Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток.

Иммуногистохимическое исследование

Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток.

Иммуногистохимическое исследование в онкологии – это разновидность исследования ткани с помощью специальных реактивов по принципу антиген-антитело.

При иммуногистохимическом исследовании используются реактивы, которые содержат антитела, отмеченные специальными веществами.

Антитело – это белок, который связывается в тканях с определенными молекулами – антигенами, после чего возникает реакция. Если же таких молекул нет, то и реакции не будет.

По этому признаку можно судить, присутствует в ткани интересная нам молекула или нет. Это похоже на то, если нанести на белый стол бесцветный клей. Невооруженным глазом на белом фоне он практически незаметен, но стоит насыпать на стол мелкого песка, как клей становится виден за счет прилипших песчинок.

    

По правилам иммуногистохимическое исследование при раке всегда проводится в специализированной лаборатории. Для его проведения необходима опухолевая ткань, полученная в результате биопсии или операции.

Иммуногистохимическое исследование проводится для определения наличия в опухолевых клетках различных точек приложения, например, наличие рецепторов эстрогенов (ER) и прогестеронов (PR). Также иммуногистохимия выполняется для определения показателя Ki-67 (индекс пролиферативной активности опухолевых клеток), гиперэкспрессии белка Her2neu, VEGF (сосудистый фактор роста), р53.

Иммуногистохимическое исследование при раке выполняется для того, чтобы понять, какими препаратами можно лечить злокачественную опухоль, и к каким видам препаратов она чувствительна.

Самый распространённый анализ, определяемый при иммуногистохимическом исследовании, это наличие рецепторной чувствительности к гормонам у опухоли.

1. ER / PR (Эстрогеновые и прогестероновые рецепторы, ER- еstrogen receptor, PR-progesterone receptor)

ER и PR – протеиновые рецепторы на поверхности опухолевых клеток. 

В организме человека постоянно вырабатываются гормоны – эстроген и прогестерон. Эти гормоны воздействуют на ER и PR рецепторы, что приводит к стимуляции роста опухолевых клеток.

Определение Эстрогеновых и Прогетестероновых рецепторов является одним из важнейших моментов, определяющих чувствительность опухоли к терапии гормональными препаратами.

Чаще всего наличие рецепторов ER/PR определяют при раке молочной железы. Их наличие дает возможность, помимо стандартных методов лечения, применить гормональную терапию.

При гормон позитивном раке молочной железы, назначаются препараты: Тамосксифен, Экземестан (Аромазин), Летрозол (Фемара), Анастразол (Аримидекс), Гексэстрол (Синестрол) и другие.Также, считается, что гормонально-зависимый рак молочной железы отличается спокойным течением и редким метастазированием.

Чувствительность опухолевых клеток к гормональной терапии выражается в баллах от 0 до 10. Опухоль считается гормонозависимой, начиная с 2-х баллов. и требует добавления к лечению гормональной терапии.

2. Her2Neu (от англ. Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)

Her2Neu  – это рецептор эпидермального фактора роста раковой клетки. Это – ген, который воздействует на мембранные рецепторы клетки, и стимулирует её к усиленному делению.

В некоторых опухолях (чаще всего рак молочной железы, рак пищевода, рак желудка) присутствует гиперэкспрессия (повышенная активность) Her2Neu, что вызывает быстрое деление опухолевой клетки и её повышенную активность.

Также снижается эффективность химиотерапии, лучевой терапии, гормональной терапии. Из-за этого опухоли с Her2neu позитивным статусом отличаются агрессивным течением.

Существует две методики определения наличия у опухоли гена Her2neu:

1. Иммуногистохимическое исследование

Результаты иммуногистохимического исследования выражаются в баллах:

  • 0-1 означает, что опухоль без гиперэкспрессии Her2neu.
  • 3 означает, что опухоль с гиперэкспрессией Her2neu.

2. Метод FISH (Флуоресцентная гибридизация in situ)

В отличие от иммуногистохимического исследования, при котором определяются белки, при методе FISH определяется наличие генов, кодирующих протеины Her2neu. В зависимости от их наличия, определяется гиперэкспрессия Her2neu.

Определение гиперэкспрессии рецептора Her2neu в опухоли молочной железы является очень важным для дальнейшего назначения лечения.

В современной онкологии гиперэкспрессию Her2neu определяют, чтобы понять, необходимо ли добавление к лечению ингибиторов Her2neu.

Для лечения опухолей с гиперэкспрессией рецептора Her2Neu активно и успешно используются таргетные препараты Трастузумаб (Герцептин), Пертузумаб (Перьета), Трастузумаб-эмтанзин (Кадсила), Бейодайм (Трастузумаб+Пертузумаб).

 Эти препараты прицельно блокируют рецепторы Her2neu, тем самым останавливая активный рост опухолевых клеток и повышая их чувствительность к химиопрепаратам. Добавление таргетной терапии к стандартной химиотерапии при лечении Her2neu позитивных опухолей, серьезно увеличивает общую выживаемость и результат противоопухолевого лечения.

3. Ki-67

Ki-67 – это маркер пролиферативной активности опухолевой клетки. Данный параметр оценивается в процентах и показывает, сколько процентов опухолевых клеток активно делятся.

Если Ki-67 меньше 15%, опухоль считается слабоагрессивной, при показателе Ki-67 от 30 до 50% опухоль считается агрессивной, а при показателе Ki-67 выше 50% опухоль является высокоагрессивной.

Также Ki-67 является фактором прогноза течения опухолевого заболевания и ответа опухоли на химиотерапевтическое лечение. Определяется это простым способом: чем ниже показатель Ki-67, тем хуже опухоль реагирует на химиотерапевтическое лечение. И наоборот – чем выше показатель Ki-67, тем лучше опухоль будет отвечать на химиотерапию.

4. Белок p53

Белок p53 – это транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл. В быстро делящихся клетках обнаружено увеличение концентрации белка р53 по сравнению с клетками, делящимися медленно, что обусловлено высоким риском их онкогенности. 

Белок p53 предотвращает образование злокачественных опухолей в нашем организме. В норме, антионкоген р53 находится в неактивном состоянии, а при появлении повреждений ДНК в здоровой клетке – активируется. 

Функция белка р53 состоит в удалении тех клеток, которые являются потенциально онкогенными. Это называется – индуцированный апоптоз, уничтожение потенциально опасной клетки. 

При иммуногистохимическом исследовании, повышенное содержание  белка p53 обнаруживается в  50% злокачественных клеток, что позволяет им беспрепятственно делиться и избегать апоптоза (уничтожения).

Количество белка p53, определяют в дополнение к показателю Кi67, для того, чтобы понять насколько агрессивна опухоль и определить дальнейшее течение болезни.

 Если уровень белка p53 высокий, значит опухоль не агрессивная и не склонна к метастазированию и быстрому росту.

Если же, показатель белка p53 низкий, то значит опухоль агрессивна и склонна к быстрому росту в окружающие ткани и метастазированию.

5. VEGF (Фактор роста эндотелия сосудов)

VEGF  – это сигнальный белок, вырабатываемый клетками для активного роста новых сосудов в уже существующей сосудистой системе.

Есть несколько видов белка VEGF, и каждый воздействует на определенный рецептор VEGFR (Vascular endothelial growth factor receptor).

Для того чтобы активно делиться, опухоли нужно питание, а для этого нужны сосуды, по которым это питание будет поступать.

Именно по этой причине в опухолевых клетках содержится повышенное содержание белка VEGF – для того, чтобы в короткие сроки строить сосудистые сети.

Наличие белка VEGF в опухоли говорит о возможности применения таргетной терапиитакими препаратами, как Бевацизумаб (Авастин), Рамуцирумаб (Цирамза), Афлиберцепт (Залтрап). Они перестраивают сосудистую сеть опухоли, тем самым лишая её питания.

6. Определение экспрессии белков PD-1, PDL-1 и PDL-2

Иммунотерапия в онкологии появилась сравнительно недавно, но уже успела показать удивительные результаты в лечении опухолей.

Механизм иммунотерапии рака заключается в том, что препарат позволяет иммунитету увидеть опухоль и уничтожить её.

