Трансгенные мыши как модель наследственной болезни Альцгеймера

Экзогенно-индуцируемая животная модель болезни альцгеймера

Трансгенные мыши как модель наследственной болезни Альцгеймера

Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к способу создания модели болезни Альцгеймера, отличающемуся тем, что церебральный амилоидоз у экспериментальных животных вызывается введением в их организм синтетических аналогов изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7.

Уровень техники

Болезнь Альцгеймера (БА) является смертельной нейродегенеративной патологией, клиническое протекание которой сопровождается неуклонным упадком психомоторных функций пациента на протяжении длительного периода (1). В России число таких больных составляет около полутора миллионов человек (2).

Лекарственных средств, способных остановить течение данной патологии, в настоящее время не существует нигде в мире, однако их поиску придается колоссальное значение во всех развитых странах, где с ростом числа лиц пожилого возраста увеличивается и число страдающих от болезни Альцгеймера.

Характерным молекулярным процессом болезни Альцгеймера является конформационное превращение небольшого (39-43 аминокислотных остатка) белка, бета-амилоида (3).

Этот белок является нормальным компонентом крови, где присутствует в виде мономера, однако образует олигомеры и надмолекулярные агрегаты (амилоидные бляшки) у пациентов с клинически диагностированной болезнью Альцгеймера (4).

Согласно широко принятой амилоидной гипотезе, именно полимеризация бета-амилоида, которая приводит к церебральному амилоидозу, является ключевым событием, запускающим весь патогенный каскад болезни Альцгеймера (5).

Церебральный амилоидоз представляет собой процесс образования плотных конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах головного мозга и является одним из важнейших нейроморфологических признаков болезни Альцгеймера (6).

В настоящее время существует несколько животных моделей болезни Альцгеймера, основанных на использования трансгенных грызунов (мышей, крыс). В этих моделях церебральный амилоидоз обусловлен изменениями в геноме, которые приводят к повышенной экспрессии эндогенного человеческого бета-амилоида (Аβ) в крови (7-9).

Мыши и крысы дикого типа в отличие от всех остальных млекопитающих имеют три замены в аминокислотной последовательности бета-амилоида и не подвержены болезни Альцгеймера. Введение синтетических аналогов Аβ в организм млекопитающих не вызывает у них развития церебрального амилоидоза и, соответственно, патогенеза БА.

В то же время было показано, что интрацеребральные инъекции гомогенизированных амилоидных бляшек, выделенных из мозга пораженных болезнью Альцгеймера людей, приводили к развитию церебрального амилоидоза у подопытных животных (10-19).

Эти данные дали основание считать, что главной движущей силой патогенеза БА является агрегирование эндогенного бета-амилоида под влиянием структурно и/или химически измененной изоформы бета-амилоида, которая содержится в экстрактах амилоидных бляшек (20-21).

Тем не менее, несмотря на многочисленные исследования в течение более чем 20 лет ни одна научная группа в мире не смогла найти такую изоформу бета-амилоида. Соответственно, к моменту создания настоящего изобретения ничего не было известно о точной идентификации индуцирующего патологию болезни Альцгеймера агента и, тем более, никому не удавалось создать экзогенно-индуцированную животную модель болезни Альцгеймера

В 2008 году авторами данного изобретения было показано, что изомеризация остатка аспарагиновой кислоты в положении 7 ведет к цинк-зависимой олигомеризации металл-связывающего домена бета-амилоида (22).

Так как амилоидные бляшки содержат до 75% изомеризованного таким образом бета-амилоида и избыток ионов цинка, то нами – первыми и единственными в мире – было предположено, что именно цинковые комплексы этой изоформы бета-амилоида могут являться молекулярным агентом, вызывающим олигомеризацию и последующую агрегацию растворимых форм бета-амилоида, то есть тех самых процессов, которые абсолютным большинством исследователей считаются пусковыми механизмами патогенеза болезни Альцгеймера. Важно отметить, что в работе М. Meyer-Luehmann et al (14) и во всех остальных известных работах нашего времени способность предлагаемого нами агента вызывать церебральный амилоидоз не была проверена. Таким образом, к моменту создания настоящего изобретения никто не был в состоянии обосновано указать, какая изоформа бета-амилоида является инициатором возникновения церебрального амилоидоза, что безусловно указывает на совершенную неочевидность настоящего изобретения.

Сущность изобретения.

Настоящее изобретение состоит в экзогенном инициировании церебрального амилоидоза у млекопитающих, которые экспрессируют эндогенный человеческий бета-амилоид в физиологически обусловленных или же искусственно завышенных количествах.

В качестве индуцирующего патологию болезни Альцгеймера агента в настоящем изобретении впервые в мире используются инъекции препаратов, содержащих в своем составе синтетические аналоги изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида (изоАсп7-бета-амилоида) и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7. Преимуществом таких экзогенно-индуцируемых моделей болезни Альцгеймера по сравнению с существующими в настоящее время конституциональными трансгенными моделями является возможность произвольного изменения скорости развития патологических процессов у подопытных животных в зависимости от целей конкретного исследования. Дополнительным преимуществом данного изобретения является возможность использования в качестве модели болезни Альцгеймера нетрасгенных животных, так как для специалистов в данной области совершенно очевидно, что если молекулярный агент вызывает церебральный амилоидоз у трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий бета-амилоид, то этот же агент, а именно – препараты, содержащие в своем составе синтетические аналоги изомеризованного по остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7, – будет с неизбежностью вызывать церебральный амилоидоз у всех остальных млекопитающих, у которых человеческий бета-амилоид присутствует конституционально.

Технический результат.

Технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в создании экзогенно-индуцируемой животной модели болезни Альцгеймера.

Никаких прототипов данного изобретения не существует нигде в мире, так как лишь в рамках настоящего изобретения впервые показана роль препаратов, содержащих в своем составе синтетические аналоги изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида и/или его фрагментов, включающих остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7, в качестве индуцирующих патологию болезни Альцгеймера экзогенно-вводимых агентов.

Пример осуществления изобретения.

Для создания экзогенно-индуцируемой модели болезни Альцгеймера нами была использована линия трансгенных мышей B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J (JAX® GEMM® B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J) без специфицированной патогенной микрофлоры. У мышей данной линии имеются следующие изменения в геноме (21):

– Человеческий ген, кодирующий мутированную форму («Шведский вариант», APPswe, K670N/M671L) Белка-предшественника бета-амилоида; эта форма вызывает наследственную болезнь Альцгеймера.

– Человеческий ген, кодирующий мутированную форму (А246Е) Пресенелина 1; эта форма также вызывает наследственную болезнь Альцгеймера.

Оба гена находятся под управлением промотера мышиного прионного белка. Трансгенный продукт был введен в оплодотворенные яйцеклетки мышей линии C57BL/6JXC3HeJF2, успешная линия была выделена и размножена путем обратного скрещивания с мышами линии C57BL/6J на протяжении 14 поколений.

Мыши B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J характеризуются нейропатологическими повреждениями, которые имеют близкое сходство с выявленными у пациентов с болезнью Альцгеймера (амилоидные бляшки, нейрофибриллярные клубки, гибель нейронов, психомоторные нарушения…) и являются коммерчески доступными.

На период экспериментов трансгенные мыши содержались в стерильных условиях (Пущино, филиал ИБОрХ РАН), Все работы с животными проводились с использованием индивидуальных средств защиты (технологическая одежда).

Весь использованный в экспериментах расходный материал (шприцы, ампулы, марля, вата), а также трупы павших и эвтаназированных животных подвергались специализированному накоплению и дальнейшей утилизации на станции огневого уничтожения отходов ФИБХ РАН.

Для накопления использованных игл применялся контейнер Шарпа.

При проведении эксперимента использовались стандартные условия содержания животных в соответствии с Программой по уходу и содержанию животных в ПЛЖ, рассмотренной и одобренной Институтской Комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных в июле 2009 года.

