Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической

��������������������� �������� ������������, ����� �������� �.�

Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической

������ �������� ����������� � ������ 20 ���� ������� � ���������� ������ ������ ���������������� ������������ � ����������������������. ���������������� � ��� ����� ��������� � ������ ����������� ���� ��� ����� ���������� ��� ��������� ���������� (��������) in situ � ������� ���������������� � ��������������� �������.

�������� ����� ������ �� ����� ��������� ������ �������������� ��� ������������ �������� �����, ������� ������� �������� �������� ������������� �������� � ��������� �� � ��������������� �����, ����� ���� ����������� �������� ������ � �������� �������������������.

������ ����� �� ������� �������� ��������������� ��-�� ������� ��������� ��������� �������, ��������� �� ������������ � ������ ����������������� �����������. ����������� ���� ���� �������� �� ������ ������������������ ������ ������, �� � ����������� ���� ��� ����������.

���� ������� ������ � ������, ���������� ������� ��������, ����������� ������ ���������� ������� � ��������, ������� � � ����������, ����� ������ ��������� ��������� �������. ��� ��� ������� � ������������� ��������� ������ �������� ������� � ����������������� �������, � ����� � � ������������ ��������.

��������������������� �������� ������������ �� ����������� ���� �������� ������������ ������ ����� ������������, �.�. ������ ��� ������������ ������������� ������������ ��� ��� ���� �������.

� ������� ������ �������� ����� ���������� ����������� � ������ ��������� ��������� ��������� (��������, ���������, ����������������), ����������� ������ (����������, �������������� � ������������� ����������) � ���� ��������� ����� [1].

� ������ ����� ���������������� ������� ����� �������������� �������� � ���������, ������� �������� � ������������ ��������� ��������-��������. ��������� �������� ����� ��������, ������� ��� ��������� � ����� �������������� ��������� �������� �������� �����, � ���������� �������� ����������� ������������� ��������, ������� ����� ����������� � ������ ���������.

���������� ������ �������� ������������������ ����� � ������������, ���� ��� �������� �����������, ������ � ����������� �������. �������� ����� ����� �������� � ��������� ��������, ��� �������, � ��� ������, ���� ��� ����������� � ������������������� ����������� (�������, ��������������).

� �������� �������� ����� ��������� ������������� ��������, ����- � ������������, ��������� �����������, �����������, ������������. ��������, ���������� ������ �������� �����, �������� ��������������������. ����� �������� ������ ����� ��������� ��������������:

  • ����������, ��������� ������� ��������;
  • ��������� ��������� ����������� ������ (�.�. ���������� ������������� ��������);
  • ������������ ��� ����� 8000-10000 �������, ���� ��������� ������� ����� ����� ������������ ��� ����� 200 ��;
  • ���������������� � ���������;
  • ��������� ����������� ���������� �� ���������� ������� � ������ ���������;
  • �������� ���� ��� ��������� �������������� ��������.
  • ��������� ������� ��������, � ������� ����� ����������� ��������, ���������� ��������. ������ � ������ ������ �� ����� �� ����� ������� ������������� ��� �����������, ������������� �� ����������� ��������.

    ��-�� ����, ��� ��� ������������������ �������� ����� ������������ ����� � ������������, ������ ���������������� ��������������� ������ ������� ���� �� �������������� ��������-��������, �.�. �������� ������ ����������� � �������� ��� ���� � �����. ����� ��� ������� �������� ����������������.

    ���� ������������� ������� ������������ ������ ��������� ���������� ��������, �.�. ������������������� ��� ������������, ����� ������ �������� ���������.

    ���������� ��������� ���� ���������� �������, ������ ����� ����� ���������, ��� ��������� ������� �� �����������, ���������� ������, ������������ � ����������� �������������� ������ ��������. ������ ������ ������ ���������������������� ������ �������� ������������ ����������� ������� ��������-��������.

    ������� ��������, ����������� � ���������, ����� ��������� ��������� �����, ��������� � Fc-���������� �������. ������ ������� ����� ����:

  • �����������;
  • ��������;
  • ������� � ���������������;
  • ������������;
  • ������������� ��������� ��������, ��������, ������, ��������, ������������.
  • ������ ����� ����� ���� ������������� ��� � ���������� ����������, ��� � � ����������. ���� ����� ������������� � ���������� ���������� (���.1, �), �� ����� ����� ������������ ���������� ������. ��� �������� ������� ����� ������������, ������ ���������������� ��� ������ ������, ��� ��� �� ���� �������� �������� �������� ����� ����������� ���� �����.

    ���������������� ������ ���� ������� �������� ����� ����������� ��������� ������: ��������� �������� �� ����� �� ���� ������� �����, ����� ����� ��������� �������� (���.1, �), ��� ������� ��������� �������� �������� ���������. ��������, ���� ��������� �������� �������� �� �����, �� ���������� ����� ���� ��������, ����������� ��� Fc-��������� ������� ����������������.