Ответственные за «видимость» опухоли белки PD-1, PDL-1 и PDL-2 в достаточном количестве присутствуют не во всех опухолях. Именно поэтому одним пациентам иммунотерапия помогает, а другим нет.

Чаще всего определение гиперэкспрессии белка PD-1 и его лиганд PDL-1 и PDL-2 необходимо примеланоме, немелкоклеточном раке легкого, раке желудка и раке почки.

Для того чтобы отобрать пациентов, которым показана иммунотерапия, проводится определение наличия экспрессии PD-1 и его лиганд PDL-1 и PDL-2, при помощи флюоресцентной гибридизации in situ  (FISH). При наличии экспрессии PD-1 и его лиганд PDL-1 и PDL-2, показано применение иммунотерапии препаратами Пембролизумаб (Кейтруда), Ниволумаб (Опдиво), Атезолизумаб (Тецентрик).

В современной онкологии иммуногистохимическое исследование играет очень важную роль, так как при помощи этого исследования онкологи определяют наличие тех или иных факторов в опухоли, которые позволяют грамотно и адекватно составить дальнейшее лечение пациента и говорить о прогнозах заболевания.

Источник: http://worldofoncology.com/materialy/o-rake/diagnostika/issledovaniya-biopsiynogo-materiala/immunogistokhimicheskoe-issledovanie/

Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика почечно-клеточного рака

Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток.

Введение. В последние десятилетия отмечается прогрессивное увеличение новых случаев возникновения злокачественных опухолей различных локализаций. Не является исключением и рак почки.

  В отличие от большинства зарубежных стран, где ежегодный прирост уровня заболеваемости почечно-клеточным раком (ПКР) составляет 2-3%, в России ежегодный прирост уровня заболеваемости ПКР составляет 6-10% [1,2,4,7,10,11,12,13]. Чаще ПКР растет медленно, имеет хорошо выраженную фиброзную капсулу, длительно не прорастает в окружающие почку ткани.

Но с течением времени могут появиться признаки инвазии в окружающие почку структуры, а также в сосуды, что можно расценить как проявление агрессии раковой опухолью и опасным в плане метастазирования [3,5,6,12].

Часто злокачественные опухоли почки обнаруживают случайно при профилактическом осмотре, так как ПКР длительное время не дает клинических проявлений.

При появлении жалоб у пациента с раковым заболеванием почки (боли в пояснице, повышение артериального давления, макрогематурия) уже обнаруживаются признаки инвазии опухоли в окружающие ткани и структуры почки или даже метастазирование [5,6,12].

Таким образом, актуальным остается задача раннего обнаружения и скорейшей точной диагностики опухолей в почках (локализации, степени дифференцировки и варианта ПКР).

Тактика ведения больных и прогноз выживаемости при злокачественных новообразованиях в почках зависят, прежде всего, от патологогистологического диагноза опухолевого процесса [5,6,8,9,12,14].

До сих пор гистологическое исследование при биопсии опухоли или удаленной опухоли почки является важнейшим в плане определения варианта ПКР, степени его дифференцировки и, соответственно, от окончательно поставленного патогистологического диагноза зависит дальнейшее лечение и прогноз для пациента.

  Важными прогностическими факторами при опухолях почек является степень ядерной атипии по Фурману, TNM стадия, клеточный вариант.

По рекомендациям ВОЗ 2004 года существуют определенные гистологические признаки G (грейда или степени дифференцировки) почечно-клеточного рака: форма и размер ядер опухолевых клеток, распределение хроматина, форма и размер ядрышек, наличие митозов [7,12].

Чем выше дифференцировка опухоли (G1), тем более мелкие и однотипные ядра имеет опухоль (не более 10 мкм), хроматин и ядрышки не просматриваются. Со снижением дифференцировки  (G3-G4), ядра становятся крупными, полиморфными, хроматин и ядрышки хорошо различимы [12]. Однако постановка диагноза рака почки и его дифференцировка по клеточной атипии бывает затруднена, особенно, если имеет место не классический светлоклеточный вариант, другие более редкие варианты (хромофобный, папиллярный, веретеноклеточный, мультилокуляный кистозный и другие). В таких случаях на помощь патологоанатому приходит иммуногистохимическое исследование.

Значимость иммуногистохимии опухолей трудно переоценить.

В последние годы иммуногистохимическое исследование является обязательным для постановки окончательного патологогистологического диагноза в некоторых случаях, помогает максимально точно определить гистогенез опухоли, а также позволяет уточнить степень ее дифференцировки  [4].

При изучении литературных источников мы не обнаружили данных, где в одном исследовании присутствовали бы результаты иммуногистохимического исследования наиболее распространенных вариантов  ПКР с использованием большого количества антител (цитокератины, AMACR, Ki67, P53, PCNA, E-cadherin, VEGF, EGFR).

Цельисследования: выявление морфологических особенностей и определение наиболее важных иммуногистохимических маркеров нескольких вариантов ПКР для более точной и быстрой диагностики новообразований почек, что в дальнейшем позволит сформулировать прогноз для пациентов с  опухолями в почках.

Материал и методы. Материалом для исследования явился послеоперационный материал 459 больных со злокачественными новообразованиями в почках эпителиального генеза (ПКР). Пациенты были прооперированы в клинической больнице им. Р.В. Миротворцева ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России в период с 2006 по 2011 год.

Нами были проанализированы морфологические данные (локализация процесса, макрокартина, гистокартина) и дополнительно проведено  иммуногистохимическое исследование  цитокератинового профиля  (СК 7, 8, 18), AMACR, Ki67, P53, PCNA, E-cadherin, VEGF, EGFR светлоклеточного, папиллярного, мультилокулярного кистозного, веретеоклеточного и хромофобного вариантов ПКР. Уровень экспрессии антител определялся путём суммарной оценки интенсивности окрашивания опухолевых клеток и числа позитивно окрашенных клеток. Случай расценивался как позитивный, если имело место любое по интенсивности окрашивание более 10 % опухолевых клеток. При окрашивании менее 10 % опухолевых клеток результат расценивался как нулевой. Слабая реакция более чем у 10 % опухолевых клеток со слабым окрашиванием оценивалась как «1+», при умеренном окрашивании более чем у 10 % опухолевых клеток – «2+», выраженное интенсивное окрашивание более чем 10% опухолевых клеток – «3+». В качестве группы сравнения выраженность экспрессии антител определялась в папиллярной аденоме (доброкачественная опухоль).

Результаты и обсуждение. По данным литературных источников, средний возраст, при котором обнаруживается ПКР, составляет 62 года [3,5,6,12]. Однако в нашем исследовании мы отметили, что средний возраст  обнаружения рака почек 57 лет [8,9].

Некоторые случаи ПКР регистрировались в молодом и даже подростковом возрасте [14]. Кроме того, нами было отмечено, что у молодых пациентов с ПКР обнаруживаются редкие варианты опухолей почки (хромофобный, папиллярный, веретеноклеточный, мультилокулярный поликистозный).

Также нами было отмечено, что редкие формы ПКР чаще встречаются у женщин [14], а у мужчин преобладал типичный светлоклеточный вариант.

Как известно из литературных источников [3,5,6,12],  в последнее время все чаще стали выявляться злокачественные опухоли почек с признаками агрессии. Нами были отмечены признаки агрессии опухолей почек в 69,7% случаев (из 459 новообразований признаки инвазии имели 320).

Естественно, что прогноз злокачественных опухолей любой локализации, в том числе и в почках, зависит от наличия или отсутствия метастазов, от стадии процесса и гистологического варианта заболевания, которые возможно дифференцировать только с помощью морфологического исследования [3,5,6,7,11,12].

Иногда опухоль имеет такое необычное строение или низкую дифференцировку, что постановка гистологического диагноза возможна только при использовании иммуногистохимического исследования [4]. Чтобы выявить эпителиальное происхождение опухоли (ПКР), мы использовали группу цитокератинов (СК, 7,8,18). Было обнаружено, что почти при всех вариантах ПКР СК18, дает более интенсивную реакцию (рис.