В качестве препаратов для инъекций использовались;

– «А»: раствор бета-амилоида в воде (концентрация = 100 мкМ)

– «В»: Раствор изоАсп7-бега-амилоида в воде (концентрация = 100 мкМ)

«Аβ42» (активный компонент препарата «А»): синтетический 42-членный пептид DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA.

Аминокислотная последовательность данного пептида соответствует бета-амилоиду человека (Beta-amyloid protein 42, или Аβ42), который является фрагментом 672-713 Амилоидного прекурсорного протеина (Amyloid beta A4 protein, UniProtKB/Swiss-Prot P05067, A4_HUMAN). Средняя молекулярная масса: 4514 г/моль.

«[isoD7]-Aβ42» (активный компонент препарата «В»): синтетический 42-членный пептид DAEFRH[isoD]SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA. Этот пептид является [isoD7]-аналогом вещества «Аβ42». Средняя молекулярная масса: 4514 г/моль.

Все используемые вещества и препараты относится к малоопасным химическим веществам (4-й класс опасности).

Учитывая, что средний объем крови у мыши равен 2 мл, а концентрация бета-амилоида в крови трансгенной альцгеймеровской мыши равна 200 нМ, то общее содержание циркулирующего бета-амилоида в этом животном составляет около 0.002·200·10-9=0.4 наномоль = 2000 нг (2 мкг).

В соответствие с целью исследований количество вводимого препарата должна быть по меньшей мере в 25 раз выше количества нативного бета-амилоида и, соответственно, должно составлять 25*2000 нг = 50000 нг (50 мкг).

Соответственно, концентрация изоформы бета-амилоида в 100 мкл вводимого раствора препарата может быть рассчитана из соотношения:

25·0.200 мкМ·2000 мкл = х мкМ·100 мкл,

и будет составлять 100 мкМ. При этом в 100 мкл вводимого препарата общее количество бета-амилоида составит 50 (пятьдесят) мкг, а в 200 мкл – 100 (сто) мкг.

Возраст животного к первой инъекции = 8-10 недель. Каждый препарат вводился раз в месяц внутривенно в ретроорбитальное венозное сплетение в объеме 200 мкл/гол, всего было проведено по 8 инъекций для каждого животного, последняя инъекция проводилась в возрасте 9 месяцев.

Внутривенная инъекция в ретроорбитальное венозное сплетение у мышей разрешена для проведения в отсутствие анестезии. Для проведения данной процедуры мышь захватывают за кожу шеи большим и указательным пальцами, другими пальцами надежно удерживают за кожу спины и прижимают к сетке для содержания.

Иглой шприца прокалывают конъюнктиву внутреннего угла глаза и проводят ее на глубину 1-2 мм за глазное яблоко, где находиться венозное сплетение. При правильном введении в иглу из ретроорбитального сплетения самотеком поступает кровь (при сомнении можно в шприце создать небольшое отрицательное давление).

Убедившись в правильности местонахождения, медленно вводится испытуемый препарат. После инъекции стерильной марлевой салфеткой слегка надавливается глазное яблоко с целью остановки кровотечения. Таким способом можно вводить препарат шприцем объемом 1 мл и иглой №27-29G½. Объем вводимого препарата 100-200 мкл/гол.

В течение всего эксперимента мыши содержатся индивидуально в клетках Тип-2 с идентификационными табличками, на которых указывается количество животных, название линии, пол, вид и дата манипуляции. Для облегчения боли и стресса при внутривенной инъекции в ретроорбитальное венозное сплетение будет использоваться анестезия.

Основные болевые ощущения и стресс связаны с фиксацией и внутривенной инъекцией. По окончании эксперимента в каждой группе эвтаназировались все животные и приготавливались препараты головного мозга.

Эвтаназия проводилась в соответствии с Российским национальным санитарным законодательством и Американским законодательством по защите животных углекислым газом согласно утвержденному в комиссии IACUC Протоколу-заявке на манипуляции с животными №09/01.

Морфологический анализ тканей мозга трансгенных животных проводился с помощью гистохимических методов, описанных ниже.

Покрытие предметных стекол желатиной с алюмохромовыми квасцами – 2 г желатина растворялось в 400 мл дистиллированной воды, с нагреванием раствора до 55°C при постоянном помешивании. После растворения добавлялось 0,2 г алюмохромовых квасцов и раствор хорошо перемешивался. Раствор нагревался до 60°C для покрытия предметных стекол. Стекла высушивались в течение суток перед использованием.

Фиксация мозга – Мозг мыши вынимается из черепной коробки и помещается в свежеприготовленный раствор 4% параформальдегида в фосфатном буфере (pH 7,4) на шесть суток с трех разовый сменой раствора через двое суток. На седьмые сутки, непосредственно перед изготовлением срезов, мозг помещается на шестеро суток в 30% раствор сахарозы с трехразовой сменой раствора через двое суток.

Изготовление срезов – Мозг мыши извлекается из раствора сахарозы, промакивается фильтровальной бумагой и покрывается средой для заморозки (например Tissue-Tek® ОСТ Compound, компании Thermo).

Далее мозг замораживался либо на элементе Пельтье, которым снабжен криотом фирмы Thermo, либо в жидком азоте. После заморозки мозг помещался в криотом и делались срезы толщиной в 30 микрон.

Срезы помещались на предметное стекло, покрытое желатином, и подвергались гистологическому окрашиванию.

Гистологические окрашивания

(1) Окрашивание гематоксилиом по Майеру: Срезы последовательно по 2 минуты дегидратируют в 100%, 96% и 70% спирте и помещаит на 2 минуты в воду. Затем препараты помещают на 30 мин в раствор гематоксилина, примывают водой и проявляют в ТАР воде до появления синего окрашивания.

(2) Окрашивание амилоидных бляшек спиртовым раствором Конго-красным; Срезы, предварительно дегидратированные в спиртовых растворах и окрашенные гематоксилином по Майеру, инкубируются в насыщенном 80% спиртовом растворе NaCl, содержащим 1% одного процентного NaOH, в течение 20 минут.

Затем Препарат помещается в раствор Конго-красного, содержащего 1% одного процентного NaOH, в течение 20 минут. Препараты два раза по 5 минут дегидратируют в 100% спирте, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Визуализация амилоидных бляшек розового цвета проводится в проходящем свете и подтверждается в поляризационном.

Для одновременного окрашивания амилоидных и клеточных структур был применен подход с окрашиванием клеток гематоксилином по Майеру и бляшек Конго-красным.

Число конгофильных амилоидных бляшек подсчитывалось вручную с помощью светового микроскопа в поляризованном свете.

Результаты сравнительного анализа показали (Таблица 1, Рисунок 1), что число бляшек у мышей, инъецированных препаратом синтетического аналога изомеризованного по аспратату-7 человеческого бета-амилоида значительно превышает число бляшек у контрольных животных, которым вкалывался препарат, содержащий интактный бета-амилоид, что однозначно свидетельствует о способности изомеризованного по аспратату-7 человеческого бета-амилоида вызывать церебральный амилоидоз у соответствующим образом обработанных животных.

Способ создания модели болезни Альцгеймера, заключающийся во введении в кровеносную систему трансгенным мышам линии B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J препарата, содержащего в своем составе синтетический аналог изомеризованного по аминокислотному остатку аспарагиновой кислоты в положении 7 человеческого бета-амилоида при аминокислотной последовательности DAEFRH[isoD]SGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA) и/или его фрагмент, включающий остаток изомеризованной аспарагиновой кислоты в положении 7 [isoD], в дозе 100 мкг, вводимой в объеме раствора 200 мкл/гол один раз в месяц.