    � ���� � ������� ����������� ��� ���� ����, ����� ����� ����� ��������� ������������:

  • ��������� �������� ������ Fc-��������� ������� ���� ��������� �������� ������� �����, ����� ����� ������������ � ��� �����;
  • ��������� �������� �� ����� �� ���� ������� �����, � ������, ����� � ������� ��������� � �����, ����� �� ������ �� ��������������� ��������� ����� �������������� ������� � ���������.
  • � �������� ����� ������� ������������ ��������� �����������. � ������� 1 ������������ �������� ����� ������������ �����������. ��� ����������� �������� ������������ ��������� ���� � ������� ��������� ������� ��� ��������� �� ������ � ������������ ������ ����� (����.1).

    ������, �������������� ����� ����� ���� ����������:

  • ������������� ������������ ��������������� ���������� � ������� ��������� ��������;
  • ������ ���������������� ������;
  • ��������� ���������� ����������;
  • ������� ��������� �������������, ���� ��� ������������� ���������, ��������� ������ ������ (��������, �������������� 2-(4-������������)-6-�������������� (DAPI);
  • ���������� ��������� ������ �������.
  • ������� � ���������� ���� ����������� ������ ��������� ���������� �������, ����� ��������� ����� ���� ����������� � ������� ������� �������� ����������� � ����� �������. �������� ������� ������ ��� ��������� ���������� � ���������� ������ �������� �������� �������, ��������, ���������� ������.

    � ���������� ������� ��������-�������� � ����� ��������� ������� � �������� ���������� �������������� ����������� � ������ ����. ������ ����� �������� ��������� �������� �������������� ����� ��-�� ������ ����������������, ������ � 1989 ���� ���������������� ���� �������� � 100 ��� � ������� ������ �������� �������� � ����������� � �������������� ����� [7].

    � ������ ������� ������������ ��������, �������� �������� ��������� ��� ������������ ����������-����������������� ������������ ����������. ������������ ����� ������������ ����� ����� ��-�� ������� ��������� ��������� ���������. �������� �������������� ������� �������� � ������ ������ ������������ ������ ��� ������������ �� ����� ��������� ������.

    ����� ��������� �������� ����� ���������� � �������������� ������� �� ������� ��������� ����� ������ � ���������� �������� �������� � ������. ���������� ��������������� �������� ���������� ����� [4].

    ���� �������� ��������, ��������������� � ���������, �������� ������������ ������� ���������� ������� ���������, �������������� ������������� ��������� ������������� � ����� ������ �������������� � �������� ��������.

    ������� 1. �������������� �������� ����� ������������ ������������.

    ��� 1. ������ � �������� ����� ������������

    � � ��������� �������� ������ �������� �������� �����, ��������, ����������. � � ��������� �������� ������ �������� �� ����� �����, ����� ��������� � ��������� ��������� ��������� ��������� ��������, ������� ����������� � ���������. ����� ��������� �� ��������� ��������.

    ��� 2. �������� ��������, ������������ ��� ���-������.

    ��������� �������� � �������� ������ ����������� � ���-��������� ������ ���� �������� �� �������� ������ � ���� �� ����. ���������� ��������������� � �������� ���������� ����� �������� ����������� �����, ������� ������� ��������� ������ � ����, �������� ��������� � ��������������.

    ��� ������� �� ��������� ��������� ���������� ��������� ����������, ������� ��� ��������� �������� �������� ������������� ��������� ���������� �����. ��������� ��������� ��������� � ���������� ����������� � ������� 2. ���������� �������, ��� ����������� � �������� ��������� ���� � � ������ ���������, ������� ������ ����� �������� ������������������ ���������� [2,3].

    ����������� ���������� � ������� ���������� � ����������� � �����������, ������� ��� ������� ������ �����, �������� ����� � ������ ������������������ ������� ������������� ����� �������� �� �������������. ��� ������� ������ ������ ��������� ������������� ���������� ����������� ����������� �������� �������� ����� ���������� � ���������� ����������.

    �������� ��������� ���������� �� ������ ������, ������� �� ����� ��������� � ���������� � ���� ��������� ���������, ������ ���� �������, ��� �������� ��������� ��������� � �������� �� ������������ �����������, ������� ��� ���� ������ ����� ������������ ������ ��������. �������������� ����� �������������� ��� ����������� ��� ������� ����� ������, �.�.

    � ������ ������������� ��� ������ ��������. �������� ���������� ����� ����� ������� ����� ������ ��� ���������� ��������������������� ����������, ������ ��� �������� �� ���� ������.

    ��� ������������ ���������, ������� ���������� � ��������� ���������� � ������� (��������, ���������� � �������� �� ��������� �����������, ������ �������) ���������������� ������ ������ ���� ���� �������������. ��������� ����� � �������� ������ ������������ ����� ������� � �������������� ������� ������ ����������� � �������� ��������� (PAP � APAAP-���������).

    ������������������ ��������� ���������.

    1 ����: ������� ��������� ��������� ��������; 2 ����: ��������� ��������� �������� ������ ��������� (��������� ��������), ��� ���� ���� �� ������������������ �������� ��������� ������� ����������� � ��������� ���������, � ������ �������� ���������; 3 ����: �������� �������� ������ ����������� ��� �������� ���������, ���������� �� ��������� ���� �� ����, �� �������� �������� ��������� ��������, ������������������ ������� �������� ������ ��������������� ���������. ��� �������� ����������� �� ������ ������������������ �������� ��������� (���������) �������. ����� �������, ����������� ��������, ��� � ����� ��������� ����������� ���������� ��� 2 �������� �������� (���.2), ��� ����������� ���������������� ������ � 2 ����. ��������� �������� ����� ���������� � 1979 ���� ������ ��������� ����������������� � �������������� ������-����������� ��������� [5,6].