1, рис.2), чем СК 7 и 8, кроме мультилокулярного кистозного варианта (табл.1). Доброкачественная опухоль почки (папиллярная аденома) показала одинаковую резко положительную реакцию на цитокератины СК7,8,18 (табл.1).

Каждый гистологический вариант ПКР показывал своеобразную комбинацию и интенсивность окрашивания как с цитокератинами, так и другими антителами (табл.1).

Кроме цитокератинов, эпителиальный характер ПКР позволяют подтвердить следующие антитела: рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) и AMACR.

AMACR – специфический маркер для выявления рака предстательной железы, но он дает реакцию и на злокачественные эпителиальные опухоли других локализаций [4].

Дифференцировку (G – грейд) опухоли помогают установить антитела пролиферации и апоптоза. Р53, Ki-67, PCNA – маркеры пролиферации.

Чем сильнее реакция маркеров пролиферации, тем более агрессивно ведет себя опухоль и соответственно имеет более низкую дифференцировку. Напротив,  чем слабее реакция маркеров апоптоза ВАХ и Bcl-2, тем менее благоприятно для прогноза (рис.3).

Маркер VEGF показывает васкуляризацию опухоли, чем сильнее реакция VEGF, тем лучше васкуляризирована опухоль и тем быстрее и агрессивнее она растет (рис.4).

Было отмечено, что папиллярный, хромофобный и муцинозный веретеноклеточный варианты ПКР имеют более агрессивное течение, чаще прорастают лоханку и капсулу почки, дают метастазы.

Напротив, мультилокулярный кистозный вариант ПКР имеет более благоприятное течение и прогноз, никогда не метастазирует (рис.5, рис.6).

Таким образом, для каждого варианта опухоли, также как и для степени дифференцировки (G) опухоли, имеется своеобразная комбинация реагирования и интенсивность окрашивания антител.

После проведения иммуногистохимических реакций в нашем исследовании была произведена коррекция диагноза для некоторых опухолей. Например, после проведения обычного гистологического исследования с помощью красителя гематоксилина/эозина в группе мультилокулярного поликистозного варианта ПКР насчитывалось 13 случаев.

Как уже было сказано выше, этот вариант рака почки считается наиболее благоприятным – он чаще имеет высокий G грейд и никогда не дает метастазов [9].

В нашем исследовании в одном из 13 случаев мультилокулярного кистозного варианта после проведения иммуногистохимического исследования мы отметили такую же реакцию антител, как при светлоклеточном варианте. После дополнительного обследования у пациента обнаружены метастазы рака почки в лимфоузлы.

Таким образом, вместо первоначально поставленного диагноза мультилокулярного поликистозного варианта ПКР был выставлен диагноз светлоклеточного ПКР с кистозной трансформацией, пациенту проведена коррекция лечения [9].

Заключение.

Таким образом, в связи с увеличением частоты развития  опухолей, их поздней диагностикой, агрессивности течения и неблагоприятного прогноза, морфологический метод исследования при опухолях почек является своевременным, необходимым и самым точным диагностическим методом. Также целесообразно использование дополнительно иммуногистохимического исследования при низкодифференцированных опухолях почки и может являться обязательным методом, последовательно выполняемым после стандартного гистологического исследования. Иммуногистохимический метод с помощью ряда антител позволяет провести дифференциальную диагностику различных вариантов  ПКР, в некоторых случаях позволяет уточнить G (грейд) опухоли, а это позволяет быстро назначить правильное лечение и спрогнозировать течение заболевания.

Источник: https://medconfer.com/node/13105

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.02) на тему:Иммуногистохимическая характеристика карциноидов легочной локализации

Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток.

На правах рукописи

Сайнога Татьяна Владимировна

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАРЦИНОИДОВ ЛЁГОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ

14.03.02 – Патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

12 СЕН 2013

Волгоград — 2013

005532802

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Славинский Александр Александрович Официальные оппоненты:

Туманова Елена Леонидовна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой патологической анатомии и клинической патологической анатомии №2 педиатрического факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России

Даниленко Виталий Иванович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической анатомии ГБОУ ВПО «Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко» Минздрава России

Ведущая организация: государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В:И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Диссертационного совета Д 208.008.01 государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших Борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан « 2013 года

Защита состоится

года в /¿7 часов на заседании

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Н.В.Григорьева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Карциноид входит в группу нейроэндокринных опухолей (НЭО) лёгких, которые в зависимости от их морфологических и молекулярно-биологических характеристик делятся на 4 группы: мелкоклеточный рак, крупноклеточный рак, атипичный (АК) и типичный карциноиды (ТК).

Решающую роль в определении тактики лечения пациентов с НЭО играет адекватная морфологическая интерпретация опухоли, позволяющая дифференцировать карциноид и нейроэндокринный рак, определить степень дифференцировки и злокачественности опухолевых клеток, их принадлежность к нейроэндокринному типу.

Общепринятые на сегодняшний день дифференциально-диагностические критерии для этой группы опухолей разработаны для больших образцов тканей (операционный материал) и базируются исключительно на гистологических признаках (Travis W.D. et al., 2004).

На практике первичная морфологическая диагностика нейроэндокринных опухолей лёгких выполняется на мелких фрагментах ткани, полученных при бронхобиопсии, и в таких случаях не всегда возможно правильно оценить признаки, выявляемые на более крупных образцах (Rekhtman N. et al., 2010; Demirci I. et al., 2012).

Разделение карциноидных опухолей на типичный и атипичный карциноид, по мнению некоторых исследователей, не всегда может характеризовать истинный злокачественный потенциал новообразования (Чекини А.К. с соавт., 2012; Noovic D. et.al. 2013).

Так, типичный карциноид – более благоприятная по своему течению опухоль, чем атипичный карциноид, может метастазировать в региональные лимфоузлы и иметь отдаленные метастазы в кости, печень, головной мозг, что ухудшает прогноз заболевания и повышает уровень летальности (Wang Y.H. et.al.

, 2012; Zhong С.Х. et.al., 2012). Для того, чтобы оценить агрессивность опухоли и судить о её прогнозе, недостаточно рутинного гистологического исследования.

Особое значение имеет изучение экспрессии ряда клеточных маркеров, участвующих в механизмах канцерогенеза, таких как протеины, связанные с апоптозом, межклеточной адгезией и пролиферацией

(Павленко И.А. с соавт., 2012; Eichelberg С. et.al., 2012). Для лечения типичных карциноидов в практику внедряются органосохраняющие методы, такие как бронхоскопическая резекция, требующие более тщательного отбора пациентов (Пикин О.В. с соавт.

, 2011; Neyman К. et.al., 2012). С этих позиций исследование иммунофенотипа клеток карциноидных опухолей лёгкого имеет большое практическое значение, оно позволяет правильно поставить диагноз и более объективно судить о прогнозе заболевания.

Проведенное нами комплексное иммуногистохимическое исследование карциноидов и определение иммунофенотипа опухолевых клеток на разных клинических стадиях процесса направлено на совершенствование морфологической диагностики нейроэндокринных опухолей лёгкого, а также на уточнение прогноза заболевания, что может быть использовано при разработке оптимальной тактики лечения.

Цель исследования

Охарактеризовать иммунофенотип клеток карциноидных опухолей лёгких и на этой основе разработать новые критерии дифференциальной диагностики и прогноза заболевания.

Задачи исследования

1.

Определить характер экспрессии эпителиальных маркеров (цитокератин АЕ1/3, цитокератин 18, эпителиальный мембранный антиген, эпителиальный антиген Вег-Ер4) и выделить наиболее информативные иммуногистохимические критерии эпителиальной дифференцировки карциноидов лёгкого.

2.Определить значимость нейроэндокринных маркеров (хромогранин А, синаптофизин, CD56, CD57 и нейрон-специфическая энолаза) для дифференциальной диагностики карциноидов лёгкого и эпителиальных опухолей неэндокринного генеза.

3.Определить особенности иммуноэкспрессии органоспецифических маркеров лёгочного эпителия (TTF-1 и цитокератин 7) в карциновдах лёгких и установить их роль в дифференциальной диагностике первичных и метастатических карциноидных опухолей.

4.Выявить взаимосвязь классических неблагоприятных прогностических факторов (размеры первичного очага, поражение лимфатических узлов) с иммунофенотипом опухоли.

