Выделение РНК (задача 1): Качество выделения суммарной РНК является одним из ключевых

Методы выделения ДНК и РНК из биологического материала | ВМТ

Выделение РНК (задача 1): Качество выделения суммарной РНК является одним из ключевых

Выделение ДНК и РНК — важный шаг подготовки проб перед биохимическими и диагностическими процессами.

Амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и т. д.

, не могут быть выполнены непосредственно на биологических образцах без предварительного выделения (экстракции) нуклеиновых кислот (НК) и их последующей очистки.

Почему так важно получить высококачественную ДНК?

Так как в ветеринарной клинической практике наиболее используемым методом является ПЦР в реальном времени (или, в некоторых случаях, классическая ПЦР), рассмотрим методы выделения НК и их особенности будут рассмотрены именно с точки зрения данного вида анализа.

Механизм ПЦР

Как известно, ПЦР (полимеразная цепная реакция) представляет собой реакцию синтеза комплементарной цепочки ДНК на ДНК матрице, катализируемую ферментом ДНК-зависимой ДНК-полимеразой.

Фермент термостабильный – он может выдерживать высокие температуры, необходимые на этапе денатурации. Оптимум работы полимеразы составляет около 72°C.

Для создания оптимальных условий синтеза образец ДНК помещается в так называемую реакционную смесь (РС).

Реакционная смесь состоит:

  1. Буфер для ПЦР. Это буферный раствор с определенным значением pH и концентрацией различных солей и кофакторов, необходимых для работы полимеразы. В наше время компании-производители реактивов для ПЦР предлагают к своим полимеразам фирменные буферы.
  2. ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Катализатор реакции, чаще всего выделяется из термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза).
  3. Нуклеотидтрифосфаты (dNTPs). Раствор мононуклеотидтрифосфатов (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) в свободном виде, которые служат «строительным материалом» для синтеза ампликонов.
  4. Праймеры. Короткие синтезированные последовательности ДНК (олигонуклеотиды), фланкирующие исследуемые участки ДНК – от них полимераза начинает свою работу.
  5. MQ вода. Дистиллированная и деионизированная вода, пригодная для молекулярно-генетических исследований. Используется для доведения реакционной смеси до рабочей концентрации.
  6. ДНК. Собственно, сам образец ДНК, который необходимо исследовать.

При должном качестве всех компонентов реакционной смеси реакция может ингибироваться только из-за плохой очистки ДНК. Ингибиторы ПЦР представляют собой вещества, способные повлиять на конформацию фермента и уменьшить его активность, вплоть до полной деактивации. Эти примеси могут оказаться в растворе ДНК по двум причинам:

  1.  Плохая очистка образца от остатков веществ, которые содержались в материале, из которого производилось выделение. Ингибировать ПЦР могут остатки жиров, белков, углеводов, пигментов (для растительных клеток – хлорофиллы, каратиноиды, антоцианы, для животных – гемоглобин и др.). Сюда же относятся и вещества, которые были использованы в качестве транспортной или консервационной среды для образца (ЭДТА, гепарин, формальдегид).
  2. Плохая очистка образца от реагентов, которые были использованы в процессе выделения. Сильно ингибируют ПЦР детергенты (ПАВ) и денатуранты, такие как SDS (додецилсульфат натрия) и мочевина; спирты и другие неполярные растворители, которые содержатся в экстрагентах и отмывочных буферах (этанол, изопропанол, фенол и др.).

Список некоторых веществ, которые могут негативно повлиять на эффективность ПЦР, показан в таблице 1.

Таблица 1. Некоторые ингибиторы процесса ПЦР

ИнгибиторКонцентрация ингибитора
SDS> 0.005%
Фенол> 0.2%
Этанол> 1%
Изопропанол> 1%
Ацетат натрия> 5 mМ
Хлористый натрий> 25 mМ
EDTA> 0.5 mМ
Гемоглобин> 1  мг/мл
Гепарин> 0.15 i.m/мл
Мочевина> 20 mМ
Агароза (при выделении ДНК из геля)> 1%
РНК> 0,5 мкг/20мкл
Реакционная смесь> 15%

Из этого можно сделать вывод, что ключевыми факторами успешного выделения НК является грамотная подготовка материала, правильный выбор метода экстракции и точное соблюдение требований протокола выделения.

Какие требования предъявляются к материалу для выделения нуклеиновых кислот?

Прежде всего, биологические образцы должны быть взяты в достаточном количестве для проведения анализа, кроме того, образца должно хватить для проведения повторного анализа. При этом необходимо учитывать вариации содержания НК в различных органах и тканях, а также уменьшение содержания НК из-за деградации, если образец был взят через большой промежуток времени после смерти животного.

Экстракцию нуклеиновых кислот следует начинать как можно скорее после отбора свежих тканей. Ткань может храниться в условиях низкой температуры в холодильнике в течение нескольких дней без риска деградации НК.

Однако, если выделение невозможно в ближайшее время, образец должен быть заморожен до температуры от -20°C до -80°C.

При этом целесообразно использовать для хранения и перевозки образцов одноразовую пластиковую пробирку или другие плотно закрывающиеся емкости.

