Сложные методы окраски бактерий: Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод

Сложные методы окраски бактерий, их применение

Сложные методы окраски бактерий: Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод

При сложных методах окраски используются ряд красок в определенной последовательности. Такие методы используются для выявления в патологическом материале конкретных микроорганизмов, а также определения особенностей их ультраструктуры.

1. Окраска по Граму используется для определения типа строения клеточной стенки. Это основной метод в бактериологии. В зависимости от окраски по Грамму все бактерии подразделяются на грампо-ложительные и грамотрицательные.

2. Окраска по Цилю-Нильсену используется для выявления кислотоустойчивых бактерий (а именно – микобактерий), а также для обнаружения спор.

3. Окраска по Нейссеру используется для выявления цитоплазматических включений волютина и идентификации по их наличию коринебактерий (в частности – возбудителей дифтерии).

4. Окраска по Бури-Гинсу используется для выявления макрокапсул.

5. Окраска по Морозову используется для выявления жгутиков. Этот метод окраски используется также для выявления трепонем. Кроме того, окраску по Морозову используют в вирусологии – для выявления в оспенных пузырьках вирусов натуральной и ветряной оспы.

6. Окраска по Здрадовскому используется для выявления риккетсий и хламидий.

7. Окраска по Романовскому-Гимзе также, наряду с окраской по Здрадовскому, используется для вы-явления риккетсий и хламидий; кроме того, этот метод окраски используется для выявления спирохет (с их идентификацией до рода в зависимости от цвета окрашивания), а также для выявления простейших.

12. Окраска по Граму, техника, назначение. Отличие грам- и грам+ бактерий.

Метод Грама — метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Г. К. Грамом.

По Граму бактерии окрашивают осно́вными красителями — генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором йода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными, называют грамположительными бактериями — в отличие от грамотрицательных (Грам (−)), которые при промывке обесцвечиваются.

Использование в диагностике

Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Грамположительны кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей, они окрашиваются в иссиня-чёрный (тёмно-синий) цвет.

Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный цвет, ядра клеток приобретают ярко-красный цвет, цитоплазма — розовый или малиновый.

Техника проведения окраски

Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.

Для окраски по Граму чаще используют красители: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные Грам (+) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином Грам (+) микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.

Грамотрицательные Грам (−) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.

Отличие грам+ и грам- бактерий

У грамположительных бактерий клеточные стенки содержат мало липидов, а у грамотрицательных клеточные стенки, напротив богаты липидами.

И у тех и у других жесткий каркас образуется в результате ковалентного связывания полисахаридных и пептидных цепей.

Однако, к этой структурной основе присоединяются некоторые специфические для данной бактерии компоненты, которые у грамположительных и грамотрицательных бактерий имеют разный состав.

Стенки бактериальных клеток содержат еще и некоторые сопутствующие компоненты, которые у разных бактерий варьируются. У грамположительных бактерий это тейхоевые кислоты, полисахариды, полипептиды или белки.

У грамотрицательных бактерий больше сопутствующих компонентов, вплетенных в муреиновую сеть. Это полипептиды, липопротеины, сложные липополисахариды.

Все эти компоненты наделяют клетки грамотрицательных бактерий сложной антигенной специфичностью, а также акцепторной специфичностью по отношению к вирусам.

Таким образом, клеточная стенка грамположительной бактерии представляет собой жесткий хрупкий корпус бактерии, а клеточные стенки грамотрицательных бактерий имеют мягкое покрытие, богатое липидами и укрывающее лежащий под ними муреиновый скелет.

Источник: https://cyberpedia.su/3x608c.html

Окрашивание по Граму: методика и теоретическое объяснение

Сложные методы окраски бактерий: Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод

Окрашивание по Граму широко распространено в микробиологии, так как это один из самых простых способов дифференциации бактерий в зависимости от состава их клеточной стенки.

По Граму все бактерии можно разделить на грамположительные (Грам(+)) и грамотрицательные (Грам(-)).

Метод окрашивания по Граму был разработан в 1884 году, и с того времени не утратил популярности, хотя и неоднократно модифицировался.