Источник: https://findpatent.ru/patent/253/2532525.html

5. Трансгенные животные и моделирование заболеваний человека

Трансгенные мыши как модель наследственной болезни Альцгеймера

Оченьважным направлением использованиятрансгенных животных яв­ляетсясоздание моделей различных патологийчеловека.

Это, с одной сто­роны,позволяет подтвердить роль тех или иныхгенов в определенном забо­левании,а, с другой, создать модель, на которойможно более детально ис­следоватьмолекулярные механизмы нарушений иосуществлять целенапра­вленный подборлекарственных средств.

Использованиедля этих целей мышей важно с той точкизрения, что у них примерно такой жеразмер генома и такое же число генов,как у чело­века. В настоящее время спомощью трансгеноза осуществленомоделирова­ние множества различныхзаболеваний человека, таких, например,как рак груди, рак простаты, нейрофиброма,эритролейкемия. диабет и др.

Намодели трансгенных животных проведенымногочисленные исследо­вания повыяснению роли различных онкогенов взлокачественных переро­ждениях клетокмлекопитающих. Благодаря этим экспериментамустанов­лено, в частности, что отдельныеонкогены, перенесенные в мышей и крыс,могут определять появление у трансгенныхособей опухолей в тех тканях, где ониэкспрессируются.

Так, ген с-тусподконтролем регуляторных эле­ментовгена иммуноглобулина (гены иммуноглобулиновэкспрессируются тканеспецифично вВ-клетках) вызывал у трансгенных мышейлимфомы В- и пре-В-клеток, а этот жеонкоген под контролем LTRвируса MMTVобу­словливал возникновениеаденокарциномы в молочной железе самок,т.е. в том органе, где экспрессируютсягены вируса MMTV.

Сиспользованием трансгенных мышейпродемонстрировано онкогенное свойствомутантного гена р53.Вкооперации с онкогеном rasмутантный ген р53вызывалзлокачественное перерождение клеток.

У 20% трансген­ных животных возникалиаденокарциномы легких, остеосаркомы илимфо­мы.

Полученные данные позволилиприйти к заключению о том, что нор­мальныйген р53являетсяне онкогеном, а антионкогеном, продукткоторо­го инактивируется при наличиимутантного белка р53.

Другимпримером моделирования патологийчеловека может служить болезнь Альцгеймера(БА), которая является наиболеераспространенной причиной прогрессирующейдеменции в пожилом возрасте.

Былапоказана важная роль в этом мутаций втрех генах: АРР,пресенилинах1 и 2 (PSEN1и 2).

Первые попытки смоделировать БА умлекопитающих заключались в получениитрансгенных мышей, экспрессирующих генАРР,несущиймута­ции, приводящие к развитиюзаболевания у человека.

Такиемыши развивались нормально, но с возрастомнакапливали множест­венные отложениянерастворимого амилоида,а также в ряде случаев демон­стрировалиотклонения в поведении. Трансгенныемыши, несущие мутант-ный ген АРР,былииспользованы для разработки новогоподхода к терапии БА – Р-амилоиднойиммунизации.

Сообщалосьо переносе целой экзогенной митохонд­риальнойДНК (мтДНК) в эмбрионы мышей.

Цитопласты(энуклеированные клетки), несущие вмтДНК мутацию, связанную с энергетическиммета­болизмом, сливали с эмбриональнымистволовыми клетками (ЭСК) с инактивированнымимитохондриями. Затем эти ЭСК использовалидля получения химер.

В результатехимерные мыши и их потомки име­ли ряданомалий, сходных с клиническимипроявлениями болезни человека,обусловленной аналогичной мутацией вмтДНК (Хирано, 2001).

Эмбриональныестволовые клетки и таргетинг генов. Всевышеперечисленные системы получениятрансгенных животных имеют тот недостаток,что вводимая этими способами ДНКинтегрируется с реципиентным геномомслучайным образом, зачастую в видемножества ко­пий, часто наблюдаютсяперестройки трансгена, мутации в геномехозяина вплоть до летальных.

Вследствиеэтого нередко экс­прессия одного итого же трансгена может варьировать вшироких пределах у трангенных животныхдо полного ее отсутствия.

Однако впоследнее деся­тилетие техникавведения чужеродной ДНК в геном животныхусовершен­ствовалась так, что сталовозможным осуществлять направленноевведение ДНК в любую желаемую частьгенома или конкретного локуса.

Основойновой технологии послужило созданиеэмбриональныхстволо­вых клеток (ЭСК).В 1981 г. одновременно в двух лабораторияхбыли получены первые культуры клеток,выделенных из внутренней клеточноймассы бластоцистмыши (Evans,Kaufman,1981; Martin,1981).

Все ЭСК имеют нормаль­ный диплоидныйкариотип, обладают активностями щелочнойфосфатазы и теломеразы, экспрессируютряд других маркеров, характерных длянедиф­ференцированных клеток. Этосостояние поддерживается в определенныхусловиях культивирования, в частности,при наличии в культуре фидерного слояэмбриональных фибробластов и/или фактораингибирования лейкемии LIF.

При удалении последних ЭСК начинаютдифференцироваться в много­клеточныеагрегаты, состоящие из дифференцированныхи недифференци­рованных клеток,называемые эмбриоиднымителами.Несколько позднее были получены культурыэмбриональных герминативныхклеток (ЭГК), выделенные из первичныхполовых клеток мыши (Donovan,1994).

Затем были выделены линии кле­ток,подобные ЭСК, из эмбрионов кролика,хомячка, норки, свиньи, коровы, овцы,обезьян и, наконец, в последние годытакие линии выделены из бластоцист ипервичных половых клеток человека.

ЭСКи ЭГК сохраняют высокие плюрипотентныесвойства при длитель­ном культивированииinvitroи,будучи вновь введенными в эмбрион,способ­ны формировать химер, участвуяв развитии тканей всех трех зародышевыхлистков, включая образование гамет.Однако способность ЭСК к формированиюхимер и наследованию этих клеток у ихпотомков твердо установлена пока толькодля ЭСК мы­шей.

Уникальнаяспособность ЭСК сохранять длительноевремя invitroсвоиплюрипотентные свойства открыла широкиевозможности для различных манипуляцийс их генами. Были разработаны пути иметоды направленного введения чужероднойДНК в ЭСК путем гомологичнойрекомбинациис эк­зогенной ДНК.

При трансформацииЭСК invitroврезультате такой рекомбинации происходитвставка эндогенной ДНК в «ген-мишень».

Затем, после отбора ЭСК с модифицированнымгено­мом, их инъецируют в полостьбластоцисты другой линии мышей илиагрегируют с зародышами более раннихстадий развития, после чего их пересаживаютв матку приемной матери.

Среди потомковотбирают химер­ныхживотных, в результате скрещиваниякоторых получают гомозиготных мышей.Генотип гомозигот представленисключительно модифицированными ЭСК.Общая схема осуществления на­правленногоизменения генов у животных приведенана рис. 7.

Даннаятехнология позволяет получать направленныеизменения в лю­бом желаемом гене(технология «genetargeting»или «knockout»).

Совокуп­ность перечисленных вышеметодов можно определить как генетическуюмодификацию генома на уровне индивидуальныхгенов. Они позволили при­менять, покрайней мере, к мышам такие два основныхгенетических подхо­да как «отфенотипа к гену»и «отгена к фенотипу».

Это имело революцио­низирующеевоздействие как в фундаментальныхнаучных, так и во всевоз­можныхприкладных исследованиях.

Рисунок7 – Схемаполучения трансгенных мышей путемтаргетинга генов в ЭСК[3]

Впервую очередь технология таргетингавнесла существенный вклад в генетикумыши и анализ различных аспектов функциигенов in vivo.Вре­зультате использования таргетингагенов были созданы многочисленныетрансгенные мыши с различнымицеленаправленными изменениями генов,начиная от точечных мутаций и кончаяхромосомными перестройками.