5.Разработать критерии для дифференциальной диагностики нейроэндокринных опухолей различной степени злокачественности на основе их иммуногистохимического анализа.

Научная новизна исследования Получены новые данные об экспрессии карциноидами лёгких эпителиальных, нейроэндокринных и органоспецифических маркеров, необходимые для достоверной диагностики этих опухолей.

Определены новые иммунофенотипические признаки опухолевых клеток, связанные с большим размером опухоли и наличием метастазов в регионарных лимфатических узлах, что позволяет выделить группу больных с высокой степенью риска прогрессирования заболевания.

Впервые проведено сравнительное исследование экспрессии метаболического фермента АМАСЯ в карциноидах лёгкого на разных стадиях опухолевого процесса. Обнаружено, что экспрессия этого маркера достоверно повышена в метастазирующих карциноидах и может быть использована как признак неблагоприятного прогноза.

Предложены новые иммуногистохимические критерии дифференциальной диагностики нейроэндокринных опухолей различной степени злокачественности.

Научно-практическая значимость работы Результаты работы могут быть использованы для дифференциальной диагностики и уточнения оценки инвазивного потенциала и прогноза течения карциноидов лёгких в практической деятельности патологоанатомических отделений, в работе отделений онкологии, для разработки новых способов лечения контингента больных с карциноидными опухолями лёгочной локализации, а также для научно-исследовательских разработок и в учебном процессе.

Основные положения, выносимые на защиту

1.

Карциноидные опухоли лёгких характеризуются выраженной экспрессией нейроэндокринных (главньм образом хромогранин А, синаптофизин) и эпителиальных маркеров (цитокератин АЕ1\3, цитокератин 18, эпителиальный мембранный антиген Вег-Ер4), а также низкой иммунореактивностью с органоспецифическими молекулами легочной ткани (ТТР-1, цитокератин 7). Характер экспрессии диагностических маркеров зависит от степени злокачественности опухоли.

2. Дифференциально-диагностические критерии, отличающие карциноидные опухоли от нейроэндокринных карцином – это выраженная экспрессия нейроэндокринных и эпителиальных маркеров, индекс пролиферации менее 20%, слабая экспрессия мутантного проапоптотического белка р53, ингибитора апоптоза Вс1-2, рецептора фактора роста С0117, маркера альвеолярного эпителия

там.

3. Способность карциноидных опухолей лёгких к росту и метастазированию определяется повышенной пролиферативной активностью клеток в сочетании со смещением экспрессии регуляторных белков в сторону ингибитора апоптоза, а также снижением экспрессии молекул межклеточной адгезии и гиперэкспрессией метаболического фермента альфа-метилацил-коэнзим А рацемазы.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации изложены на международной научной конференции «Актуальные проблемы науки и образования» (Куба, Гавана 2010), 10-й научно-практической конференции молодых ученых и студентов юга России (Краснодар, 2011), международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в медицине» (Сочи, 2011), международной научной конференции «Приоритетные направления развития науки, технологий и техники» (Египет, 2011), международной научной конференции «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболеваний человека» (Турция, 2011), международной научной конференции «Практикующий врач» (Италия,

2011), международной научной конференции «Фундаментальные исследования» (Хорватия 2012).

По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 165 страницах печатного текста, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, 2 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Иллюстративный материал представлен 49 таблицами, 19 рисунками. Список литературы включает 325 источников, в том числе – 33 отечественных и 292 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на биопсийном и операционном материале патологоанатомического отделения Краевой клинической больницы №1 им. проф. С.В. Очаповского г. Краснодара, полученном от 214 больных, находившихся на лечении в Центре грудной хирургии с 2007 по 2011 гг. Исследованный материал был разделен на 2 группы:

1 группа (основная) – операционный материал, полученный от 104 больных карциноидными опухолями лёгкого. Пациентам выполнены резекция сегмента, доли или всего легкого с лимфодиссекцией. Диагноз был морфологически верифицирован, опухоли поделены на типичный и атипичный карциноиды согласно рекомендациям ВОЗ (73 типичных карциноида и 31 атипичный). Все случаи стадированы по классификации ПЧМ.

В зависимости от признаков прогрессирования заболевания (наличие метастазов, большой размер опухоли) данная группа больных разделена на подгруппы (табл.1).

Следует отметить, что у пациентов участвующих в нашем исследовании, на стадии Т2 (опухоль более 3 см) отсутствовали такие дополнительные признаки, как прорастание висцеральной плевры и пневмония/ателектаз с вовлечением корня лёгкого, а

вовлечение главного бронха наблюдалось в 11% случаев. Таким образом, основными критериями неблагоприятного течения заболевания являлись размер опухоли (более 3 см) и наличие метастазов в лимфатических узлах. Какой либо зависимости между размером опухоли и наличием метастазов не было выявлено.

Таблица 1

Распределение больных с карциноидами лёгкого по группам в зависимости от

размера опухоли и наличия метастазов

Статус опухоли Количество пациентов, п

ТК АК всего

Т-статус Т1 54 13 67

Т2 19 18 37

Ы-статус N0 67 21 88

N1-2 6 10 16

2 группа (группа сравнения) – биопсийный и операционный материал, полученный от 60 больных с морфологически верифицированным нейроэндокринным раком лёгкого (45 случаев мелкоклеточного рака и 15 случаев крупноклеточного рака).

3 группа (контрольная) – операционный материал, полученный от 50 больных с морфологически верифицированным неэндокринным раком лёгкого (плоскоклеточный рак – 30 пациентов, аденокарцинома лёгкого – 20 пациентов).

Морфологическое исследование фрагментов ткани опухоли, фиксированных 10% забуференным формалином, включало в себя микроскопическое исследование серийных срезов окрашенных рутинным способом (гематоксилин-эозин) и с применением иммуногистохимического (ИГХ) метода. Для гистологического исследования материала использовали традиционный метод парафиновой заливки. Проводка материала осуществлялась в тканевом процессоре карусельного типа М1сгот 8ТР120.

Иммуногистохимическое исследование осуществляли на срезах с парафиновых блоков иммунопероксидазным методом по стандартной методике

(Buchwalow I. В. et al., 2010). Серийные срезы толщиной 3-4 мкм наносили на стекла с адгезивным покрытием (поли-Ь-лизин). Предварительную температурную демаскировку антигенов производили согласно инструкциям к антителам с помощью автоклава Pascal фирмы «DAKO». Процесс иммуногистохимического окрашивания производили в автостейнере Autostainer Plus фирмы «DAKO».

Использовали следующий набор маркеров: Ki-67 (клон MIB-1), Вс1-2, Вах, р53, Cytokeratin АЕ1/АЕЗ, Cytokeratin 7, Cytokeratin 18, Epithelial Antigen Ber-Ep4, EMA, Thyroid Transcription Factor, c-kit CD 117, S-100, CD68, Synaptophysin, Chromogranin A, CD56, CD57, NSE, E-Cadherin, CD44, AMACR (производство фирмы «DAKO»).

В качестве вторичных антител применяли смесь биотинилированных антикроличьих и антимышиных иммуноглобулинов (EnVision™ FLEX System фирмы «DAKO»), для визуализации места связывания антигена с антителом использовали метку — фермент пероксидазу хрена в присутствии субстрата — пероксида водорода и колориметрического реактива 3,3-диаминобензидина (набор DAB+, «DAKO»),

Для оценки характера экспрессии ИГХ-маркеров разработана специальная шкала оценки, учитывающая как количество позитивных клеток, так и интенсивность окрашивания.

При выявлении SlOO-позитивных поддерживающих клеток учитывали площадь покрытия ткани опухоли сетью поддерживающих клеток.

Индекс пролиферации Ki67 вычисляли как среднее от числа окрашенных ядер на 100 учтенных ядер (при учете 10 полей зрения при увеличении х400 для операционного материала).

Чувствительность и специфичность маркеров нейроэндокринной дифференцировки рассчитывали как соотношение числа опухолей с положительной экспрессией маркера к количеству всех исследованных образцов (положительной расценивали экспрессию на 3-5 баллов). При сравнительной оценке экспрессии регуляторов апоптоза использован коэффициент апоптоза (КА), представляющий собой соотношение Bcl-2-позитивных клеток к Вах-позитивным клеткам.