Структура клеточной стенки

Окрашивание по Граму позволяет выявить, к грамположительным или грамотрицательным относится та или иная бактерия. Деление бактерий на Грам(+) и Грам(-) осуществляется в соответствие со строением их клеточной стенки.

Клеточная стенка в наибольшем количестве содержит пептидогликан (муреин) – сложное вещество, в состав которого входят пептапептид и гликан. Гликан состоит из чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных друг с другом β-1,4-гликозидными связями. Пептидогликан обеспечивает поддержание формы клетки, осмотическую защиту, а также антигенные функции.

Основные различия грамположительных и грамотрицательных бактерий

У различных бактерий толщина слоя пептидогликана не одинакова. У бактерий, которые относят к грамположительным, она составляет от 15 до 80 нм, в то время как у грамотрицательных – от 2 до 8 нм.

В то же время у грамотрицательных бактерий под слоем пептидогликана есть особая структура, которой нет у грамположительных бактерий – периплазматическое пространство. Это пространство заполнено гидролитическими ферментами – β-лактамазой, рибонуклеазой 1, фосфатазой.

Именно эти ферменты ответственны за резистентность грамотрицательных бактерий в отношении многих антибиотиков.

Слой пептидогликана Грам(-) бактерий связан с липополисахаридом – антигенной структурой, содержащей эндотоксин. У Грам(+) бактерий похожие функции выполняют тейхоевые кислоты.

У грамотрицательных бактерий присутствует дополнительная структура – внешняя мембрана.

Суть метода окрашивания

Перед тем как начать окрашивание, готовят мазки исследуемых бактерий. Для этого на предметное стекло капают воду и бактериальной петлей добавляют туда культуру микроорганизмов.

Затем, после полного высыхания воды, мазок фиксируют – предметное стекло проносят несколько раз над пламенем горелки.

Окрашивание мазков по Граму более эффективно, чем окрашивание живых бактерий – с мертвыми клетками лучше связываются молекулы красителя.

Окрашивание производится в несколько этапов:

  1. На фиксированный мазок накладывают небольшие кусочки фильтровальной бумаги и наливают основной краситель – генцианвиолет или метиленовый синий.
  2. Спустя 3-5 минут снимают окрашенную фильтровальную бумагу и заливают мазок раствором Люголя на 1 минуту. При этом препарат темнеет.
  3. Сливают раствор Люголя и обрабатывают мазок чистым этиловым спиртом: капают несколько капель на препарат, спустя 20 секунд сливают. Процедуру повторяют 2-3 раза.
  4. Промывают стекло с исследуемым препаратом дистиллированной водой.
  5. Производят дополнительное окрашивание – докрашивают препарат фуксином. Спустя 1-2 минуты краситель смывают.
  6. После высыхания воды изучают мазок под микроскопом. Грамположительные бактерии будут иметь сине-фиолетовый цвет, грамотрицательные – розовый или красный.

Причины различного характера окрашивания

Как было описано выше, при окрашивании бактерий по Граму грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в красный или розовый.

Причина дифференциального окрашивания бактерий по этому методу состоит в том, что после попадания в клетку растворимой формы генцианвиолета краситель переходит в нерастворимую йодную форму.

Во время обработки бактерии этиловым спиртом под действием этого неполярного растворителя из мембраны экстрагируются липиды. После этого мембрана становится пористой и больше не является существенным препятствием для вымывания красителя.

Однако пептидогликан более устойчив к действию неполярных растворителей, в том числе и спирта. Именно он препятствует вымыванию красителя, поэтому бактерии с толстым муреиновым слоем окрашиваются в сине-фиолетовый цвет (грамположительно), и после обработки спиртом свой цвет не меняют.

Тонкий муреиновый слой грамотрицательных бактерий не может удержать в клетке молекулы красителя, поэтому после действия спирта они становятся бесцветными – окрашиваются грамотрицательно.

После воздействия на мазок фуксином при окрашивании по Граму грамположительные бактерии остаются сине-фиолетовыми, а грамотрицательные приобретают розово-красный оттенок.

Примеры Грам(+) и Грам(-) бактерий

К грамотрицательным относятся цианобактерии, серобактерии, железобактерии, хламидии, риккетсии, уксусные бактерии, многие метилобактерии, тионовые бактерии, арсенитобактерии, карбоксидобактерии.