Важнейшиммоментом в развитии методологиинаправленного изменения генов явилосьсоздание различных технологийсайт-специфическоговстраивания генов, с помощью которыхможно встраивать любой ген или участокДНК в любой заданный сайт хромосомы. Врезультате внедрения в практику этихтехнологий в настоящее время полученыпринципиально новые данные о функциитысяч различ­ных генов.

Такимобразом, генный нокаут, как и переносновых генов, митохондрий и целых хромосом,позволяет не только определять функциюгена, но и мо­делировать многиепатологии человека.

В настоящий моментэтот при­ем становится одним изключевых в молекулярной генетике.

Егочрезвы­чайная важность на данномэтапе исследований определяется массовымпереходом от исследований по структурнойгенетике к функциональной ге­нетике.

Трансгенози клонирование животных. Какизвестно, первая технология клонированиямлекопитающих была разработана Вилмутомв 1997 г. Сама техника клонирования былаоснована на переносе ядер соматическихклеток донора в цитоплазму энуклеированногоооцита реципиента.

Альтернативнымподходом к решению этой проблемы явиласьтрансформация чужеродными генами клетокфибробластовпло­довс последующей пересадкой их ядер вэнуклеированные ооциты овец и коров(1998), что привело к рождению транс­генныхпотомков. Вскоре появилось первоесообщение (МакКрет и др.

, 2000) оцеленаправленном введении в клеточнуюкультуру фибробластов плода овцывектора, созданного на ос-нове альфа-1-проколлагенового гена ов­цы,содержащего в своем составе ген aльфа-1-антитрипсина человека под промо­торомбета-лактоглобулина. Были отобраныклоны фибробластов, прошедшие гомологичнуюрекомбинацию и экспрессирующие альфа-1-антитрипсин челове­ка.

Ядра этихфибробластов пересадили в энуклеированныеооциты овец, а эмбрионы, развившиеся изних до стадии морулы или бластоцисты,были перенесены суррогатным матерямдля их дальнейшего развития. Из 16про­анализированных плодов иноворожденных 15 содержали в своем генометаргетированнуюаллель. 14 потомков развилось до рождения,и трое из них достигли годовалоговозраста.

У одной из самок был обнаруженв молоке aльфа-1-антитрипсин в количестве 650 мкг/мл.

Аналогичнымпутем были получены трансгенные свиньи,в которых был нокаутирован один аллельлокуса aльфа-1,3-галактозилтрансферазы, от­ветственнойза острую реакцию отторженияоргановпри ксенотрансплан­тации. Трансгенныеособи были получены с использованиемтехники кло­нирования, когда в качестведоноров ядер были использованынокаутиро­ванные по данной аллеликлетки фибробластов плода свиньи (Лейи др., 2002).

Такимобразом, за последние два – три десятилетиянаучные достижения в эм­бриологии,молекулярной биологии, генетике иструктурной геномике, поя­влениеновых методов и подходов в трансгеннойтехнологии модификации генома животныхсоздали основу для решения большогочисла общебиоло­гических, биомедицинскихи биотехнологических задач.

Если геннаяинже­нерия послужила основой дляразвития структурной геномики, тотрансгеноз стал основной технологией,способствующей прогрессу в функциональ­нойгеномике.

Без всякого сомнения, вближайшие годы широкое примене­ниеи дальнейшее развитие получат такиенаправления, как классический трансгеноз,направленный таргетинг генов вопределенных типах клеток и/или наопределенных стадиях развития организмов.

Технологияполучения трансгенных животных сзаданными хозяйст­венно ценнымипризнаками будет в дальнейшем одним изперспективных направлений современнойбиотехнологии. Она позволит создаватьразно­образные организмы, обладающиесвойствами, не имеющими аналогов вприроде.

Трансгенные животные помогутрешению ряда проблем, с ко­торымичеловечество сталкивается на всемпротяжении своей истории. Это, преждевсего проблема создания лекарственныхпрепаратов и их по­лучения в достаточномколичестве, а также потенциально -продовольст­венная проблема.

Сочетаниеже клонирования с трансгенозом можетстать очень эффе­ктивным путем какдля дальнейшего развития функциональнойгеномики, так и для решения различныхприкладных задач. В перспективе этиподхо­ды, наряду с генной терапией,могут быть весьма полезными для клеточнойи органной терапии человека.

Источник: https://studfile.net/preview/6266270/page:13/

Трансгенные мыши как модель наследственной болезни Альцгеймера

Трансгенные мыши как модель наследственной болезни Альцгеймера

С того момента как было обнаружено, что мутации в генах APP и PSEN1 являются причиной БА, не прекращались попытки создания трансгенных моделей данного заболевания.

Увеличение экспрессии мышиного APP никогда не приводило к образованию амилоидных бляшек и развитию патологий в мозге трансгенных мышей.

Это объясняется различной аминокислотной последовательностью человеческого и мышиного АРР, отличающейся на 17 аминокислот, 3 из которых локализованы в последовательности Ар. Для развития патологии у мышей необходима экспрессия мутантного человеческого APP (hAPP).

В различных моделях экспрессия мутантного hAPP приводила к образованию амилоидных бляшек, потере синапсов и смерти нейронов и как следствие -нарушению когнитивных способностей. Однако все эти эффекты имели слабовыраженный характер.

Это обстоятельство привело к выводу, что данная модель не может отражать полный фенотип патологии БА, но может быть использована для изучения патологического влияния Aβ на нейроны.

Мыши с экспрессией мутантных PS1 под контролем специфичного для нейронов промотора Thy-1 имели признаки нейродегенеративных процессов в мозге -потерю синапсов и гибель нейронов в области гиппокампа и неокортекса.

Увеличение уровня экспрессии PS1 не могло послужить причиной данных изменений, т.к. они не были обнаружены у трансгенных мышей со вставкой дополнительного гена PS1.

В мозге мышей с экспрессией мутантных PS1 не было выявлено образования амилоидных бляшек, тем не менее, уровень Аβ42 был значительно повышен по сравнению с Ар40. В случае мутаций PS1 I213T, А246Е и PS1 ДЕ9 было показано образование гиперфосфориллированного белка тау.

В мозге трансгенных мышей с мутациями PSl L286V, M146V, M146L и А246Е был обнаружен ряд патологических изменений, включающих потерю синапсов и массовую гибель нейронов в гиппокампе и неокортексе, усиливающихся с возрастом.

С целью дополнить фенотип модели на основе трансгенных лабораторных животных при создании линий дважды трансгенных мышей APP/PS1 ряд мутаций в гене белка PS1 был скомбинирован с мутантным геном APP (АРРКМ670/671NL). В мозге APP/PS1-мышей была отмечена потеря нейронов в области гиппокампа и неокортекса, соответствующая фенотипу БА.

У таких мышей были обнаружены гистологические признаки БА, включающие образование амилоидных бляшек и наличие гиперфосфорилированного белка тау.

При этом у дважды трансгенных мышей APP/PS1 уровень амилоидных образований был значительно повышен по сравнению с трансгенными мышами со вставкой одного гена APP Для дважды трансгенных мышей также были показаны изменения в поведении, связанные с запоминанием и обучением.

У трансгенных моделей животных со вставкой мутантных APP и PS1 раздельно или вместе, тем не менее, не было показано образование нейрофибриллярных узелков из гиперфосфорилированного тау.

Мутации в гене белка тау связаны с наследуемой формой лобно-височной деменции, характеризующейся образованием нейрофибриллярных узелков и массовой гибелью нейронов в лобных и височных долях головного мозга. Мутант тау P301L был использован для создания трижды трансгенных мышей 3XTG в качестве модели БА.

Мыши 3XTG со вставкой генов APPKM670/671NL, PSl M146V и тау P301L демонстрируют более полный фенотип БА. Также как у пациентов с БА, в мозге 3ХТG-мышсй происходит образование амилоидных бляшек и нейрофибриллярных узелков, сопровождающееся гибелью нейронов гиппокампа и неокортекса.