    ������� 2. ��������, ������������ � ��������������������� ���������, � ��������������� �� ���������.

    ��� 3. �������� �������� ��� ���-������

    �������� ����������� � ��� �����. �� ������ ����� ��������� ��������� ���� ����������� � ���������, �� ������ ����� �������� �������� ��������� �������� ����������� � ����������, �� ������� ����������� �������� ������-������-�������, ������� �������������� � ������� ��������� �������. ������ �������� ��������� H, ���� ��������� ��� ���������� �������:

    ������ � ����������, ������� � �������� ������� ����������, � ������ � �������� �����, ������ ������������ � ���� � ������. �� �������� ����������� �� ������ �������� ������������� (�����������������). ������ ����� ����� �������� � ������� ���������� � ���������� �������, � ��� ����� � ���������� � �����������������.

    � ������� ���������� ������ ���������� � ������ ������� ���, ��� �� ������ � �������������� ��������, ������� ������������ ����� 68 ���. ������ �������� � �������� ����������� ������� �������� (��=1015����-1). ��������� ����� �������� ����� ������ ��� ������������� ���������, �.�. ������ ����������� ��� ����������.

    ����� ����, ������ ����� 4 ����� ����������, � ������� ����� ������������ ������ ��� �����. ����� �������, �������� ������-������ ����� ������������ ��� ��������� ������ ����� ���������� � ����������. ��� ����� ��������� ��������, ��������� �� ��������, ���������� � ��������, � �������.

    � ������������ ��������� ��� ������ ���������� ������� ������� ����� ������ � ��������� ��� ������������, � ��������� �������� ��������� (���.3). ����� ��������� � ���������� ����������, ���������� � ��������, ��������� �������� ������-������-�������. ����� �������, � ����� ��������� �������� ����������� ���������� ��� �������� ��������.

    ������ ����� ��� ������ ABC-������� (������������ �� ����������� Avidin and Biotinylated horseradish peroxidase macro-molecular Complex).

    � ���������, � ������ ����� ����� ����������, ��� ��� ������ ����������� � ���������� ��������, ������� � ������� ���������� ���������� � ������ � ������, � ����� �� ����� ����������� � ��������� � ����������� �������� � ������, ��� ��� ������ ����� �����, ��� ��������������� ����� ����� � ������ pH 10,0.

    ���������� �������� �������� ��� ���������� ����� ������ ������� �� ������������ � ����� � ������������ ������ ����� 60 ���, ������� �������� �� ��������������� Streptomyces avidinii (SaBC-�����).

    ������������ �������� ������ �� ������������� ��������� ������, ��� � ������, �� � ������� �� ���� �� �� ����� ������ � ����������� �����, �� ����������� � ���������� ���������� � ������� ������ � ���������� ��������. ������ ������� �� ������������ ��������� ����� ��������� ������� ����������� � �������� ���������������� ������ �������������� � 8 ���.

    ������� 3.

    ������� ������������ ��������� �������� ��������� ����

    ����������/�����������������
    ��������-�������� �������� (���������� ��� �������������)���������������� ����� ������� ������. ������������ ����� � ����������������, �� ������ � ��������� ����������.
    PAP- � APAAP-����� DAKO PAP kit DAKO APAAP kit ����� ������� �� ������������-����������������� ��������� ��� ����������-��������������� ���������.
    ABC-����� Novocastra Novostain Super ABC kit VextorLab VectraStain ABC kit ����� ������� �� ��������� ������-������-�������
    SaBC-����� DACO LSAB, LSAB+, LSAB2 Biogenex Super Sentitive Link-Label IHC Detection Systems (Biotin Based) Zymed Histostain-SAP Kit Zymed Histostain-Plus Detection Kit Chemicon IHC Select Detection Kits ����� ������� �� ��������� ������������-������-�������
    ���������� ���������� � ���������� ���������� DAKO EPOS ����� ������� �� ������������ ��������, ����������� �� 20 ��������� ������� � �� 100 ������� ��������
    ���������� ���������� �� ���������� ���������� DAKO EnVision, EnVision+ Biogenex Super Sensitive Polymer-HRP IHC Non-Biotin Detection System ImmunoVision PowerVision Zymed SuperPicTure Polymer Detection Kit ����� ������� �� ������������ ��������, ����������� �� 20 ��������� ������� � �� 100 ������� ��������
    ����� ������������ � �������-�������� DAKO CSA ImmunoVision ImmunoMax ����� ������� �� ��������� ������������-������-������� � �������� ���������� �������-������
    ����� ������������ � �������-������������ DAKO CSA II ����� ������� �� ��������� ������������-������-������� � �������� ���������� �������-�����������

    ��� 4. �������� �������� ��� ������� � ����������� ���������

    �� ������������ �������� ������������� �� 20 ��������� ������� � �� 100 ������� ��������. ���������� ��������� ������ ������������ ����� ���������� ���������� ������. ������� ������ �������� ������������ ��������, �� ������� ����������� �� 20 ������� ��������� ��� ��������� ������� � 100 ������� �������� (���.4).