Грамположительными являются бифидобактерии, многие водные бактерии, стрептококки и стафилококки.

Источник: https://FB.ru/article/395322/okrashivanie-po-gramu-metodika-i-teoreticheskoe-obyyasnenie

4 Простые и сложные методы окраски

Сложные методы окраски бактерий: Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод

Выделяют простыеи сложные методы окраски.

Простыми методамиокрашиванияназывают окрашивание пре-

паратов каким-либоодним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты) плохо выявляемые с помощьюпозитивных красителей, легко выявляютсяпри окрашивании негативными красителями.

Техникаприготовленияпрепаратазаключается в следующем. Фиксированныйпрепарат помещают на параллельныестеклянные рейки (мостик), которые лежатнад кюветой. На мазок наносят с помощьюкапельницы 1 % водный раствор фуксинаили метиленового синего на 1–2 мин.Следят за тем, чтобы во время окрашиванияраствор красителя не подсыхал.

Послезавершения окрашивания, красительсливают. Препарат промывают водой дотех пор, пока стекающая воде не станетбесцветной. Затем препарат высушивают.Для этого нижнюю сторону препаратапромокают фильтровальной бумагой, аверхнюю сторону осторожно обсушиваютс боков, не дотрагиваясь до мазка.Препарат окончательно досушивают навоздухе или высоко над пламенем спиртовки.

Для получения более чистых препаратовкраситель наносят на мазок, покрытыйфильтровальной бумагой. Методокрашивания в модификации Синевапозволяет использовать вместо растворакрасителя заранее пропитанную имфильтровальную бумагу. В правильноокрашенном и хорошо промытом препаратеполе зрения светлое и чистое, окрашенытолько клетки.

Микроскопируют препаратыс иммерсионной системой.

Присложных(дифференцирующих) методахокрашивания на один и тот же препаратвоздействуют несколькими красящимивеществами, одно из которых называетсяосновным, другие – дополнительными.

Кроме красителей используются различныеобесцвечивающие вещества: спирты,кислоты, ацетон и др.

С помощью сложныхметодов окрашивания выявляют цитологическиеособенности клеток микроорганизмов(клеточные структуры, включения и т.д.).

Окраска пометоду Грама являетсясамым универсальным из сложных методовокраски. Окраска положена в основудифференциации бактерий и отражаетспособность клеток воспринимать иудерживать внутри клетки красящийкомплекс генцианового фиолетового ийода либо терять его после обработкиспиртом.

Соответственно выделяютграмположительные (Bacillus,Clostridium,Staphylococcus,Streptococcus,Lactobacillus,Sarcina,etc.

)играмотрицательные (Escherichia,Pseudomonas,Erwinia,Neisseria,Rickettsia,etc.)формы.

Дляполучения достоверных результатовнеобходимо готовить мазки для окраскипо Граму из молодых, активно растущих(обычно односуточных) культур, так какклетки из старых культур иногда даютнеустойчивую реакцию по Граму.

Грамотрицательные бактерии могутвыглядеть как грамположительные, еслибактериальная пленка (мазок) слишкомтолста и обесцвечивание спиртом непроведено до конца.

Грамположительныебактерии могут выглядеть какграмотрицательные, если мазокпереобесцвечен спиртом.

Сущностьметода.На поверхности цитоплазмы клетки уграмположительных микроорганизмоврасполагается комплекс из белка ирибонуклеата магния, отсутствующий уграмотрицательных бактерий.

Приокрашивании по Граму на поверхностиграмположительных клеток образуетсяпрочный комплекс из белка, рибонуклеатамагния, генцианвиолета и йода, неразрушающийся при обработке спиртом.Такие бактерии остаются окрашенными всине-фиолетовый цвет.

Грамотрицательныебактерии не обладают свойством удерживатькраску и при обработке спиртомобесцвечиваются. Для выявления ихпрепарат докрашивают фуксином. При этомграмотрицательные бактерии окрашиваютсяв красный цвет.