В гиппокампе 3ХТG-мышей было показано понижение уровня синаптической передачи и долгосрочной потенциации, развивающееся к шести месяцам жизни. В нейронах гиппокампа этих мышей было обнаружено нарушение кальциевого гомеостаза: повышение содержания кальция в просвете ЭР, повышение уровня экспрессии RyR и подавление депо-управляемого входа кальция.

У ЗХТ G-мышей были обнаружены нарушения памяти и обучения, развивающиеся с возрастом. Поведение этих мышей в возрасте 6 месяцев отличается от поведения контрольных животных.

При выполнении различных заданий 3ХТG-мыши демонстрируют высокий уровень беспокойства, повышение уровня реакций замирания, снижение показателей исследовательского поведения, понижение сенсомоторных реакций, локомоторной активности и снижение способности повторного узнавания объекта. Эти изменения соответствуют нарушению работы гиппокампа и миндалевидного тела, а также соотносятся с нейропсихиатрическими симптомами БА у человека. Таким образом, на данный момент наиболее удачной моделью БА являются трансгенные мыши 3XTG, демонстрирующие наибольшее совпадение с фенотипом данного заболевания.

Источник: http://ladycaramelka.ru/nejrodegenerativnye-zabolevaniya/transgennye-myshi-kak-model-nasledstvennoj-bolezni-alcgejmera

Оптогенетика помогла улучшить память мышам с болезнью Альцгеймера • Новости науки

Трансгенные мыши как модель наследственной болезни Альцгеймера

У трансгенных мышей, страдающих аналогом человеческой болезни Альцгеймера, на ранних стадиях болезни сохраняется кратковременная память, но нарушается долговременная.

Оптогенетические эксперименты показали, что приобретенное знание, которое мышь в обычной ситуации быстро забывает, можно надолго записать в мышиную память путем искусственной стимуляции нейронов энторинальной коры, которые участвовали в первичном запоминании.

Эти нейроны посылают сигналы в зубчатую извилину гиппокампа, нейроны которой в ответ отращивают дополнительные дендритные шипики, что и приводит к формированию долговременной памяти. Полученные результаты проливают дополнительный свет на механизмы памяти и намечают путь к разработке методов коррекции ранних симптомов болезни Альцгеймера.

Поздние стадии болезни Альцгеймера характеризуются видимыми изменениями нейронов мозга, а именно образованием внеклеточных амилоидных бляшек и внутриклеточных скоплений тау-белка. Это ведет к серьезному нарушению когнитивных функций.

Однако уже на ранних стадиях, пока накопление аномально свернутых белков еще не началось, у больных нередко наблюдаются нарушения долговременной эпизодической памяти (см. Episodic_memory). Предполагают, что это может быть связано с недостаточно активным образованием новых синаптических контактов и дендритных шипиков в гиппокампе и энторинальной коре.

При этом не ясно, связано ли нарушение долговременной памяти с тем, что больной перестает запоминать новый опыт, или с тем, что он теряет способность извлекать из памяти хранящуюся там информацию.

Болезнь Альцгеймера, приносящая колоссальный ущерб и отдельным людям, и обществу в целом, остается практически неизлечимой.

Для ее изучения широко используются «мышиные модели», то есть специально выведенные трансгенные мыши, демонстрирующие сходные с болезнью Альцгеймера комплексы нейрологических и когнитивных симптомов (см.: Elder et al., 2010. Transgenic Mouse Models of Alzheimer’s Disease).

Нейробиологи из Массачусетского технологического института (Massachusetts Institute of Technology) в серии экспериментов на таких мышах сумели показать, что потеря долговременной памяти на ранних стадиях болезни в принципе поддается коррекции, по крайней мере у мышей. Правда, требующиеся для этого процедуры невероятно сложны, а до медицинского применения подобных методов пока еще далеко, как до неба, но это всё же лучше, чем ничего, учитывая общую унылую ситуацию с поисками лекарства от болезни Альцгеймера.

В своей работе авторы использовали новейшие достижения оптогенетики (см.: Павел Елизарьев. Оптогенетика: самые светлые мысли).

В основе применявшихся методов лежит то обстоятельство, что в нейронах, активно работающих в ходе обучения и участвующих в запоминании нового опыта (а это, как правило, одни и те же нейроны), активируются определенные гены, в том числе ген c-Fos. Это дает возможность пометить нейроны, запомнившие какую-то информацию.

Для этого нужно, например, ввести в интересующую нас область мозга искусственные вирусы, содержащие ген флуоресцирующего белка, а также регуляторную генетическую конструкцию, которая активирует этот ген только в тех нейронах, где активен c-Fos.

В результате можно увидеть «энграмму» (Engram) — нейронную сеть, в структуре которой записано одно конкретное воспоминание.

Чтобы пометить не всё, что животное запомнило за свою жизнь, а только одно воспоминание, в геномы искусственных вирусов добавляют еще один регулятор, которым можно управлять путем добавления (или недобавления) в пищу какого-то вещества (например, доксициклина). Подопытную мышь всё время держат на диете, содержащей доксициклин, но сразу после обучения какому-то навыку ненадолго перестают добавлять доксициклин в пищу. В результате помеченными оказываются только те нейроны, которые запомнили новое знание.

Можно пойти еще дальше и вместо флуоресцирующего белка (или вместе с ним) использовать канальный родопсин (см. Channelrhodopsin).

В результате нейроны энграммы будут возбуждаться при освещении (для этого в голову животного вставляют световод). Такая процедура позволяет в любой момент активировать воспоминание.

Например, если животное обучено бояться чего-нибудь, освещение нейронов энграммы будет вызывать реакцию испуга.

С помощью этих методов авторы пометили у подопытных мышей в зубчатой извилине гиппокампа (участке, важном для формирования эпизодической памяти; см. также Dentate gyrus) нейроны, участвующие в запоминании неприятного опыта.

Опыт состоял в том, что мышь получала удары током, когда ее помещали в особый контейнер (рис. 1). Использовалась линия «мышей с болезнью Альцгеймера», у которых на 7-м месяце жизни еще нет амилоидных бляшек, но долговременная память уже нарушена.

Это соответствует ранним стадиям болезни. Кратковременная память у таких мышей еще работает: они помнят неприятный опыт (то есть замирают при помещении в ящик, где их било током) в течение нескольких часов после «обучения», но уже через сутки всё забывают.

Кратковременная память у этих мышей перестает работать в девятимесячном возрасте, тогда же появляются и амилоидные бляшки.

Оказалось, что если семимесячной обученной, но всё забывшей мыши активировать при помощи света нейроны энграммы, расположенные в зубчатой извилине, то «утраченное» воспоминание активируется и мышь замирает в испуге. Эта реакция не зависит от того, где находится мышь в данный момент: в ящике, где ее било током, или в другой, безопасной обстановке.

Авторы делают вывод, что память о приобретенном опыте на самом деле сохраняется, но только больная мышь не может сама ее извлечь, когда нужно. Иными словами, нарушение долговременной эпизодической памяти на ранней стадии болезни Альцгеймера связано не с тем, что информация не записывается в память, а с тем, что повреждается механизм извлечения информации из памяти.

Хотя, пожалуй, с этим выводом можно поспорить. Ведь авторы сами дополнительно пометили нейроны энграммы канальным родопсином и использовали именно эту искусственную метку для активации воспоминания. Может быть, искусственная метка — это и есть вся информация, которая осталась в мозге от утраченной памяти?

Так или иначе, даже многократная оптическая стимуляция нейронов энграммы, расположенных в зубчатой извилине, не приводит к полноценному восстановлению памяти. Дело в том, что после такой стимуляции мышь всё равно не помнит, что нужно бояться ящика.

Если поместить ее в ящик, но не стимулировать при этом энграмму светом, то мышь не показывает страха. Можно ли что-то с этим поделать? Как выяснилось, да.