Для оценки межгрупповых различий значений признаков применяли ранговый и-критерий Вилкоксона—Манна—Уитни. Анализ зависимости между признаками проводили с помощью критериев \ и Фишера. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых межгрупповых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологическая характеристика карциноидов лёгкого. Средний возраст больных с карциноидными опухолями лёгких составил 51,8 года, причем средний возраст мужчин был несколько ниже, чем женщин (46 лет и 54,4 года соответственно). Соотношение мужчин и женщин – 1:2.

Установлено, что для типичных карциноидов с центральной локализацией характерен преимущественно полипообразный эндобронхиальный рост опухоли (76%), а для атипичных карциноидов — смешанный рост, при котором опухоль частично погружалась в ткань лёгкого за пределы стенки бронха (64%).

Средний размер опухолевого узла при типичном карциноиде – 2,66см, при атипичном- 3,55см. В типичных карциноидах митозы отсутствовали в 97% случаев, среднее количество митозов составило 0,16 на 2 мм2.

В атипичных карциноидах средняя митотическая активность составила 1,76 на 2мм2, некрозы выявлены в 53% случаев.

Диагностическая эндоскопическая бронхобиопсия была выполнена у 79% больных с карциноидными опухолями. В большинстве случаев (80,5%) установлен диагноз карциноида без уточнения степени дифференцировки.

В 8% случаев ошибочно диагностирован нейроэндокринный рак, в 2,5% – рак неэндокринной природы, в 4% – другая неэпителиальная опухоль. В 5% выставлен диагноз нейроэндокринной опухоли неопределенной степени злокачественности.

Таким образом, при морфологической диагностике наибольшую трудность представляет определение степени злокачественности как карциноидов, так и НЭО в целом.

Экспрессия маркеров нейроэндокринной дифференцировки Экспрессию нейроэндокринных маркеров в карциноидах лёгких определяли с

использованием нескольких антител: синаптофизина, хромогранина А, нейрон-специфической энолазы (НСЭ), CD56 (NCAM) и CD57(Leu-7).

Самыми чувствительными маркерами нейроэндокринной дифференцировки применительно к карциноидам лёгкого оказались хромогранин А и синаптофизин, частота экспрессии НСЭ, CD56 и CD57 была несколько ниже.

Отмечено резкое снижение чувствительности хромогранина и CD57 в нейроэндокринных карциномах, тогда как разница в характере экспрессии синаптофизина и НСЭ не столь значительна, а маркер CD56 имеет тенденцию к повышению иммунореактивности в более злокачественных НЭО (рис.1).

Хромогранин CD?7 Сннаптофшнн НСЭ CD 56

А

Рис. 1 .Чувствительность нейроэндокринных маркеров в НЭО различной степени

злокачественности, (%).

Установлено, что все изученные маркеры, кроме НСЭ, обладают достаточной специфичностью.

В неэндокринных легочных карциномах интенсивная положительная реакция в большом количестве клеток опухоли наблюдалась только при использовании этого маркера.

Специфичность НСЭ составила 66%, тогда как хромогранина 100%, синаптофизина 94%, CD56 и CD57 – 92%. При сравнении экспрессии нейромаркеров на различных клинических стадиях статистически значимых различий не выявлено.

Экспрессия нейроэктодермального маркера S100. Выраженная «параганглиоидная» сеть из SlOO-позитивных поддерживающих клеток выявлена только в типичных карциноидах, причем далеко не во всех опухолях (16% – 12 из 73). В большинстве случаев карциноиды демонстрировали лишь отдельные поддерживающие клетки (56% ТК и 29% АК), либо полное их отсутствие. Кроме

того, экспрессия SI00 определялась и в основных клетках опухоли: в 35% (26 из 73) типичных карциноидов и в 26% (8 из 31) атипичных выявлена положительная реакция с этим маркеров в большинстве или части опухолевых клеток.

Зависимости между экспрессией S100 в различных опухолевых структурах и клинической стадией не установлено.

В нейроэндокринном раке SlOO-позитивных поддерживающих клеток не выявлено, однако непосредственно в клетках опухоли экспрессия отмечалась в небольшом количестве случаев.

Присутствие поддерживающих клеток более характерно для типичных карциноидов лёгкого, нежели для атипичных. Также следует отметить, что экспрессия S100 может присутствовать не только в поддерживающих, но и в основных клетках карциноидных опухолей.

Экспрессия эпителиальных маркеров. Оценку экспрессии эпителиальных маркеров в карциноидах лёгких производили с использованием первичных антител к панцитокератину (пан ЦК), клон АЕ1\АЕЗ, цитокератину (ЦК) 18, эпителиальному мембранному антигену ЕМА, эпителиальному антигену Вег-Ер4.

Цитокератин АЕ1/3, цитокератин 18 и эпителиальный антиген Вег-Ер4 в отличие от ЕМА демонстрируют высокий уровень экспрессии в карциноидных опухолях. Выраженная экспрессия цитокератина АЕ1/3 выявлена в 78% карциноидов, цитокератина 18 – в 97%, Вег-Ер4 – в 76%.

Следует отметить, что высокозлокачественные НЭО характеризуются снижением экспрессии панцитокератина, лишь 53% опухолей интенсивно экспрессируют этот маркер. Кроме того, выявлены различия в локализации экспрессии цитокератинов в карциноидах и нейроэндокринных карциномах.

Нейроэндокринные опухоли часто демонстрируют перинуклеарную экспрессию ЦК в виде крупных гранул, что позволяет заподозрить их природу (Rodney Т. et al., 2004). По нашим данным, такая иммунореактивность часто встречается в нейроэндокринном раке, однако в карциноидах этот эффект выявлен в небольшом количестве случаев (рис.2).

Какой-либо зависимости характера экспрессии эпителиальных маркеров от стадии процесса в карциноидных опухолях не установлено.

100% 90% 80% 70% 60% 50° о -40% 30% 20% 10° о 0%

—Ц Цк' 18

■*–ПГ ЦК 18

*— Ц панЦк

•♦•■ ПГ панЦк

Тк

Ак

карциномы

Примечание: ПГ-перинуклеарные гранулы, Ц-цитоплазматическая экспрессия.

Рис. 2. Зависимость характера экспрессии цитокератинов от степени злокачественности НЭО.

Небольшое количество (8%) всех карциноидов не экспрессировало АЕ1\3. В таких случаях для дифференциальной диагностики необходимо использовать дополнительные маркеры. Наиболее пригодными для этих целей являются цитокератин 18 и эпителиальный антиген Вег-Ер4.

Экспрессия органоспецифических маркеров. Для выявления первичного очага при метастазировании используются различные органоспецифические молекулы. Для лёгкого такими маркерами можно считать цитокератин 7 (ЦК 7) и тиреоидный фактор транскрипции (ТПМ).

Цитокератин 7. Экспрессия цитокератина 7 большинством клеток опухоли выявлена в 24,6 % (18 из 73) случаев типичного карциноида, 29% (9 из 31) атипичного карциноида.

В 27% (20 из 73) ТК и 26% (8 из 31) АК выявлены отдельные позитивные клетки, а в 20,5% (15 из 73) и 16% (5 из 31) соответственно экспрессия ЦК 7 отсутствовала.

В высокозлокачественных НЭО процент положительной экспрессии ЦК 7 также достаточно низок: в 21,6% наблюдалась реакция с большинством клеток, в 31,6% – с частью, в 15% – единичные позитивные клетки.

Тиреоидный фактор транскрипции (ТТР-1). Ядерная экспрессия ТТР-1 наблюдалась в 4 случаях (13%) атипичного карциноида, а при типичном карциноиде положительная реакция не выявлена ни в одной из исследованных

опухолей. Среди нейроэндокринных карцином лёгкого 63% опухолей демонстрировали интенсивную экспрессию ТП7-1 большинством клеток опухоли.