Этапыдифференцированного окрашивания поГраму:

  • Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги (1,5 х 1,5 см) и на него до полного смачивания наносят карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллический фиолетовый (чаще используют модификацию Синева). Окрашивание проводят на протяжении 1–2 мин.
  • Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на препарат раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.
  • Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом. Для этого препарат 2–3 раза помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек (время обесцвечивания – не более 30 с), либо наливают 2–4 капли спирта на мазок на 30–45 с.
  • Препарат быстро промывают водой (как описано выше).
  • Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1–2 мин водным раствором фуксина (фуксин Пфейффера).
  • Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.
  • микроскопируют с иммерсионной системой.
  • Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый.

Нуклеоид.Обнаружить нуклеоид в бактериальнойклетке при помощи светового микроскопатрудно.

Для избирательного окрашиваниянуклеоида фиксированные клеткипредварительно обрабатывают рибонуклеазойили разбавленной соляной кислотой,чтобы разрушить рибосомальную РНК.

Последующее окрашивание основнымкрасителем позволяет выявить нуклеоидв виде плотных тел с неправильнымиочертаниями, расположенные в центреили на полюсах клетки.

Окраскакислотоустойчивых бактерий по методуЦиля-Нильсенаотражает особенности микобактерий инокардий.

Принципметода. Кислотоустойчивость этих бактерийсвязана с высоким содержанием липидов в клеточной стенке.

Кислотоустойчивыебактерии окрашиваются карболовымфуксином Циля при нагревании препаратав красный цвет и сохраняют эту окраскупосле обесцвечивания серной кислотой.

Некислотоустойчивые бактерииобесцвечиваются кислотой и в последующемдокрашиваются метиленовым синим в синий цвет.

Длявыявлениякапсулпользуются различными методами, средикоторых можно отметить методБурри иБурри-Гинса.В основе метода лежит негативноеконтрастирование.

Так как капсула илитело микробной клетки не воспринимает красители, тушью окрашивается лишь фонмикропрепарата. Капсула видна какнеокрашенная зона на темном фоне тушевогомазка.

По методу Бурри-Гинса теламикробных клеток дополнительноокрашиваются в красный цвет фуксином.

Дляокрашиванияжгутиковпредложено несколько методов, общимэтапом для которых является протравливаниепрепарата (обычно растворами таннина,KAl(SO4)2,HgCl2)и последующая окраска (чаще карболовымраствором фуксина).

В результате этогона жгутиках происходит осаждениекрасителя, благодаря чему одновременнодостигается как увеличение их толщины,так и уменьшение прозрачности. Однимиз предложенных методов окрашиванияжгутиков является методЛейфзона.Препарат микроскопируют с иммерсионнойсистемой.

Клеткибактерий окрашиваются в красный цвет,жгутики принимают вид толстых нитей,отходящих от клетки.

Вопросы длясамоконтроля

1 Перечислитеосновные морфологические типы клетокмикроорганизмов.

2 Охарактеризуйтесхематичное строение бактериальнойклетки.

3 Перечислите этапыприготовления фиксированных препаратовмикроорганизмов, охарактеризуйте их.

5 Классифицируйтеиспользуемые в микробиологии красители,охарактеризуйте их.

Практическоезанятие 4

Цель:ознакомлениесметодикойприготовления фиксированных препаратов,простыми и сложными методами окраски;ознакомление с морфологией и цитологиейразличных микроорганизмов.

Материалы иоборудование:микроскопы биологические, предметныеи покровные стекла, спиртовки, бактериальныепетли, иммерсионное масло, стерильныепипетки, пинцеты, фильтровальная бумага,спички, палочки ватные гигиенические,маркеры, стерильные чашки Петри, нагруппу – в 50 мл колбе стерильнаяводопроводная вода, дистиллированнаявода для промывки, промывалки, кюветы,мостики, набор готовых растворов красокв штативе, спирт 960, пипетки, настои из естественныхматериалов: мяса, гороха и т.д.

Источник: https://studfile.net/preview/5244850/page:13/

Окраска бактерий по Граму

Сложные методы окраски бактерий: Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод

В продолжение микробиологической темы – окраска бактериальных клеток по методике Грама. Текст дублирует комментарии в видео (вдруг у кого-то сию минуту нет возможности проиграть ролик, а приобщиться к образованию хочется).