    ����� �������, ���� �������� �������� ����������� ��������� �� 100 ���������� ��������, ��� ������������ ������ ������� ����������������. ��� ����� ��������������� ����������� ������� � �������������, ���������� �� �������� [1]. �������, �������������� ��������� � ��������, ��� ��������� ����������� ��������� � ������������� ����� � ������� � ����� ����� ��������.

    ����� ��������� �������� ������������-�����������, ������� �������������� � �������� � ��������� �������������� ���������� � ����� ���������� �� ����� ��� (���.5). � ������� ������� ������ � ������ ����� ��������������� ������� ����� ����� �������� ��������. � ���������, ������ ����� ����� ��������� �������������� ������� ����������� �������.

    ��� 5.

    �������� �������� ��� ������� ������������ � �������������

    ������ ��� ����� ����� ��, ��� � ��� ���-������. ����������� �����: � � � ������� ��������� �������, ��������� � ��������; � � ��� ��������� ����������� ������� ��������� � ������������� ����� � ������� ������ ��������� ��������-��������; � � � ������� ��������� �������� ������������-������-�������, ������� ����������� � ��������, ��������������� � ���������.

    ���������� �� ���������������� ����������� ��-�� ����������� ������� ������� � ��������� ��������� ������ ������������. � ��� ������� ��������� �� � ��������, � � �������������, � ������ ������������-�������������� ��������� ������������ �������� ������ ������������, �������� ������������ �����.

    ���������������� ������ ��� ���� �� ��������, �� ��������� �������/��� ����������� ����������.

    Источник: http://masters.donntu.org/2009/kita/batluk/library/st3.htm

    Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии ( Коллектив авторов, 2014)

    Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической

    При взятии материала для ИГХ-исследования следует строго соблюдать все требования, которые предъявляются к этой процедуре при обычном патоморфологическом исследовании. Материал не должен подсыхать перед погружением в фиксирующую среду, его не следует промывать гипотоническими средами (например, водой).

    Фрагменты материала не должны быть слишком крупными, поскольку большие размеры фиксируемых кусочков не позволяют добиться равномерности фиксации и хорошей сохранности центральных областей объекта, что в последующем проявляется различными артефактами.

    Фрагменты тонкостенных полых органов и пленочные препараты необходимо фиксировать в расправленном состоянии. Лучше всего для этого использовать восковые пластины. Фрагменты картона и плотной бумаги менее пригодны.

    При планировании исследования костной ткани следует ограничиться минимальными размерами объекта, поскольку крупные фрагменты костной ткани невозможно хорошо декальцинировать в тех декальцинаторах, которые пригодны для ИГХ (см. Приложение 1).

    Патогистологический материал, включая операционные биопсии, желательно фиксировать в нейтральном формалине (параформальдегиде) или цинк-формалине, который по времени фиксации и обеспечению способности препаратов к восприятию обзорных окрасок полностью подобен обычному формалину. Простой (не нейтрализованный) формалин, приготовленный из концентрированного формальдегида 1: 9, использовать нежелательно.

    В научных исследованиях, когда требуются максимально высокое качество гистологического препарата и хорошая сохранность антигенов, следует помимо цинк-формалина использовать и другие фиксаторы, предназначенные для применения в ИГХ (см. Приложение 1).

    При проведении экспериментальных исследований в отдельных случаях может понадобиться перфузионная фиксация (способ, когда фиксирующая жидкость вводится через артериальное русло).

    Обычно после применения альдегидных фиксаторов наступает перекрестная сшивка белковых молекул, что ведет к ухудшению выявляемости антигенов и вызывает необходимость их протеолитического или теплового демаскирования.

    Наш опыт показывает, что применение «мягкой» фиксации (фиксация в этанол-формальдегиде при концентрации последнего 0,5 – 1,0 % в течение 12 – 24 ч и фиксация в цинк-этанол-формальдегиде до 24 ч) не приводит к существенному ослаблению иммуноцитохимической реакции на белки промежуточных филаментов, α-актин, коллаген IV типа, ламинин, фибронектин (Коржевский Д. Э. [и др.], 2001), белки PCNA (Коржевский Д. Э., 2000), Bcl-2 (Коржевский Д. Э. [и др.], 2002), CD31 (Коржевский Д. Э. [и др.], 2006б), CD68 (Коржевский Д. Э., 2001), ядерный белок NeuN (Коржевский Д. Э. [и др.], 2005) и не требует демаскирования антигена.

    Коагулирующие фиксаторы (спирты и различные спиртовые композиции) дают лучшие результаты при фиксации белков и гликопротеидов с большой молекулярной массой.

    Так, оптимальной фиксацией для определения виментина является жидкость Карнуа (один из коагулирующих фиксаторов). При фиксации нервной ткани предпочтительна непродолжительная (до 24 ч) фиксация в цинк-этанол-формальдегиде (Коржевский Д. Э. [и др.

    ], 2006а), который не только хорошо сохраняет многие антигены, но и дает возможность получить отличные результаты при окраске по Нисслю. Для фиксации небольших пептидов (инсулина и др.