Таким образом, экспрессия ТТТЧ в большей степени характерна для низкодифференцированных нейроэндокринных опухолей лёгкого, нежели для карциноидов (р

Источник: http://medical-diss.com/medicina/immunogistohimicheskaya-harakteristika-kartsinoidov-legochnoy-lokalizatsii

Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия

Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток.

Бабиченко И.И., Ковязин В.А.
Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста: Учеб. пособие. – М.: РУДН, 2008. – 109 с.

Экспертное заключение – доктор медицинских наук, профессор кафедры патологической анатомии лечебного факультета РГМУ М.В. Самойлов

Учебное пособие выполнено в рамках инновационной образовательной программы Российского университета дружбы народов, направление “Комплекс экспортоориентированных инновационных образовательных программ по приоритетным направлениям науки и технологий”

ОСНОВЫ ИММУНОХИМИИ Тема № 1. Введение. История развития метода. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции Тема № 3. Оценка результатов иммуногистохимической реакции. Положительные и негативные контроли. Возможные проблемы при проведении реакции

ПРИКЛАДНЫЕ ВОПРОСЫ ИММУНОГИСТОХИМИИ Тема № 4. Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей Тема № 5. Рецепторные белки в неизмененных и опухолевых клетках Тема № 6. Белки – маркеры клеточного цикла Тема № 7. Факторы апоптоза и пролиферации

Тема № 8. Белковые молекулы, характеризующие клеточную адгезию Тема № 9. Иммуногистохимия ангиогенеза

ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия Тема № 11. Выявление гистогенетической принадлежности опухолей мезенхимального происхождения Тема № 12. Дифференциальная диагностика лимфом

ЛИТЕРАТУРА [показать]

  1. Бабиченко И.И., Костанян И.А., Липкин В.М. HLDF – новый маркер анапластических процессов в предстательной железе человека // В кн.: Рак предстательной железы. / Под ред. Н.Е. Кушлинского, Ю.Н. Соловьева, М.Д. Трапезниковой. – М: Изд. РАМН, 2002. – С. 289-305.
  2. Георгиев Г.П.

    Молекулярно-генетические механизмы прогрессии опухолей // Соросовский образовательный журнал. – 2000. –Т. 6, № 11. –C. 1-7.

  3. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. – Изд. КМК, 2003. – 160 с.
  4. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. Российский онкологический сервер. (www.rosoncoweb.ru/library/01/02.htm).

  5. Костанян И.А., Осипова М.В., Старовойтова Е.В., Драницына С.М. Выделение и изучение механизма действия пептидно-белковых факторов дифференцировки, вырабатываемых активированными клетками HL-60 // Цитология. – 1994. – Т. 36, № 6. – С. 525.
  6. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз). – М.: Медицина, 2001. – 192 с.
  7. Лысенко О.Н., Ашхаб М.Х.

    , Стрижова Н.В., Бабиченко И.И. Иммуногистохимические исследования экспрессии рецепторов к стероидным гормонам при гиперпластических процессах в эндометрии // Архив патологии. – 2004. – Т. 66, № 2. – С. 7-10.

  8. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом, морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5.

    – C. 169-175.

  9. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия // Акушерство и гинекология. – 2000 . – №3. – С. 5-8.
  10. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. – М.: Мир, 1987. – С. 9-22.
  11. Райхлин Н.Т., Петров С.В., Чаиркин И.Н. История иммуногистохимии // В кн.

    Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. / Под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. – Казань, 2000. – С. 12-14.

  12. Самуилов В.Д. Биохимия программируемой клеточной смерти (апоптоза) у животных // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – Т. 7, № 10. – С. 18-25.
  13. Семиглазов В.Ф., Нургазиев К.Ш., Арзуманов А.С.

    Опухоли молочной железы (лечение и профилактика). – Алматы, 2001. –345 с.

  14. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. – Волгоград: Семь ветров, 1999. – 538 с.
  15. Угрюмов М.В. Современные методы иммуноцитохимии и гистохимии. “Итоги науки и техники” ВИНИТИ, серия “Морфология”. – 1991. – вып. 15. – 115 с.
  16. Франк Г.А.

    Проблемы морфологической классификации и диагностики опухолей мягких тканей // Практическая онкология. – 2004. – Т. 5. – C. 231-236.

  17. Фролова И.И., Бабиченко И.И., Местергази Г.М. Цервикальные интраэпителиальные неоплазии и дискератозы шейки матки. – М.: Издательский дом “Династия”, 2004. – 88 с.
  18. Хансон К.П., Имянитов Е.Н.

    Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом // Практическая онкология. – 2004. –Т. 5. – C. 163-169.

  19. Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells // J. Exp. Med. – 1950. – V.91. – P. 1-13.
  20. Coons A.H., Creech H.J., Jones R.N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. – 1941. – V. 47. – P.

    200-202.

  21. Coons A.H., Leduc E.H., Connolly J.M. Studies on antibody production. I. A method for the histochemical demonstration of specific antibody and its application to a study of the hyperimmune rabbit // J. Exp. Med. – 1955. – V. 102. – P. 49-60.
  22. Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry. 2-nd ed. – Elsevier, 2006. – 828 p.
  23. De Miguel M.P., Royuela M.

    , Bethencourt F.R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistohemical comparative analysis of transforming grows factor alpha, epidermal growth factor and epidermal grows factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. – 1999. – V.11, N9. – P. 722-727.

  24. Graham R.C., Karnovsky M.J.

    The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney: ultrastructural cytochemistry by a new technique // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 291-302.

  25. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V.27. – P.

    1131-1139.

  26. Guesdon J.L., Ternynck T., Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques // J. Histochem. Cytochem. – 1979. – V. 27. – P. 1131-1139.
  27. Harris N.L., Stein H., Coupland S.E. et al. New approaches to lymphoma diagnosis // Hematology 2001. – V.1. –P. 194-220.
  28. Kerr J.F.R., Wyllie F.N., Currie A.R.

    Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. – 1972. – V. 26, № 2. – P. 239-257.

  29. Mar K.C. et al. Cell proliferation marker MCM2, but not Ki 67, is helpful for distinguishing between minimally invasive follicular carcinoma and follicular adenoma of the thyroid // Histopathology. – 2006. – V. 48, N 7. – P.

    801-807.

  30. Marrack J.R. Nature of antibodies // Nature. – 1934. – V. 133. – P. 292-293.
  31. Marshall J.M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods // J. Exp. Med. – 1951. – V. 94. – P. 21–30.
  32. Moll R. Subcellular Biochemistry. Vol 31: Intermediate Filaments/ Ed. Herrmann and Harris. Plenum Press, New York, 1998. – P.

    205-262.

  33. Nakane P.K., Pierce G.B.Jr. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigen // J. Histochem. Cytochem. – 1966. – V. 14. – P. 929.
  34. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. WHO Classification of Tumours. – 2006 . – V.5. – 427 p.
  35. Royuela M., De Miguel M.P., Bethencourt F.R., Sanchez-Chapado M.

    , Fraile B., Paniagua R. Transforming growth factor beta 1 and its receptor types I and II. Comparison in human normal prostate, benign prostatic hyperplasia and prostatic carcinoma // Growth Factors. – 1998. –V. 16, N 2. – P. 101-110.

  36. Sternberger L.A. The unlabelled antibody peroxidase-antiperoxidase (PAP) method. In: Sternberger, L.A., Ed Immunocytochemistry.

    John Wiley, New York, 1979.-p. 104-169.

  37. Thornton A.D., Ravn P., Winslet M., Chester K. Блокада ангиогенеза с помощью бевацизумаба и хирургическое лечение колоректального рака // Современная онкология. – 2007. – Т. 9, № 1. (www.consilium-medicum.com/media/onkology/07_01/49.shtml).
  38. Van Aken E., De Wever О., da Rocha A.S.C., Mareel M.

    Defective Ecadherin/catenin complexes in human cancer // Virchows Arch. – 2001. – V. 439. – P. 725-751.

  39. Wood G.S., Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems // J. Histochem. Cytochem. – 1981. – V. 29. – P. 1196-1204.