В микробиологии широко применяются различные методы окраски бактерий.

Конечно, можно производить наблюдение и без этих сложных манипуляций, но тогда при микроскопировании вы почти ничего не увидите, ведь коэффициент светопреломления бактерий близок к коэффициенту светопреломления жидкости, в которой они живут.

Для того, чтобы бактерии или какие-то их внутренние или внешние структуры чётко выделялись на фоне, применяют различные красители. Сегодня мы рассмотрим методику окраски по Граму, разработанную в 1884 году датским врачом Гансом Кристианом Грамом.

Исполнение методики начинается с приготовления фиксированного мазка культуры микроорганизмов. На предметное стекло наносится капля физиологического раствора, в которую микробиологической петлёй, прожжённой в пламени горелки, вносятся изучаемые бактерии.

Это может быть как сиюминутный соскоб или мазок, так и заранее выращенная колония. Все этапы должны производиться в условиях асептики, желательно в зоне пламени горелки.

Демонстрируемый способ выполнения методики призван лишь отразить последовательность внесения необходимых для окраски веществ и разъяснить роль каждого этапа.

Суть методики в визуальном разделении бактерий на две группы – грамположительные и грамотрицательные. Первые в итоге дифференциации выглядят под микроскопом как окрашенные в синий или фиолетовый цвет, а вторые – в розовый. Основная разница между ними в том, что грамотрицательные бактерии хуже воспринимают краситель из-за более сложного строения оболочки.

В частности, у них имеется дополнительная мембрана поверх клеточной стенки, препятствующая проникновению ненужных веществ. При этом пептидогликановый слой у них тоньше, чем у грамположительных бактерий. Именно эти особенности позволяют им проявлять патогенность.

В медицинской микробиологии почти не изучаются грамположительные бактерии, поскольку очень немногие из них способны вызывать болезни.

Нанесённый на стекло мазок высушивается на воздухе или высоко над пламенем горелки, чтобы не допустить закипания и денатурации белка, а затем фиксируется путём пронесения через пламя в течение короткого времени. Таким образом микроорганизмы погибают и надёжно приклеиваются к стеклу.

Теперь наступает время внесения красителя. Сперва происходит окраска генцианвиолетом. Это основной краситель трифенилметанового ряда: смесь пента- и гексаметилпараозанилинов с небольшим количеством декстрина и фуксина.

Он используется в медицине не только как краситель, но и как антисептическое средство.

Противомикробные свойства объясняются высокой проницаемостью сквозь бактериальные оболочки и воздействием на окислительно-восстановительные процессы.

Окраска длится 1-2 минуты, после чего генцианвиолет сливают и заливают образцы раствором Люголя. Это вещество, думаю, хорошо знакомо всем – им обрабатывают горло при ангине.

Раствор Люголя – это соединение йода с йодидом калия, что придаёт ему хорошую водорастворимость.

Соединяясь с кусочками генцианвиолета, который проник в клеточные стенки бактерий, йод образует прочное соединение сине-фиолетового цвета. Реакция тоже длится 1-2 минуты.

Теперь пришло время дифференциации, то есть разделения грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Для этого стекло с мазком несколько раз погружают в сосуд с 96%-ным этиловым спиртом до тех пор, пока стекающие капли не сравняются по цвету со спиртом в стакане.

При этой процедуре сине-фиолетовый комплекс вымывается из стенок грамотрицательных бактерий, оставаясь только в стенках грамположительных.

Для того, чтобы грамотрицательные бактерии не казались бесцветными, мазок промывается водой и дополнительно окрашивается водным раствором фуксина в течение тех же магических 1-2 минут.

Поскольку в стенке грамположительных бактерий уже есть краситель, они фуксином не окрашиваются. А грамотрицательные бактерии приобретают розовый цвет.

Мазок окончательно промывается водой, высушивается и препарат готов к микроскопированию.