    ), малых молекул и гаптенов (например, моноаминов) рекомендуется использовать альдегидные фиксаторы, поскольку в коагулирующих фиксирующих средах возможно частичное растворение либо диффузия низкомолекулярных антигенов.

    После окончания фиксации остатки фиксирующих веществ необходимо удалить из материала, тщательно промыв его в дистиллированной воде (после формалина и цинк-формалина) или этаноле (после коагулирующих фиксаторов и спиртовых смесей). Заливка должна быть осуществлена в течение 2 – 5 сут после завершения фиксации.

    Это обеспечивает максимальную сохранность антигенов и их хорошую выявляемость в препаратах.

    При использовании архивного материала, длительно фиксировавшегося в формальдегидных фиксаторах либо хранившегося в 80 % этаноле, тепловое демаскирование следует проводить обязательно для всех типов антигенов, которые при этом не подвергаются разрушению, и использовать вторичные системы детекции высокой чувствительности.

    Степень «жесткости» альдегидной фиксации и пригодность архивного материала для ИГХ-исследования удобно контролировать, используя тест-реакцию с моноклональными антителами к виметину (клон V9). Антитела клона V9 выявляют чувствительный к перефиксации эпитоп этого белка ПФ. Поскольку клетки, содержащие виментин (фибробласты, эндотелиоциты, менингоциты и др.

    ), присутствуют в любом гистологическом объекте, за редким исключением, отрицательные результаты пробной ИГХ-реакции на виментин будут указывать на малую пригодность материала для ИГХ в целом. При обезвоживании материала не следует применять изопропанол, который делает объекты хрупкими и плохо поддающимися резке на микротоме.

    В качестве промежуточных сред могут быть использованы: хлороформ, петролейный эфир, ортоксилол, метилсалицилат, метилбензоат, неоптическое кедровое масло, пихтовое масло, терпинеол. Заливку можно проводить, используя парафин любых коммерческих марок, лучше известных производителей, как отечественных, так и зарубежных.

    При этом не следует применять парафин с высокой температурой плавления (58 – 60 °C). При заливке не рекомендуется использовать температуры выше 60 °C.

    Заливка в целлоидин и целлоидин-парафин нежелательна, так как приводит к развитию неспецифической фоновой окраски в ходе выявления пероксидазы диаминобензидином. В случае необходимости применения целлоидина перед постановкой реакций его следует удалить из срезов жидкостью Никифорова (спирт-эфиром).

    Изготовление срезов для ИГХ-исследования следует проводить на надежных ротационных и санных микротомах, обеспечивающих точную подачу и необходимый диапазон толщины срезов (3 – 7 мкм).

    Более толстые срезы могут потребовать модификации протоколов ИГХ-обработки и изменения времени демаскирования антигенов. Кроме того, толстые срезы плохо удерживаются на предметных стеклах даже при использовании специальных адгезивов.

    Срезы должны быть хорошо расправлены. Отсутствие складок позволяет обеспечить лучшее прилипание к предметному стеклу.

    Для того чтобы избежать неспецифической фоновой реакции при наклейке срезов на предметные стекла, не следует использовать в качестве адгезивов яичный альбумин и сыворотку крови.

    Обычно расправленные на дистиллированной воде срезы толщиной до 5 мкм хорошо приклеиваются к ничем не обработанным предметным стеклам импортного производства (например, к стеклам фирм «Shandon» (США) и «Menzel» (Германия)).

    При необходимости обычные предметные стекла для улучшения прилипания срезов могут быть обработаны специальными адгезивами (см. Приложение 2).

    При расправлении и сушке срезов нежелательно применять высокие температуры (выше 48 °C). Оптимальным является просушивание срезов в суховоздушном термостате с вентиляцией при 40 °C в течение 3 дней.

    Более продолжительное пребывание срезов в термостате может способствовать лучшему их приклеиванию к предметным стеклам.

    При необходимости работы с препаратами на следующий день после изготовления срезов желательно использовать стекла с адгезивным покрытием, нанесенным в заводских условиях.

    Потеря срезов во время проведения теплового демаскирования и длительной инкубации с антителами, когда нельзя изготовить новые срезы (весь блок уже порезан), ставит вопрос о принципиальной возможности улучшения прилипания срезов к предметному стеклу на этапе, когда срезы уже находятся на нем.

    Эту проблему можно попытаться решить, прогревая предметные стекла со срезами в течение ночи (перед проведением ИГХ-реакции) в термостате при 60 – 65 °C.

    При использовании такого способа достигаемое иногда улучшение приклеивания срезов сопровождается некоторой потерей иммунореактивности, вызванной действием на срезы высокой температуры.

    Удаление парафина из срезов и их регидратацию перед иммуногистохимическим исследованием проводят так же, как и перед обычной окраской.

    При этом следует проверять спирты на загрязнение ксилолом, поскольку остатки ксилола, как и плохо удаленный парафин, могут приводить к понижению чувствительности реакции.

    Заменители ксилола следует использовать с осторожностью, поскольку они медленнее отмываются в спиртах и быстрее загрязняют их, чем ксилол.