Но для этого нужно стимулировать нейроны энграммы, расположенные не в зубчатой извилине, а в других, «вышестоящих» отделах мозга, из которых зубчатая извилина получает входные сигналы.

Таким вышестоящим отделом, играющим, наряду с зубчатой извилиной, важнейшую роль в формировании эпизодической памяти, является соседний с гиппокампом участок мозга — энторинальная кора. Аксоны нейронов энторинальной коры идут в зубчатую извилину; эта важная связь носит название «перфорантного пути» (Perforant path).

При помощи еще одного набора искусственных вирусов («вирусного коктейля», как его называют авторы) удалось пометить нейроны энграммы, расположенные в энторинальной коре. Это позволило разглядеть ключевые точки перфорантного пути — контакты аксонов клеток энторинальной коры с дендритами нейронов зубчатой извилины.

Для образования синаптических контактов с аксонами и приема сигналов дендриты отращивают специальные отростки — дендритные шипики. Образование новых дендритных шипиков играет центральную роль в формировании долговременной памяти (см.: Формирование воспоминаний теперь можно увидеть под микроскопом, «Элементы», 01.12.

2009).

Как и ожидали исследователи, число дендритных шипиков, образующихся в результате обучения у нейронов энграммы, расположенных в зубчатой извилине, оказалось связано с работой долговременной памяти. У здоровых мышей в результате обучения здесь формируется намного больше шипиков, чем у больных болезнью Альцгеймера.

Дальнейшие опыты показали, что многократная интенсивная оптическая стимуляция «вышестоящих» (расположенных в энторинальной коре) нейронов энграммы приводит, во-первых, к увеличению числа дендритных шипиков, во-вторых — и это главный результат работы — к формированию полноценной долговременной памяти.

Если мышь с болезнью Альцгеймера сначала научить бояться ящика с током, а потом в другой, спокойной обстановке долго стимулировать светом нейроны энторинальной коры, активно работавшие в ходе обучения, то после этой процедуры мышь надолго (как минимум на шесть дней) запоминает, что ящик опасен.

Фактически таким способом удается свести на нет вызванное болезнью ухудшение долговременной памяти. Правда, только в отношении одного, специально помеченного воспоминания.

Аналогичные результаты получились и при использовании двух других видов обучения.

В одном эксперименте мыши учились не заходить в одну из двух половин помещения, где их било током, в другом — запоминали пространственное расположение объектов (в этом случае работу памяти можно оценить по тому, различается ли исследовательское поведение мыши в ящике с привычным и новым расположением предметов). В обоих случаях длительная оптическая активация нейронов энграммы, расположенных в энторинальной коре, приводила к тому, что мышь с болезнью Альцгеймера запоминала приобретенный опыт не хуже здоровой.

Когда исследователи попробовали вместо избирательной стимуляции нейронов энграммы воздействовать одновременно на большую случайную выборку нейронов энторинальной коры, посылающих аксоны в зубчатую извилину, то это не помогло мышам что-либо запомнить.

По мнению авторов, это может быть связано с тем, что отдельные нейроны энторинальной коры и зубчатой извилины участвуют одновременно во множестве воспоминаний-энграмм, которые невозможно закрепить все одновременно.

Так или иначе, этот результат показывает, что глубокая стимуляция мозга (Deep brain stimulation) вряд ли сможет улучшить память людям с болезнью Альцгеймера.

Ведь такая стимуляция безвыборочно действует на большие популяции нейронов, а для закрепления воспоминания нужно очень аккуратно воздействовать только на нейроны энграммы. Как этого добиться, пока непонятно. Даже у мышей это пока возможно только при помощи впрыснутых в мозг вирусов и вживленных световодов и только для одного избранного воспоминания.

Источник: Dheeraj S. Roy, Autumn Arons, Teryn I. Mitchell, Michele Pignatelli, Tomás J. Ryan & Susumu Tonegawa. Memory retrieval by activating engram cells in mouse models of early Alzheimer’s disease // Nature. Published online 16 March 2016.

См. также об оптогенетике:
1) Павел Елизарьев. Оптогенетика: самые светлые мысли.
2) За знакомство, секс и драку отвечают одни и те же нейроны, «Элементы», 02.06.2014.

Александр Марков

Источник: https://elementy.ru/novosti_nauki/432716/Optogenetika_pomogla_uluchshit_pamyat_mysham_s_boleznyu_Altsgeymera

Болезнь Альцгеймера: попробуем на крысах

Трансгенные мыши как модель наследственной болезни Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера: попробуем на крысах

Как грызуны помогают найти лекарство от старческой деменции

17.04.2017 13:15

Фотографии Ильнара Салахиева

Болезнь Альцгеймера не претендует на звание чумы XXI века, тем не менее в мире насчитывается более двадцати пяти миллионов больных. А к середине столетия их число может увеличиться вчетверо.

Старший научный сотрудник сектора молекулярных механизмов старения Института цитологии и генетики СО РАН Наталья Стефанова рассказала корреспонденту Сиб.

фм о гипотезах развития болезни Альцгеймера, сложностях постановки диагноза, особенностях выведенной модели крыс OXYS, комплексе признаков старческих заболеваний у них и перспективах исследований в этой области.

Несмотря на огромное количество новостей о болезни Альцгеймера, в том числе около- или псевдонаучных, в России ей пока уделяют недостаточное внимание. А количество больных увеличивается с каждым годом. Пока механизмы заболевания до конца не изучены, гипотез появляется много — но это в научных кругах. Если с болезнью сталкиваются родственники, то возникают этические сложности.

Примеров вокруг, оказывается, достаточно, но не все готовы об этом говорить. Что вполне понятно.

Исследования, которые ведутся для поиска причины развития болезни, разработки эффективных методов диагностики на ранних стадиях и лечения, дорогостоящи и трудоёмки.

Больше возможностей имеют зарубежные учёные.

Но и в Новосибирске есть небольшая группа учёных, которая изучает механизмы развития болезни Альцгеймера на крысах и получает впечатляющие результаты, наравне с коллегами из других стран.

Коллектив сектора молекулярных механизмов старения Института цитологии и генетики СО РАН любит своё дело и своих уникальных крыс.

Это видно по тому, как они ласково называют их «крысиками». Именно «крысики» помогают людям в поисках причин развития болезни Альцгеймера.

О работе сектора рассказала Наталья Стефанова. Её докторская диссертация как раз была посвящена характеристике крыс OXYS как модели болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера в ряду деменций

Деменция — приобретённое слабоумие: снижение познавательной деятельности, утрата усвоенных знаний и затруднение или невозможность приобретения новых

Болезнь Альцгеймера по сути можно назвать одним из видов старческой деменции. Именно из-за этого сейчас, как и в начале XX века, когда болезнь только установили, иногда возникают сложности с постановкой диагноза?

Да.

Немецкий психиатр и невропатолог Алоис Альцгеймер в 1907 году выступил со знаменитой лекцией о том, что у одной из его пациенток развивалась странная форма деменции, которая сопровождалась не только потерей памяти, но и дезориентацией, галлюцинациями, агрессией и в конечном счёте привела к смерти. Постмортальное исследование её мозга показало наличие «особенной субстанции» в виде бляшек и нейрофибриллярных клубков.

Позже по фамилии этого психиатра назвали заболевание, которое развивалось у людей рано — до 65 лет, чаще до 40–50 лет; случаи заболеваемости этой формы деменции были крайне редки.

Если люди были старше этого возраста, то говорили просто о старческой деменции.

Только в 1976 году из-за сходности клинических и нейропатологических проявлений было предложено объединить эти две формы заболевания в одно и назвать болезнью Альцгеймера, несмотря на возраст больных.

Но всё равно и сейчас из-за сложности диагностирования болезни такой диагноз ставят в редких случаях, наиболее распространено понятие старческой деменции.