Грамотрицательные бактерии (х1600):

Грамположительные бактерии (х1600):

P.S.: Напоминаю, что более подробно с этой и многими другими темами вы можете ознакомиться в видеозаписях в группе ВКонтакте (https://.com/public137215775), на канале (https://www..com/channel/UCe0PmlsjVJrRoQlBKGXDi2g) и на канале Твича (https://www.twitch.tv/ademortuus), где по вторникам и четвергам мы читаем всякие научные лекции в 20:00 по МСК.

Источник: https://pikabu.ru/story/okraska_bakteriy_po_gramu_5033331

Отличительные черты положительно и отрицательно окрашенных бактерий по граму – Мир Бактерий

Сложные методы окраски бактерий: Окраска мазков по методу Грамма Наиболее распространенный метод

27.05.2019

6.Раствор
Люголя.
2г KJ растворяют в 5 мл дистиллированной воды и в этот раствор добавляют 1 г йода. Дляускорения растворения эту смесь растирают в фарфоровой ступке, после чегодоливают водой до 300 мл. Используется при

окраске бактерий по Граму.

Растворыкрасителей после изготовления фильтруют, разливают в склянки с притертыми пробками и сохраняютв темном месте. Для повседневной работыкраски разливают в капельницы с притертыми пробками. Следует учитывать, что при длительном хранениирастворов кристаллы краски могут выпадать в осадок, поэтому препаратрекомендуется окрашивать через полоску

фильтровальной бумаги.

В лабораторной практикепользуются простыми и сложными методами окраски

микробных клеток.

При простой окраске нафиксированный мазок наносят раствор какого-либо

одного красителя, например, разведенного фуксина, который интенсивно окрашивает вегетативные клетки бактерий.

Сущность сложных методовокраски заключается в том, что препарат окрашивают

не одной, а двумя или большим количеством красок.

Окраска по Граму

Наиболеешироко в микробиологической практике применяется сложный метод окраски по Граму(пред ложен впервые в 1884 г. датским ученым X. Грамом). Метод является одним из важнейших опознаватель-ных

признаков при определении вида бактерий.

Сущностьметода окраски по Граму заключается в том, что все бактерии по способностиокрашиваться красителями (генциан-виолет или кристаллвиолет с йодом) делятся на

две группы.

К одной относятся бактерии, в клетках которых комплекс, образуемыйуказанными красителями, сохраняется после обработки их спиртом. Такие клетки в результате окраскиприобретают темно-фиолетовый цвет и получили название грамположительных

(грамм+).

Например, роды спорообразующих бактерий – Bacillus, Clostridium,
среди бесспоровых – роды Lactobacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Sarcina, Leuconostok и др.

К другой группе относятсявиды, которые не способны удерживать красящий комплекс и обесцвечиваются приобработке спиртом. Их называют грамотрицательными(грам-). К числу их принадлежат многие виды неспорообразующихпалочковидных бактерий, в т.ч. роды Pseudomonas,

Escherichia, Salmonella, Proteus и др.

Способность или неспособностьклеток удерживать красящий комплекс в настоящее время связывают с химическимсоставом и структурой клеточных стенокбактерий. В оболочках грам + бактерий содержится больше гликопептида муреина, полисахаридов и тейхоевые

кислоты.

Они имеют достаточно плотную многослойную структуру. В клеткахграм + бактерий генциан-виолет и йодобразуют прочное соединение с цитоплазмой, которое не извлекается

спиртом.

Они сохраняют фиолетовый цвет генциан виолета и при дополнительном окрашивании фуксином Пфейффера.

Оболочкиграм-бактерий однослойны, в них отмечено высокое содержание липидов в виделипопргеидов и липополисахаридов. Грам-бактерии при обработке спиртомобесцвечиваются, т.к. у них генциан-виолет не фиксируется в цитоплазме. Придополнительном окрашивании фуксином клетки бактерий окрашиваются только в

бледнорозовый цвет.

Грам + отличаются от грам –не только своим отношением к окраске, но и рядом биологических свойств иособенностей. Большинство грам + видов обладаютповышенной устойчивостью к обезвоживанию, термической обработке,радиоактивным и другим типам излучений. В тоже время грам -бактерии более устойчивы к действию щелочей ипротеолитических ферментов, а также

антибиотиков.