    Коржевский Д. Э. Использование моноклональных антител к ядерному белку PCNA для выявления пролиферирующих клеток в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2000. – Т. 118, № 5. – С. 68 – 70.

    Коржевский Д. Э. Макрофаги сосудистого сплетения конечного мозга эмбриона человека // Морфология. – 2001. – Т. 119, № 1. – С. 20 – 23.

    Коржевский Д. Э., Гилерович Е. Г., Зинькова Н. Н. [и др.]. Иммуногистохимическое выявление нейронов головного мозга с помощью селективного маркера NeuN // Морфология. – 2005. – Т. 128, № 5. – С. 76 – 78.

    Коржевский Д. Э., Григорьев И. П., Отеллин В. А. Применение обезвоживающих фиксаторов, содержащих соли цинка, в нейрогистологических исследованиях // Морфология. – 2006а. – Т. 129, № 1. – С. 85 – 86.

    Коржевский Д. Э., Отеллин В. А. Морфологические основы формирования гематоликворного барьера сосудистого сплетения головного мозга в пренатальном онтогенезе человека // Журн. эволюционной биохимии и физиологии. – 2001. – Т. 37, № 2. – С. 150 – 153.

    Коржевский Д. Э., Отеллин В. А., Неокесарийский А. А. [и др.]. Организация и цитохимические особенности барьерных структур плаценты человека // Морфология. – 2006б. – Т. 129, № 3. – С. 63 – 64.

    Коржевский Д. Э., Талантова О. Е., Павлова Н. Г. Экспрессия белка bcl-2 в развивающемся головном мозге человека // Морфология. – 2002. – Т. 122, № 5. – С. 31 – 34.

    Источник: https://kartaslov.ru/%D0%BA%D0%BD%D0%B8%D0%B3%D0%B8/%D0%9A%D0%BE%D0%BB%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%82%D0%B8%D0%B2_%D0%B0%D0%B2%D1%82%D0%BE%D1%80%D0%BE%D0%B2_%D0%A2%D0%B5%D0%BE%D1%80%D0%B5%D1%82%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B5_%D0%BE%D1%81%D0%BD%D0%BE%D0%B2%D1%8B_%D0%B8_%D0%BF%D1%80%D0%B0%D0%BA%D1%82%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%B5_%D0%BF%D1%80%D0%B8%D0%BC%D0%B5%D0%BD%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%B5_%D0%BC%D0%B5%D1%82%D0%BE%D0%B4%D0%BE%D0%B2/7

    Иммуногистохимические методы исследования нервной системы

    Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической

    Иммуногистохимия – это комплекс методов исследования тканей, основанный на способности иммунной системы позвоночных (главным образом, млекопитающих и птиц) вырабатывать специфические белки – антитела, способные избирательно связываться с конкретными веществами (антигенами). В организме антитела используются, главным образом, для идентификации и нейтрализации патогенов.

    Особенность работы иммунной системы такова, что в теории антитела могут быть выработаны против практически любых химических соединений. Чем крупнее молекула антигена, тем быстрее и лучше будут вырабатываться антитела.

    Таким образом можно выработать антитела против интересующего вещества, выделить их из общей сыворотки и использовать для обнаружения этого вещества в клетках и тканях самых разных организмов.

    Методы иммуногистохимических исследований не новы. Начало им было положено в 30-е годы ХХ века, когда удалось получить меченные красителем антитела, которые реагировали с соответствующими антигенами и окрашивали их.

    В начале 40-х годов были получены антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой. Исследования проводились с использованием обычного флуоресцентного микроскопа.

    Появление же конфокального микроскопа значительно расширило возможности этого метода и позволив анализировать трехмерное строение интересующих структур.

    Антитела представляют собой гликопротеины, которые выделяют в особую группу иммуноглобулинов. Молекулы антител состоят из пары одинаковых тяжелых и пары одинаковых же легких полипептидных цепей. Соответственно, каждая молекула антител содержит два одинаковых антигенсвязывающих участка, распознающих соответствующий антиген и связывающийся с ним.

    Антитела вырабатываются В-лимфоцитами, при этом каждая отдельная линия В-лимфоцитов производит лишь один тип антител, распознающих один определенный эпитоп.

    Вследствие этого антитела принято делить на моноклональные (произведенные одной единственной линией клеток и распознающие один-единственный эпитоп) и поликлональные (произведенные лимфоцитами различных линий и распознающих, предположительно, различные эпитопы, предположительно одного антигена).

    Моноклональные антитела более специфичные, чем поликлональные, однако производство их обходится существенно дороже. Поэтому чаще всего для исследовательских целей используют поликлональные антитела.

    Сами по себе антитела не окрашены и не обладают способностью к флуоресценции. Существует несколько различных способов визуализации в иммуногистохимии, основывающихся на присоединении флуоресцентной или хромогенной метки к молекулам антител. Метка пришивается непосредственно на антитела, выработанные против конкретного антигена.

    Существует другой способ – так называемый непрямой иммуногистохимический метод. Он более чувствителен и гибок в работе. Заключается он в использовании двух различных антител: первичных и вторичных. Первичные антитела вырабатываются против конкретного антигена, который необходимо детектировать. Это – чистые, ни с чем не конъюгированные антитела.