ОПИСАНИЕ КУРСА И ПРОГРАММА

ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ОНКОМОРФОЛОГИИ

Тема № 10. Иммуногистохимическая характеристика опухолевых клеток. Опухоли из эпителия

В настоящее время иммуногистохимический метод исследования широко применяется для выявления неизвестной локализации первичной опухоли при наличии её метастазов. От 10 до 15% раковых опухолей характеризуются метастазами в различных органах, полостях и лимфатических узлах.

При морфологической диагностике метастатические опухоли, согласно рекомендациям Европейского общества медицинской онкологии (ESMO, 2004), целесообразно разделять на пять крупных категорий: аденокарцинома, плоскоклеточный рак, нейроэндокринный рак, недифференцированный рак, недифференцированная опухоль. Эти морфологические категории наряду с данными о распространённости процесса во многих случаях позволяют определить адекватный план обследования и лечения.

Частота случаев, когда заболевание сопровождалось развитием метастазов, а локализация первичной опухоли на момент морфологического исследования неизвестна, составляет 3-15% от всех онкологических заболеваний. При этом локализация первичного очага определяется при жизни в среднем у 30-40% пациентов, на аутопсии – у 60-70%.

Иммуногистохимическое исследование в зависимости от морфологического типа новообразования позволяет уточнить гистогенез опухоли и/или высказаться о вероятной локализации первичного очага. Большинство из этих опухолей представляют аденокарциномы молочной железы, толстого кишечника, легких, яичников, поджелудочной железы, предстательной железы и желудка.

В случае метастазов аденокарциномы задача иммуногистохимического исследования состоит в выявлении вероятного источника метастазирования.

Для этих целей в настоящее время используется целый ряд маркеров включая цитокератины 7 и 20, тиреоидный фактор транскрипции (TTF-1), CA125, CDX2, рецепторы к эстрогенам, GCDFP-15, лизоцим, мезотелин, простат-специфический антиген.

Цитокератин 7 (CK7) относится к семейству белков промежуточных филаментов, имеет молекулярную массу 54 кДа, выявляется в различных видах железистого эпителия.

Антитела клона OV-TL (Dako) окрашивают цитоплазму различных видов клеток нормального и неопластического железистого эпителия, включая эпителий протоков. CK7 выявляется в клетках цилиндрического и железистого эпителия легких, шейки матки, молочной железы, желчевыводящих путей и собирательных трубочек почек.

CK7 окрашивает переходный эпителий мочевого пузыря, эпителий яичников и легких. Иногда можно встретить положительное окрашивание эндотелия сосудов. В свою очередь, CK7 не экспрессируется в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта, предстательной железы.

Практически не выявляется CK7 в гепатоцитах, эпителии проксимальных и дистальных извитых канальцев почек, миоэпителиальных клетках, многослойном эпителии кожи, языка, пищевода и эктоцервикса.

Моноклональные антитела OV-TL выявляют отдельные виды аденокарцином и могут быть использованы для проведения дифференциальной диагностики между CK7-позитивными тканями (такими как рак яичников и переходноклеточный рак) и CK7-негативными тканями (такими как аденокарциномы желудочно-кишечного тракта и рак предстательной железы).

Цитокератин 20 (CK20) является представителем кератина I типа, который непосредственно экспрессируется в эпителии желудка и тонкого кишечника, уротелии и клетках Меркеля кожи. Антитела (клон Ks 20.8, Dako) реагируют с соответствующим белком молекулярной массой 46 кДа.

CK 20 – это основной белок зрелых энтероцитов и бокаловидных клеток; он специфически экспрессируется в эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка и тонкого кишечника.

Его также можно выявить в аденокарциномах толстого кишечника, желудка, поджелудочной железы, желчных капилляров, в муцинозных опухолях яичников, переходноклеточном раке мочевого пузыря и раке из клеток Меркеля.

В свою очередь, в плоскоклеточных раках, аденокарциномах молочной железы, легких, эндометрия, не муцинозных опухолях яичников и мелкоклеточных карциномах легких CK 20 не экспрессируется.

TTF-1 – ядерный фактор транскрипции, представляющий собой гомеодоменный белок семейства NKX2 (молекулярная масса 40 кДа); экспрессируемый эмбриональной и зрелой тканью легкого и щитовидной железы.

В ядрах клеток большинства других органов – печени, желудка, поджелудочной железы, тонкого и толстого кишечника, почек, молочной железы, кожи, яичек, гипофиза, предстательной железы и надпочечников данный фактор не содержится.

TTF-1 выявлен в первичных легочных аденокарциномах и не экспрессируется в аденокарциномах толстого кишечника и молочной железы. Антитела к TTF-1 являются ценным маркером при дифференциальной диагностике аденокарциномы легких с метастазами рака молочной железы и мезотелиомы.

При выявлении аденокарцином легких с помощью TTF-1 окраска является более специфичной, чем при использовании антисурфактантных антител.

Лизоцим катализирует гидролиз отдельных мукополисахаридов клеточной оболочки бактерий. Используется для выявления опухолей из гистиоцитов и лейкозных клеток миелоидного ряда. Он выявлен в клетках селезенки, легких, почек, лейкоцитах крови, плазматических клетках, слюне, молоке и слезной жидкости.

Мезотелин – клеточный гликопротеин (молекулярная масса 40 кДа), располагается на поверхности мезотелиальных клеток и связан с механизмами клеточной адгезии. Он также выявляется в мезотелиомах, эпителиальных раках яичников и некоторых плоскоклеточных раках.

Клон 5В2 (Novocastra) окрашивает эпителиоидные мезотелиомы и аденокарциномы легких, яичников, опухоли брюшины, эндометрия, поджелудочной железы, желудка и толстого кишечника. Антитела не реагируют с тканью почек, печени, плаценты, кожи и щитовидной железы.

Мезотелина много в обычных мезотелиальных клетках, из которых формируются злокачественные мезотелиомы и цистаденокарциномы яичников. Эти антитела вместе с антителами к калретинину могут быть использованы для выявления мезотелиом.

CDX2 – рекомбинантный белок прокариотов, соответствующий аминокислотному N-терминальному участку молекулы CDX2 человека. Является специфическим транскрипционным фактором клеток тонкого кишечника.

Ген cdx2 кодирует интестинально-специфический транскрипционный фактор, его белок экспрессируется на ранних стадиях развития тонкого кишечника и может иметь значение в регулировании пролиферации и дифференцировки эпителиальных клеток тонкого кишечника. Играет важную роль в инициации дифференцировки клеток в зрелые энтероциты.

Клон AMT28 (Novocastra) реагирует с 40кДа белком, расположенным в ядрах клеток. Он экспрессируется в ядрах эпителиальных клеток кишечника от двенадцатиперстной кишки до прямой кишки.

Белок CDX2 экспрессируется также в первичных и метастатических опухолях толстого кишечника, а также выявляется при кишечной метаплазии желудка и кишечном типе рака желудка, в свою очередь, в нормальных эпителиальных клетках желудка он не встречается. Данный белок обнаруживается в ядрах только цилиндрического эпителия и раковых клетках колоректальных аденокарцином, таким образом с его помощью можно идентифицировать метастазы рака толстого кишечника.

CA125 – белок ракового антигена яичников. Моноклональные антитела (клон Ov185:1, Novocastra) распознают муциноподобный гликопротеин молекулярной массой около 200 кДа. Антитела окрашивают различные опухоли, такие как аденокарциномы толстого кишечника, аденокарциномы молочной железы, опухоли матки, бронхо-альвеолярные раки, эндометриоидные и серозные аденокарциномы яичников.

ER – рецепторы к эстрогенам. Клон 6F11 (Novocastra) взаимодействует с эстрогеновым рецептором альфа. Антитела окрашивают ядра с рецепторами к эстрогенам в эпителиальных и гладкомышечных клетках матки, а также ядра эпителия молочных желез.

Выявление рецепторов к стероидным гормонам широко применяется при лечении гормонально-зависимых опухолей.

Наличие рецепторов к эстрогенам является маркером рака молочной железы, а также может свидетельствовать о прогнозе заболевания и эффективности эндокринной терапии.

Простат-специфический антиген (ПСА) – представляет собой гликопротеин. Клон ER-PR8 (Dako) получен к белку молекулярной массой 35 кДа. ПСА биохимически и иммуногистохимически отличается от другого широко используемого маркера опухоли предстательной железы – кислой простатической фосфатазы.