Окраску по Граму используютпри определении степени загрязнения пищевыхпродуктов посторонней, в т.ч. условно патогенной (кишечная группа) микрофлорой,

для выяснения диапазона действия антибиотиков и др. целей.

Следует учитывать,что некоторые виды бактерий будучи грам + в молодом возрасте, в старых культурах

не все интенсивно красятся по Граму.

Поэтому дляокраски следует брать односуточные или двухсуточные культуры и, кроме того,пользоваться для сравнения контрольными культурами (стандартами), отношение которых к окраске по Граму заранее

известно.

Источник:

Окраска по Граму | Андромед

Подробности 10579

Ганс Кристиан Йоахим Грам (дат. Hans Christian Joachim Gram ; 13 сентября 1853 — 14 ноября 1938) — датский бактериолог. Родился в семье Фредерика Теркеля Юлиуса Грама, профессора юриспруденции и Луизы Кристины Рулунд.

Грам изучал ботанику в Университете Копенгагена и был ассистентом ботаники у зоолога Япетуса Стенструпа. Работа с растениями позволила ему узнать основы фармакологии и научиться пользоваться микроскопом. Он поступил в медицинскую школу в 1878 году и закончил её в 1883.

Между 1878 и 1885 годами Грам путешествовал по Европе. В Берлине, в 1884, он разработал метод разделения двух основных классов бактерий. Эта техника, Метод окраски Грама, продолжает оставаться стандартной процедурой в медицинской микробиологии.

Окраска по Граму основана на различиях в строении клеточной стенки прокариот. Грамположительные бактерии имеют толстую, прочную, просто устроенную стенку (толщина более 50 нм)  Основным компонентом клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан (муреин), построенный их остатком N-ацетил мурамовой кислоты.

Прочность линейному полимеру придают поперечные тетрапептидные сшивки, соединяющие отдельные слои пептидогликана. С петидогликаном клеточной стенки грамположительных бактерий ковалентно связаны тейхоевые или  липотейхоевые кислоты (от греч.

teichos – стенка), молекулы которых представляют собой цепи из 8-50 остатков глицерола  и рибитола, соединенных фосфатными мостиками.  Молекулы тейхоевых кислот являются рецепторами адгезии (адгезинами), специфическими антигенами многих бактерий.  С пептидогликаном могут быть связаны белки (А, М, Т, R и др.

), которые располагаются снаружи также кластерами.  Эти белки являются антифагинами, репелентами фагоцитоза, рецепторами для антител. Смесь S.aureus и E.coli

Грамотрицательные бактерии содержат очень небольшое количество пептидогликана, не имеющего поперечных сшивок.

Над слоем муреина располагается периплазматическое пространство, играющее важную роль в обменных процесса (периплазматические ферменты) Далее располагается наружная мембрана, которая имеет строение, характерное для биологических мембран.

  Внешний листок наружной мембраны содержит липополисахарид (ЛПС), состоящий из трех компонентов: липида А, стержневой (базисной) части, или ядра,  и полисахаридной цепи, образованной повторяющимися олигосахаридными последовательностями. 

Основной краситель интенсивно связывается муреиновым слоем. Поскольку этот слой у грамотрицательных бактерий очень тонкий и экранируется внешней мембраной, эти микроорганизмы сорбируют значительно меньше красителя, чем грамположительные. 

Йод образует с красителем и муреином сложный комплекс, который труднее вымывается обесцвечивающими растворами. Дифференцирующие растворы вымывают весь краситель из клеточной стенки грамотрицательных бактерий, в то время, как грамположительные еще содержат достаточное количество красителя. 

Дополнительный краситель докрашивает обесцвеченные грамотрицательные бактерии в контрасный цвет.