    Вторичные же антитела вырабатываются против белков организма, из которого были получены первичные антитела. К ним и присоединяются молекулы-метки. В ходе реакции вторичные антитела находят прикрепленные к антигену первичные антитела и связываются с ними. Для выполнения метода образец сначала инкубируют с первичными антителами, а затем с вторичными.

    Данная методика не только более чувствительна, но также позволяет использовать с одними и теми же первичными антителами различные метки для различных ситуаций. Вторичные антитела с одним типом метки можно использовать с различными первичными антителами.

    Следует лишь учитывать, что первичные антитела должны быть произведены в животных того вида, против которого выработаны вторичные антитела.

    Один и тот же объект можно маркировать антителами против нескольких различных антигенов. Количество их, в теории, ограничено лишь количеством видов животных-хозяев, против которых вырабатываются вторичные антитела и спектральными характеристиками красителей.

    Следует помнить, что если первичные антитела против различных веществ были выработаны в животных одного и того же вида (например, в кроликах), то использовать их в одном эксперименте невозможно.

    Связано это с тем, что при дальнейших обработках, одни и те же вторичные антитела свяжутся со всеми первичными антителами и понять, какие вещества в итоге будут выявлены, станет невозможным.

    Кроме того, не следует использовать в одном эксперименте различные вторичные антитела с флуоресцентными метками, имеющими одинаковые или очень схожие спектры поглощения/эмиссии – это может привести к сложности или даже полной невозможности качественного разделения флуоресцентных сигналов.

    Метка флуоресцентными антителами хорошо сочетается с большинством часто используемых флуоресцентных методик, таких как мечение фибриллярного актина фаллоидином или окраска ядер красителем DAPI. Кроме того, можно комбинировать методы флуоресцентной иммуногистохимии с хромогенными методами детекции, используемыми при РНК-гибридизации in situ.

    Поскольку антитела – довольно крупные молекулы (IgG имеет молекулярную массу около 150 кДа), иногда может возникнуть проблема доставки их внутрь клеток, да и вообще внутрь организма. Для решения этой проблемы обычно используют две группы подходов.

    Первая группа подходов заключается в незначительном повреждении мембран исследуемого образца с использованием детергентов. Обычно для этих целей используется Triton X-100 в концентрации от 0,05% до 5%. Наиболее часто используемая концентрация – 0,1%.

    В некоторых случаях, при работе с организмами, имеющими плотную кутикулу, такими как нематоды или членистоногие, необходимо механическое повреждение кутикулы. Повреждения можно нанести механически, например скальпелем, либо непродолжительным воздействием ультразвука.

    Также в некоторых случаях можно применять предварительную ферментативную обработку объектов с использованием протеаз, хитиназ или коллагеназ.

    Альтернативная группа подходов заключается в уменьшении размера самих молекул антител.

    Тяжелые цепи имеют так называемый шарнирный участок, по которому при помощи фермента папаина можно разрезать молекулу антитела на три фрагмента: два Fab-фрагмента (непосредственно антиген-связывающие фрагменты – fragment antigen binding) и один Fc-фрагмент (фрагмент способный к кристаллизации – fragment crystallizable).

    Fab-фрагменты гораздо легче проникают внутрь клеток. Такой вариант чаще всего используется при нефлуоресцентной детекции, когда вместо молекулы флюорофора к фрагменту антитела пришивается фермент щелочная фосфатаза. Данный вариант детекции используется главным образом при проведении РНК-гибридизации in situ.

    Источник: https://www.zin.ru/projects/neuromorphology/methods/immuno.html

    Иммуногистохимия: что это такое? Анализ на иммуногистохимию, сколько делают и для чего

    Тема № 2. Методические вопросы проведения иммуногистохимической

    Иммуногистохимия, или иммуногистохимический анализ — исследование, во время которого в образцах ткани с помощью антител выявляют определенные молекулы. Этот метод диагностики нашел широкое применение в онкологии.

    Немного теории и истории. Для того чтобы обнаруживать и уничтожать чужеродные вещества, иммунная система использует особые молекулы — антитела. Они отличаются специфичностью: каждое антитело может связываться строго с определенным антигеном.

    В 1941 году американский иммунолог Альберт Кунс впервые решил использовать антитела в лаборатории, чтобы «распознавать» с помощью них белки бактерий.

    В 1984 году биохимик из Аргентины Сезар Мильштейн получил Нобелевскую премию за то, что создал гибрид опухолевой клетки с лимфоцитом, которая могла синтезировать моноклональные антитела.

    После этого началось производство моноклональных антител для диагностических и лечебных целей.

    В 1994 г. С. Тэйлор применил иммуногистохимический анализ, чтобы проверить 20 000 опухолей, и обнаружил, что диагнозы в половине случаев были ошибочными. Иммуногистохимия зарекомендовала себя как эффективный метод диагностики.

    Какие задачи в онкологии помогает решать иммуногистохимия?