Принципиально важно, что в отличие от многих других нейродегенеративных заболеваний, проблемы раннего диагностирования болезни Альцгеймера обусловлены прежде всего сходством проявлений снижения памяти у людей при нормальном старении и при наличии заболевания.

Так, незначительные нарушения памяти на недавние события, трудности в запоминании новой информации — это ранние симптоматические проявления болезни Альцгеймера.

Прогрессирующее ухудшение памяти, интеллекта в течение последующих лет, протекающие на фоне атрофии мозга, приводят к полному распаду личности и фатальному исходу, как правило, от различного рода осложнений, например, лёгочной пневмонии.

https://www.youtube.com/watch?v=7-cMmKTXCdk

Количество людей с болезнью Альцгеймера с каждым годом растёт, но, к сожалению, пока наука немного отстаёт. Причины заболевания всё ещё не известны, верно?

Да, это самое распространённое нейродегенеративное заболевание в мире.

Эффективных способов профилактики и лечения болезни Альцгеймера нет, заболеваемость растёт по мере увеличения продолжительности жизни и старения населения развитых и развивающихся стран.

К концу первой декады этого века, по данным ВОЗ, болезнью Альцгеймера в мире болели более 35 миллионов человек, в 2015 году — уже 51 миллион.

И, по прогнозам, к 2050 году количество таких больных удвоится.

66 лет прожил писатель Терри Пратчетт. В 2007 году ему диагностировали редкую форму болезни Альцгеймера — заднюю кортикальную атрофию, от которой он впоследствии и скончался

Механизмы болезни стали исследовать не так давно — в начале 90-х годов, когда были выявлены мутации сначала в одном гене, потом ещё в двух.

Различают две формы заболевания — наследственную и спорадическую. На сегодня известно, что мутации в трёх генах становятся причиной развития наследственной формы.

95 % случаев в мире — это спорадическая форма, а моделей, которые бы позволяли её изучать, нет.

Принципиальным фактором риска в таком случае становится пожилой возраст, но причины появления спорадической формы остаются не известны.

Известно, за что отвечают три гена, мутации в которых являются причиной появления наследственной формы болезни?

О накоплении «особенной субстанции» в виде бляшек в мозге, в частности на стенках мозговых сосудов, людей с деменцией было известно с конца 20-х годов XX века, однако вплоть до 80-х неизвестному пептиду отводили лишь роль вторичного продукта при нарушениях функций иммуноглобулинов.

Только в 1984 году было обнаружено, что основными в составе «особенной субстанции» становятся маленькие пептиды.

Учёные предположили, что пептид, названный бета-амилоидом, является продуктом большого белка предшественника, который вскоре был идентифицирован (amyloid precursor protein, АРР).

Было обнаружено, что уровень и молекулярный состав бета-амилоида в мозге людей с болезнью Альцгеймера и когнитивно здоровых людей различен. На основании этого было выдвинуто предположение, что изменение содержания бета-амилоида в мозге может быть ассоциировано с болезнью Альцгеймера.

Прорывом в понимании этиологии заболевания явилось использование генетических подходов. В 1991 году было обнаружено, что раннее наследственное развитие болезни Альцгеймера у пациентов из шести семей характеризуется наличием мутации гена на хромосоме 21.

Было выявлено, что этот ген кодирует белок АРР, маленькие белки которого (бета-амилоид) составляют основу сенильных бляшек.

Пресенилины — семейство белков, составляющих часть протеазного комплекса γ-секретазы. В геноме позвоночных содержатся два гена, кодирующих пресенилины. Оба гена эволюционно консервативны — отмечены лишь небольшие отличия между пресенилинами крысы и человека

Не менее значительным событием в начале 90-х годов стало обнаружение также у больных с ранним началом наследственной формы заболевания — мутаций в генах, получивших название генов-пресенилинов, PSENs, которые становятся причиной увеличения продукции бета-амилоида и развития болезни.

Физиологические функции белка АРР до сих пор остаются недостаточно изученными, однако считается, что он необходим для нормального развития нервной системы млекопитающих, выживания и восстановления нейронов после повреждений.

Функции белков пресенилинов в норме и в результате мутаций кодирующих их генов остаются мало изученными.

Мутации в генах изучали на мышах и крысах?

На основании выявленных генетических факторов развития болезни Альцгеймера для раскрытия молекулярно-генетических механизмов заболевания в течение 90-х годов начали интенсивно создаваться линии трансгенных мышей — моделей наследственной формы заболевания с мутациями в трёх генах. У этих животных развивались амилоидные бляшки в мозге, нарастающие с возрастом нарушения поведения и снижение популяции нейронов в гиппокампе. На крысах такие исследования практически не проводились.

Моделей спорадической формы болезни Альцгеймера практически нет, а наша линия крыс именно такая. Это очень важно.

Зачем крысам диета с галактозой

Как была создана линия крыс, с которой вы работаете?

Линию крыс OXYS создали в нашем Институте цитологии и генетики СО РАН. Её история берёт начало в 70-е годы ХХ века, когда у крыс с нормальным темпом старения моделировали наследственную галактоземию. Для этого в пяти первых поколениях развитие катаракты вызывали обогащённой галактозой диетой.

В дальнейшем уже без нагрузки галактозой, сыгравшей, по-видимому, роль мутагена, у крыс, помимо катаракты, спонтанно развивались кардиомиопатия, сколиоз, эмфиземы, предраковые состояния и некоторые биохимические признаки галактоземии.

Но анализ развития этих признаков был выполнен в основном на фоне нагрузки галактозой в ближайших либо последующих поколениях животных.

Интерес к линии возрос в 90-х, в том числе благодаря тому, что руководителем нашей группы стала Наталия Гориславовна Колосова, и уже под её началом были выявлены нарастающие с возрастом дисфункции митохондрий, которые рассматриваются как одна из наиболее вероятных причин преждевременного старения крыс OXYS. В то же время оказалось, что не все заявленные ранее свойства у крыс OXYS проявляются.

В первый раз крысы-альбиносы попали в лаборатории и были использованы в 1828 году в экспериментах по изучению голодания. Следующие 30 лет крысы участвовали в нескольких других экспериментах и в итоге стали первыми животными, одомашненными исключительно для исследовательских целей

Так, не было обнаружено признаков галактоземии, достаточно поздно развивалась катаракта.

Для стабилизации фенотипических признаков нами в 58-м—63-м поколениях крыс OXYS было проведено усиление отбора по признаку ранней спонтанной катаракты, что привело к её развитию уже в молодом возрасте.

Результатом усиления отбора явилось устойчивое спонтанное проявление комплекса признаков преждевременного старения в последующих поколениях. Сегодня мы имеем 112-е поколение крыс OXYS.

Крысы с комплексом старческих заболеваний

То есть отбор этой линии ведётся только по катаракте, а вообще у этих крыс развивается целый комплекс старческих заболеваний?

Да, у этих крыс развивается целый комплекс старческих заболеваний: например, помимо катаракты, развиваются ретинопатия, аналогичная возрастной макулярной дегенерации у людей, остеопороз, артериальная гипертензия, ускоренное старение мозга с развитием ключевых признаков болезни Альцгеймера — одно из них. Ещё раз подчеркну: именно спорадическая форма, по которой мы получаем ряд крайне интересных результатов на наших крысах.

Самое интересное: сегодня результаты исследований в мире находят всё больше и больше подтверждений тому, что механизмы наследственной и спорадической форм болезни Альцгеймера развиваются по-разному.

Если для наследственной формы инициирующими факторами становятся именно мутации в трёх названных генах, которые приводят к чрезмерной продукции токсических форм бета-амилоида, то у спорадической формы, скорее всего, — нарушение межнейронных взаимоотношений, передача токсических белков от нейрона к нейрону, то есть такое распространение патологии.