  1. На фиксированный мазок положить кусочек фильтровальной бумаги и нанести с избытком основной краситель (1-2 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водой, нанести раствор Люголя. (1-2 мин)
  3. Слить раствор Люголя, препарат поместить в спирт (или налить спирт на препарат). (30-60 сек)
  4. Тщательно промыть дистиллированной водой.
  5. Докрасить одним из дополнительных красителей. (1-2 мин)
  6. Промыть и подсушить препарат
  1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек) 
  3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
  4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить 
  5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
  6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
  7. Промыть и подсушить препарат
  1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
  2. Окраска основным красителем. На мазок наливают раствор а и добавляют 2-3 капли раствора b. (2-3 мин) 
  3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
  4. Промыть водопроводной водой и осторожно удалить избыток воды фильтровальной бумагой (не сушить)
  5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
  6. Препарат высушить на воздухе.
  7. Докрасить дополнительным красителем. (5-10 сек)
  8. Промыть и подсушить препарат
  1. Мазок высушивают на воздухе без нагревания. Не фиксируют
  2. Окраска основным красителем. Растворы а и b смешивают в соотношении 15:4. Наносят на мазок (5 мин и более)  
  3. Смывают раствором Люголя. Наливают на мазок раствор Люголя (2 мин или более)
  4. Стряхнуть избыток раствора Люголя. Не промывать
  5. Обесцветить, добавляя по каплям смесь ацетона и эфира до прекращения отхождения красителя (обычно около 10 сек)
  6. Препарат высушить на воздухе.
  7. Докрасить дополнительным красителем. (1-2 мин)
  8. Промыть и подсушить препарат
  1. На фиксированный мазок наложить фильтровальную бумагу с основным красителем. Нанести сверху несколько капель воды (1 мин)
  2. Стряхнуть основной краситель. Налить на препарат раствор Люголя. (1 мин)  
  3. Стряхнуть раствор Люголя. Не промывать
  4. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая (или нанести спирт на мазок).
  5. Тщательно промыть дистиллированной водой.
  6. На препарат положить фильтровальную бумагу с дополнительным красителем. Нанести несколько капель воды.(1 мин)
  7. Промыть и подсушить препарат
  1. На фиксированный мазок нанести основной краситель (1 мин)
  2. Слить краситель, промыть препарат водопроводной водой (не более 2 сек)  
  3. Поместить препарат в раствор Люголя (1 мин)
  4. Промыть водопроводной водой и тщательно высушить
  5. Препарат поместить в спирт и обесцвечивать, слегка покачивая. Тщательно высушить
  6. Докрасить одним из дополнительных красителей (10 сек)
  7. Промыть и подсушить препарат

Грамположительные бактерии окрасились в красный цвет

ПричинаРешение
Мазок переобесцвечен (самая частая ошибка)
  1. Приготовить новый мазок и повторить окраску, уменьшив время обработки обесцвечивающим раствором
  2. Просмотреть много полей зрения в испорченном мазке.

    Иногда удается найти подходящие

  3. Если нет возможности приготовить новый мазок, полностью обесцветить имеющийся, тщательно промыть водой, высушить и повторить окраску
Старая культураОкраска по Граму учитывается для суточных культур (для медленно растущих бактерий – через двое-трое суток).

При длительном хранении на питательной среде наблюдается дегенарация муреинового слоя.

Используйте культуру подходящего возраста

Культура выращена в неблагоприятных условияхПри выращивании на селективных средах может образовываться слишком тонкий муреиновый слой Культивируйте микроорганизм на полноценной среде
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии)нет

Грамотрицательные бактерии окрасились в синий цвет

ПричинаРешение
Слишком густой мазок или наличие конгломератов (например, при аутоагглютинации)Краситель удерживается не клеточной стенкой, а за счет капиллярности пространств между клетками в скоплении

  1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальной “густотой” мазка
  2. Повторить приготовление препарата, взяв меньше культуры и приготовив мазок на большей площади
  3. При аутоагглютинации культуры взять для приготовления мазка дистиллированную воду
Мазок плохо обесцвечен
  1. Просмотреть много полей зрения, возможно в препарате есть поля зрения с нормальным обесцвечиванием
  2. Повторить приготовление препарата и его окраску
  3. Дообесцветить имеющийся мазок
  4. Проверить правильность приготовления обесцвечивающего раствора. При повторении ошибки – заменить раствор.
Особенности строения клеточной стенки (грамвариабельные бактерии) нет

Источник: https://dmnesterov.ru/sistematika/otlichitelnye-cherty-polozhitelno-i-otritsatelno-okrashennyh-bakterij-po-gramu.html

Medic-studio
Добавить комментарий