    Иммуногистохимический анализ помогает врачам-онкологам:

    • Отнести злокачественную опухоль к тому или иному типу.
    • Выяснить, в каких генах опухолевых клеток произошли мутации, какие белки способствуют прогрессированию рака.
    • Выявить первичную опухоль и ее метастазы.
    • Определить, произошла ли злокачественная трансформация клеток.
    • Определить прогноз для пациента.
    • Разобраться, поможет ли в данном случае таргетная терапия.
    • Определить, чувствительны ли опухолевые клетки к химиотерапии, лучевой терапии.

    Как это работает?

    Иммуногистохимия бывает прямой и непрямой. В первом случае используют один вид антител, которые должны вступить в связь с определенной молекулой-мишенью. Если молекула-мишень присутствует в ткани, и реакция произошла, опухолевая ткань окрашивается:

    • Чаще всего к антителу присоединяют фермент, например, пероксидазу. Этот фермент катализирует химическую реакцию, которая приводит к изменению цвета.
    • Иногда к антителу присоединяют флюоресцин или родамин, при этом окрашивание выявляют с помощью флюоресцентной микроскопии.
    • всего применяют непрямую иммуногистохимию. При этом используют два антитела. Одно соединяется с антигеном, второе — с полученным комплексом антиген-антитело. Маркер, который вызовет изменение цвета, связывают со вторым антителом.

    Непрямой метод имеет некоторые преимущества:

    • Он обладает более высокой чувствительностью, потому что с одним первичным антителом (тем, которое связывается с белком-мишенью) может связаться несколько вторичных антител.
    • Исследование занимает немного времени: для того, чтобы произошла реакция, нужно примерно 3 часа.
    • Непрямая иммуногистохимия требует небольшого количества антител. Например, вторичное антитело, направленное на иммуноглобулины кролика, будет реагировать на любое первичное антитело «кроличьего» происхождения. Не нужно создавать много разных видов вторичных антител с окрашивающей или флуоресцентной меткой.

    Как проводят исследование?

    Для того чтобы выполнить иммуногистохимический анализ, нужно получить опухолевую ткань, то есть провести биопсию. В качестве материала можно использовать столбик ткани, полученный во время трепан-биопсии, фрагмент тканей или даже целый орган, удаленный во время операции.

    Образец ткани фиксируют с помощью формальдегида (иногда используют метанол, ацетон и другие фиксаторы — это зависит от того, какой антиген нужно выявить, и реагирует ли он с теми или иными фиксаторами) и погружают в парафин. Парафинизация помогает законсервировать ткань, сохранить ее структуру на длительное время.

    Затем ткань, помещенную в парафин, нарезают с помощью специального инструмента — микротома — на слои толщиной 3–5 мкм. Эти тонкие срезы помещают на стекло, покрытое, специальным клеем.

    Некоторые образцы слишком чувствительны к реагентам, которые применяют во время вышеописанной процедуры. Их нельзя помещать в парафин. Такие ткани замораживают жидким азотом.

    Этим альтернативным методом пользуются редко, только в случае необходимости, так как у заморозки есть некоторые недостатки: она делает изображение под микроскопом не таким четким, требует специальных условий хранения образцов.

    Фиксацию ткани в таких случаях проводят уже после нанесения на стекло и размораживания, ацетоном или формальдегидом.

    После того как срезы нанесены на стекло, из них нужно удалить весь парафин, иначе антитела не прореагируют с антигеном. Эта процедура называется депарафинизацией. Ее проводят с помощью ксилола.

    Затем выполняют еще некоторые подготовительные процедуры, чтобы антитела могли успешно прореагировать с нужными антигенами, и, наконец, проводят непосредственно иммуногистохимический анализ.

    Обработанную антителами ткань рассматривают под микроскопом, чтобы проверить, окрасилась ли она.

    Какие молекулы-мишени выявляют во время иммуногистохимии?

    Количество возможных мишеней измеряется сотнями. Перед исследованием врач должен понимать, что он ищет, и использовать соответствующие антитела. В онкологии мишенями являются опухолевые маркеры — вещества, которые в здоровых клетках отсутствуют вообще или присутствуют в значительно меньшем количестве. Вот некоторые примеры:

    • Рецепторы к эстрогенам и прогестерону помогают идентифицировать гормонально-позитивный рак молочной железы и разобраться, помогут ли женщине гормональные препараты.
    • Простатспецифический антиген (ПСА) имеет значение в диагностике рака простаты.
    • Альфа-фетопротеин — присутствует в гепатоцеллюлярной карциноме (рак печени).
    • Цитокератины помогают в диагностике рака и некоторых сарком (злокачественных опухолей соединительной ткани).
    • Фермент CD10 (CALLA) связан с карциномой почек, лимфобластным лейкозом.

    Какова роль иммуногистохимии в современной онкологии?

    Иммуногистохимический анализ помогает изучить характеристики злокачественной опухоли, которые не могут выявить другие методы диагностики. Зачастую это играет важную роль в уточнении диагноза и назначении правильного лечения.

    Врач может определить, какие комбинации препаратов будут наиболее эффективны для конкретного больного, иными словами, реализуется принцип персонализированного лечения.

    Зачастую это помогает улучшить результаты, подобрать эффективное лечение для пациентов, которым не помогает стандартная терапия.

    Записьна консультациюкруглосуточно

    Источник: https://www.euroonco.ru/glossary-a-z/immunogistohimija

    Medic-studio
    Добавить комментарий