Алоис Альцгеймер — немецкий психиатр и невролог, автор множества статей по таким проблемам, как алкогольный психоз, шизофрения, эпилепсия, сифилис мозга, хорея Хантингтона, артериосклеротическая атрофия мозга, пресенильный психоз

Круговорот гипотез

В потоке гипотез, публикаций и новостей, связанных с болезнью Альцгеймера, сложно не заблудиться. Это происходит из-за того, что область остаётся до конца не исследованной. Вы постоянно следите за зарубежными исследованиями?

Конечно. Гипотез развития заболевания достаточно много. Зачастую встречаются нетривиальные, неординарные. Я, помню, была на зарубежной конференции в Чехии в 2014 году, на которой выступал докладчик, говоривший не в ключе общего мышления, видения этого заболевания и его развития.

Это связано с постепенно прогрессирующим с возрастом снижением функций иммунной системы центральной нервной системы.

Он говорил о том, что нейродегенеративные изменения при болезни Альцгеймера являются результатом потери нейропротекторных свойств микроглии — ключевого клеточного элемента иммунной системы мозга.

После моего возвращения мы начали исследовать этот вопрос. Сделали первые наработки: действительно, так оно и есть.

Спящее заболевание

Ваши исследования механизмов болезни Альцгеймера на крысах полезны в первую очередь для какого этапа: диагностики, лечения или предотвращения?

На всех этапах. Конечно же, главная цель — выявление предикторов. Нужно разобраться, что предшествует заболеванию. Болезнь Альцгеймера по сути — спящее заболевание.

Некоторые исследователи говорят, что оно появляется раньше — за 10 или даже 20 лет до симптоматики.

Кроме того, очень важно диагностирование на самых ранних сроках развития заболевания и способы замедлить или остановить его с помощью эффективной терапии, когда болезнь уже прогрессирует.

Какой предиктор наиболее вероятен, на ваш взгляд?

Линия крыс OXYS отличается преждевременным старением. Для них характерны ускоренная инволюция тимуса, сниженная реактивность клеточного звена иммунной системы, повышенное артериальное давление, раннее развитие остеопороза и изменения в когнитивной и эмоциональной сферах

До того, как мы стали прицельно изучать ускоренное старение мозга на наших крысах, уже было известно, что одним из наиболее ранних событий в развитии их преждевременного старения становится дисфункция митохондрий, которая была обнаружена в сетчатке, мышцах, миокарде.

Теперь мы уже знаем, что, конечно же, и в мозге.

Cейчас всё больше и больше появляется работ, убедительно доказывающих, что дисфункция митохондрий может становиться одним из ключевых факторов риска развития болезни Альцгеймера, а также ряда других нейродегенеративных заболеваний, что очень важно.

С чем может быть связана дисфункция митохондрий — какие есть версии?

Не знаю. Я могу только предполагать. Когда мы приступили к исследованиям, связанным с болезнью Альцгеймера, работали на взрослых и старых крысах, поскольку главный фактор риска развития этого заболевания — пожилой возраст. В ходе наших исследований было обнаружено, что симптоматическому периоду проявлений признаков болезни Альцгеймера у крыс OXYS предшествуют изменения функций митохондрий.

Поэтому сейчас мы начинаем работать, в том числе, с ранним периодом.

И, кстати, в мире это направление набирает обороты.

Очень многие заболевания связывают с различными неблагоприятными факторами, которые происходили в раннем возрасте, в том числе перенесённые инфекции.

О перспективных препаратах

Среди тестируемых вами препаратов есть важные при болезни Альцгеймера?

— На самом деле эффективных препаратов от Альцгеймера собственно и нет.

Но в то же время последние несколько лет мы изучаем мелатонин — препарат «Мелаксен». По мелатонину у нас интересные результаты получаются: действительно работает. Замедляет развитие и прогрессию признаков болезни, в том числе и за счёт восстановления функций митохондрий.

Мелатонин не только при Альцгеймере хорошо себя показал, а также при ретинопатии, возрастной макулярной дегенерации. Большая часть этих данных нами опубликована. Сейчас готовится к публикации ещё ряд интересных результатов.

В исследованиях по катаракте и ретинопатии вы сотрудничаете с офтальмологом, а по болезни Альцгеймера предполагается взаимодействие с кем-то?

Мне бы хотелось, конечно. Особенно хотелось бы иметь доступ к исследованиям на человеческих образцах мозга. К сожалению, в России это слабо развито — во всяком случае, в Сибири. Даже по этическим соображениям: родственники не дают согласия, чтобы образцы мозга умерших с болезнью Альцгеймера использовали в исследованиях.

Плюс ко всему — сложность с диагностированием. До сих пор ставят диагноз «старческая деменция», а 100-процентный диагноз «болезнь Альцгеймера» могут поставить только постмортально — по наличию патоморфологических признаков, если такие исследования будут проводиться.

За рубежом финансирование по нейродегенеративным заболеваниям, особенно по Альцгеймеру, очень мощное, поэтому там активно работают с человеческими образцами. Забор образцов происходит максимально быстро. Всё оперативно, налажено.

Я надеюсь, что и у нас появится возможность проводить клинико-экспериментальные исследования.

Любимцы из вивария

Пока у этой группы учёных нет таких возможностей, как у зарубежных коллег, но с ограниченными ресурсами они получают ценные результаты. Учёные делают всё возможное, чтобы понять механизмы развития болезни Альцгеймера и предотвратить её. После интервью Наталья показала нам виварий, в котором содержатся лабораторные крысы.

30 линий мышей, восемь линий крыс и одну линию хомяков использует ИЦиГ СО РАН для лабораторных исследований

В виварии нас встречает бригадир Галина Петрова, которая ухаживает за животными и кормит их.

Самое главное — крыс сфотографировать. Меня не надо, я не фотогеничная, — сразу предупреждает Галина и выбирает модель для нас, рассказывая о крысах с особым трепетом. — Когда глаза закапываем, они ведут себя очень спокойно, уже знают, чего хотим. Крысы очень умные.

Крысы OXYS — небольшие по размеру, — держа в руке одного представителя, говорит Наталья. — Маленькие, деликатные, красивые. Жёлтые метки на шерсти у каждого индивидуальные — это их фамилия, имя и отчество. Чтобы знать и отслеживать, что и как с ними происходило в ходе эксперимента.

Ну что вы одного фотографируете? Давай большого, Наташа, покажем? — спрашивает Галина и достаёт нам более крупную модель.

Ещё нам показывают крыс Вистар, от которых произошла линия крыс OXYS и которых используют в качестве контроля в исследованиях. Они намного крупнее, восьмимесячных самцов Галина сравнивает с кроликами.

У наших крыс в этом возрасте масса меньше на треть — не 600, а 400 граммов, — поясняет Наталья и продолжает. — Галина Николаевна, давай ещё деток покажем, как матери гнёзда делают.

Сейчас не делают — тепло, — поясняет Галина.

— Видите, просто сложила всех в кучу. В клетке здесь папа с мамой и дети. Не будем их пугать.

Новорождённые крысы ещё слепые. Услышав щелчки затвора объектива, мамочка начинает прятать своих детёнышей. Все крысы в виварии — альбиносы: у них красные глаза.

Их кормят специальной едой для грызунов, а мамочек подкармливают кашей.

Я туда творожок кладу, капусту, морковку, пшеничку проращиваю, а основа — это перловая каша, — делится своим рецептом Галина.

Когда проводят эксперименты, — а они могут длиться месяцами — кормить крыс или давать им препараты нужно в определённое время, поэтому сотрудники вивария могут прийти и в восемь вечера, и в выходные дни, и в праздничные. Наверное, эти любовь и забота играют не последнюю роль в научной деятельности, которая приносит хорошие результаты.

Источник: https://sib.fm/interviews/2017/04/17/bolezn-alcgejmera-poprobuem-na-krysakh

Medic-studio
Добавить комментарий