Он располагается в цитоплазме клеток ацинарного и протокового эпителия нормальной ткани, выявляется при доброкачественной гиперплазии предстательной железы и аденокарциноме.

Эти антитела можно использовать для выявления метастазов рака предстательной железы, поскольку ПСА выделяется опухолевыми клетками простаты и определяется в плазме крови у больных с раком простаты.

GCDFP-15 – белок, который встречается при диффузной кистозной мастопатии, для которой характерны макро- и микрокисты, протоковая и дольковая гиперплазия и др. патология молочных желез.

Кисты формируются за счет апокриновой секреции эпителиальными клетками. Жидкость кист содержит гликопротеины, включая уникальный 15 кДа мономер.

В нормальной ткани подобный белок встречается в эпителии слезных, подъязычных и мелких слюнных желез, в клетках серозных оболочек, трахеальных и бронхиальных желез.

GCDFP-15 и PSA одновременно экспрессируются в опухолях молочных желез с положительной реакцией на рецепторы к андрогенам. Данный маркер может быть использован для выявления аденокарциномы молочной железы, протоковых раков слюнных желез и апокринового эпителия.

Часть маркеров, такие как ПСА для рака предстательной железы, TTF-1 для рака легких, работают моноспецифично.

Другая часть маркеров этой панели характерна для нескольких опухолей: так, рецепторы к эстрогенам могут быть выявлены при раке молочной железы или яичников, CDX2 – при опухолях желудочно-кишечного тракта.

Часть маркеров может характеризовать источник метастаза только комплексно: рецепторы к эстрогенам, мезотелин и CA125 характеризуют опухоли яичников.

J.L Dennis с соавт. (2005) предложили алгоритм для выявления локализации первичных опухолей по иммуногистохимической характеристике метастазов с использованием данного набора маркеров:

  1. ПСА-позитивные опухоли, как правило, в 99% случаев представляют собой рак предстательной железы.
  2. TTF1-позитивные опухоли, в 98% случаев – рак легких.
  3. GCDFP-15-позитивные опухоли могут быть либо аденокарциномой толстого кишечника, либо аденокарциномой молочной железы. В данном случае для дифференциальной диагностики используется маркер CDX2. Опухоли CDX2(+) составляют аденокарциномы толстого кишечника, CDX2(–) – аденокарциному молочной железы.
  4. Положительная реакция с маркерами CDX2 и CK20 наблюдается в метастазах из опухолей желудка, поджелудочной железы и толстого кишечника. Применение дополнительного маркера CK7 позволяет дифференцировать эти опухоли. CK7(+) характерен для аденокарциномы желудка и поджелудочной железы; CK7(–) – характеризует аденокарциному толстого кишечника.
  5. Рецепторы к эстрогенам встречаются как в опухолях яичников, так и при раке молочной железы. В дифференциальной диагностике этих опухолей помогает маркер мезотелин(+), фенотип характерен для рака яичников; фенотип мезотелин(–) наблюдается при раке молочной железы.
  6. CA125 является маркером аденокарциномы поджелудочной железы.
  7. Мезотелин(+) характерен для опухолей желудка или поджелудочной железы.
  8. Лизоцим(+) выявляет опухоли желудка и поджелудочной железы.

Метастазы плоскоклеточного и нейроэндокринного рака без выявленного
первичного очага (Савелов Н.А., Петровичев Н.Н., 2006)

При метастазах плоскоклеточного рака проводить иммуногистохимическое исследование нецелесообразно, так как возможности метода не позволяют уточнить вероятный источник метастазирования.

Это относится и к метастазам низкодифференцированного нейроэндокринного рака.

Однако при метастазах высокодифференцированного нейроэндокринного рака (синоним – атипичный карциноид) коэкспрессия CK7 и TTF1 может свидетельствовать о локализации первичного очага в легком, а коэкспрессия CK20 и CDX2 – в органах ЖКТ.

Метастазы недифференцированного рака без выявленного первичного
очага (Савелов Н.А., Петровичев Н.Н., 2006)

У пациентов с метастазами без четких морфологических признаков железистой (аденогенной), нейроэндокринной или плоскоклеточной дифференцировки главной задачей дополнительных методов исследования является уточнение гистогенеза опухоли (точнее, установление направления дифференцировки опухолевых клеток). Для этого применяется следующая панель антител: р63, CК5, CK14 или CК5/CK6, CК18, СD56 (N-CAM).

Антитела к белку Р63 (клон 4А4, Dako). Белок Р63 принадлежит к семейству Р53 опухолевых супрессорных генов, которые также включают белок Р73. Эти белки регулируют процессы клеточной транскрипции и запускают процессы апоптоза в ответ на повреждение ДНК и развитие гипоксии.

Р63 экспрессируется в ядрах базальных клеток различных видов эпителия. Белок Р63 выявляется в пролиферирующих клетках эпителия шейки матки, уротелия и предстательной железы. Он также экспрессируется в большинстве низкодифференцированных плоскоклеточных раков.

Антитела к Р63 помогают дифференцировать доброкачественные и злокачественные опухоли предстательной железы.

Антитела к белку CD56 (клон МОС-1, Dako). Белок CD56 является антигеном клеток натуральных киллеров. Реагирует с CD4+ и CD8+, Т-клетками в периферической крови. CD56 можно выявить в нейробластоме и мелкоклеточном раке легких, а также некоторых других опухолях.

Цитокератины CK5/CK6 (клон D6/16 B4, Dako). Цитокератины относятся к семейству промежуточных филаментов и выявлены практически во всех клетках. Типы цитокератинов CK5/CK6 выявляются в мезотелиальных клетках и не встречаются в аденокарциномах.

CK5/CK6 применяются как маркеры мезотелиомы и плоскоклеточного рака легких, болезни Боуэна (разновидности карциномы, поражающей чешуйчатые клетки эпидермиса кожи, но не распространяющейся на ее базальные слои).

Они не встречаются в аденокарциномах легких, но окрашивают мезотелиому и базальные клетки желез простаты. Данные антитела не реагируют с тканями мезодермального происхождения, такими как мышцы и соединительная ткань.

Цитокератины CK5/CK6 экспрессируются в низкодифференцированных аденокарциномах и выявляются в эпителиоидных мезотелиомах.

Цитокератин CK14 (клон LL002, BioGenex), молекулярная масса 50 кДа, – это кислый цитокератин первого типа, с помощью которого можно отличить многослойный плоский эпителий от простого эпителия.

Цитокератин CK14 равномерно экспрессируется в цитоплазме всех клеток многослойного плоского ороговевающего эпителия.

Моноклональные антитела к цитокератину CK14 помогают дифференцировать типы клеток в молочных железах при развитии аденокарциномы.

Цитокератин CK18 (клон DC10, Dako) – белок с молекулярной массой 45 кДа. Антитела реагируют с большинством видов простого эпителия, включая эпителий протоков и ацинусов желез.

Данный белок экспрессируется в эпителии щитовидной железы, молочной железы, желудочно-кишечного тракта и дыхательной системы.

Антитела используют для выявления аденокарцином легких, при этом они окрашивают цитоплазму опухолевых клеток из эпителия и не окрашивают опухолевые неэпителиальные клетки (глиомы, меланомы, остеосаркомы).

Для дифференциальной диагностики низкодифференцированных опухолей используется следующий алгоритм:

  1. СК18(+) – аденокарцинома;
  2. СК5/14(+) и р63(+) – плоскоклеточный рак;
  3. СК5/CK14(+), СК18(+), р63(+) – переходноклеточный рак, плоскоклеточный рак, тимома;
  4. СК18(+), CD56(+) – нейроэндокринный рак.
  5. При выявлении экспрессии СК5/14, СК18 и р63 дифференцировать переходноклеточный рак от плоскоклеточного в ряде случаев возможно, исследуя коэкспрессию СК7 и СК20, которая наблюдается приблизительно в 60% метастазов переходноклеточного рака.

Источник: http://bono-esse.ru/blizzard/Lab/Onko/igh_10.html

Medic-studio
Добавить комментарий