвеси клеток.

Взвесь дважды отмывали центрифугированием при 4С (400g), осадок ресуспендировали в свежей питательной среде, фильтровали через 4-х слойный капроновый фильтр.

Для получения штаммов стромальных клеток-предшественников костного мозга эксплантировали во флаконы. На 10-14 день культивирования, когда колонии стромальных фибробластов были полностью сформированы, проводили I пассаж.

Для изучения взаимодействия штаммов остеогенных клеток предшественников с остеопластическим материалом, насыщенным рекомбинантным человеческим морфогенетическим белком кости rhBMP-2, его засеивали пассивированными клетками. Культивирование проводили в течение 5-7 дней. Затем производили фиксацию.

Перед фиксацией культуральную среду сливали, материал несколько раз промывали физиологическим раствором и на 30 мин. заливали 80% этанолом. Фиксированные на остеопластическом материале, содержащем рекомбинантный морфогенетический белок кости rhBMP-2, культуры окрашивали по Гимзе. После этого оценивали полученный результат под микроскопом.

Визуальная оценка клеток-предшественников на остеопластическом материале с помощью сканирующего электронного микроскопа показала, что наличие rhBMP-2 не препятствует прикреплению и фиксации клеточного материала на недеминерализованном костном матриксе. Данное исследование проводилось в лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ НИИ им. Н.Ф. Гамалеи, руководитель лаборатории – д.м.н. Л.В. Диденко.

После завершения лабораторной части исследования приступили к эксперименту на животных. Для проведения экспериментальной части нами была разработана экспериментальная модель критического дефекта в своде черепа крысы.

Используемая нами экспериментальная модель дефекта, по мнению зарубежных исследователей, является максимально информативной и приближенной к естественным условиям функционирования остеоиндуктивного биоматериала в организме реципиента.

Моделирование процесса восполнения дефекта дает возможность исследовать плотность, объем и качество образующегося регенерата и оценить остеоиндуктивные характеристики в цифровых значениях.

Так же исследовалось влияние рекомбинантного человеческого морфогенетического белка кости rhBMP-2 в составе недеминерализованного костного матрикса на процесс костеобразования как в зоне хирургического вмешательства, так и в сегменте в целом.

В эксперименте использовано 54 половозрелых самцов белых крыс породы Вистар с массой тела 400-500 г в возрасте 4-5 месяцев. Животные были разделены на 3 группы: I-я – контрольная, II-я – группа сравнения и III-я – экспериментальная (по 18 крыс в каждой).

У животных II-ой (экспериментальной) группы дефект заполняли чистым недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», а у III-ей (экспериментальной) группы дефект заполняли недеминерализованным костным матриксом «Остеодент», содержащим rhBMP-2. В контрольной группе дефект заживал под сгустком.

Из эксперимента животные выводились в следующие сроки: 1, 2, 3 месяца, по 6 крыс из каждой группы.

В послеоперационный период животным производили антисептическую обработку раны раствором хлоргексидина 0,05% на первые, третьи, пятые и седьмые сутки. У животных всех групп швы снимали на седьмые сутки после операции.

При осмотре отмечали признаки послеоперационных воспалительных явлений и проводили оценку течения раневого процесса на первые, третьи, пятые и седьмые сутки после операции и заносили результат в таблицы.

Клиническая картина была оценена по набору клинических признаков, которые оценивали по системе «Да» и «Нет», что соответствовало баллам 1 и 0, и выражали в процентном соотношении.

Источник: http://www.dslib.net/stomatologia/izuchenie-osteoinduktivnoj-aktivnosti-osteoplasticheskih-materialov-soderzhawih.html

Medic-studio
Добавить комментарий