После экстракции целесообразно проверить качество выделенной НК, например, измерить концентрацию с помощью флюориметра/спектрофотометра, провести гель-электрофорез или ПЦР со специальными праймерами – факторами элонгации.

Обзор методов выделения НК

Выделение нуклеиновых кислот – один из базовых методов молекулярной биологии. В прошлом процесс выделения и очистки НК был сложным, времязатратным, трудоемким и имел ограничения с точки зрения скорости обработки образцов.

На сегодняшний день имеется множество специализированных методик, которые могут использоваться для выделения нуклеиновых кислот с высокой степенью очистки. Их можно условно разделить на две группы: осаждение НК на суспензионный носитель и выделение на колонках.

Безусловно, традиционные методы выделения являются надежными и прошли испытание временем, но сейчас на рынке имеется широкий ассортимент товаров, включая полные наборы, содержащие большинство реагентов, необходимых для выделения нуклеиновых кислот.

Однако, большинство из них все же требует многократных этапов центрифугирования, которые сопровождаются удалением супернатанта (прим. фаза дисперсионной системы, которая располагается сверху от границы раздела фаз).
В последний годы повысился спрос на автоматические системы.

Разработанные для средних и крупных лабораторий, они являются альтернативой трудоемкому ручному методу. Данная технология значительно повышает производительность лаборатории. При этом выход НК и чистота материала, воспроизводимость и прогностичность эксперимента будут максимальными (так же как скорость, точность и надежность анализа в целом), а риск кросс-контаминации (перекрестного заражения) минимизируется.

Фенол-хлороформная экстракция (Guanidinium Thiocyanate-Phenol-Chloroform Extraction)

Обычно протокол выделения нуклеиновых кислот включает следующие этапы: 1.) клеточный лизис, в результате которого разрушаются клеточные структуры и образуется лизат, 2.) инактивацию нуклеаз клетки, таких как ДНКаза и РНКаза, 3.) выделение искомой нуклеиновой кислоты из клеточного дербиса.

Экстракция с помощью смеси фенол-хлороформ – один из наиболее старых, но, тем не менее, широко используемых методов выделения нуклеиновых кислот.Несмотря на то, что фенол – легковоспламеняющееся, коррозионное и токсичное для человека вещество, он способен очень активно денатурировать белки, но не полностью инактивирует РНКазы.

Эту проблему можно решить, используя смесь фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (в пропорции 25:24:1).При смешивании фенола и хлороформа образуется двухфазная эмульсия. После центрифугирования гидрофобный слой эмульсии, в котором собираются белки, липиды и углеводы, оседает на дно, а гидрофильный остается сверху.

Отбирается верхняя фаза, содержащая ДНК, после чего ДНК осаждают из супернатанта путем добавления этанола или изопропанола в соотношении 2:1 или 1:1 на фоне высокой концентрации солей в лизате.

Соли – обычные примеси в образцах нуклеиновых кислот, поэтому их всегда необходимо удалять из образца перед любыми последующими процессами и планируемыми анализами. Следовательно, для обессоливания образца, содержащего нуклеиновую кислоту, требуется одна или несколько стадий отмывки.

Осажденную ДНК выделяют путем повторного центрифугирования, причем избыток солей вымывается с помощью 70%-го этилового спирта, а центрифугирование необходимо для удаления супернатанта – этанола. Затем осажденную ДНК растворяют с помощью ТЕ-буфера или MQ-воды.

FTA-карты

В данной методике нуклеиновые кислоты выделяются прямо на специальной бумаге, пропитанной смесью реагентов, связывающих ДНК.

Для выделения достаточно нанести каплю образца на карту, после чего нанести на нее буфер для выделения и высушить. В дальнейшем, карту можно разрезать на фрагменты и загружать прямо в пробирку для ПЦР.

Данный метод подходит только для жидких образцов и не пригоден для ПЦР в реальном времени, однако по времени анализа ему нет равных.

С помощью коммерческих наборов (kits)

Для выделения НК возможно подготовить высококачественные образцы для анализа прямо «из коробки». По сравнению с традиционными методами они обеспечивают более быстрое и менее трудоемкое выделение. Многие затруднения, свойственные фенол-хлороформной экстракции, например, неполное разделение фаз, в данном случае исключены.

В процессе выделения твердая фаза системы (сорбент) адсорбирует на себя нуклеиновые кислоты в зависимости от pH и ионной силы буфера.

Процесс адсорбции основывается на следующих принципах: образование водородных связей с гидрофильной матрицей в хаотропных условиях, с последующим ионным обменом в жидкой среде с помощью анионообменника посредством отбора молекул по их афинности и размеру.

В большинстве случаев твердофазная экстракция осуществляется с использованием колонки для очистки ДНК (spin column), через которую проходит лизат под воздействием центробежной силы. По сравнению с традиционными способами очистки данный метод имеет преимущество в скорости работы. В качестве носителя используются силикатные носители (силика), стеклянные частицы, диатомит и анионообменные носители.

Протокол твердофазной экстракции включает четыре ключевых шага: клеточный лизис; адсорбцию нуклеиновых кислот, отмывку и десорбцию (элюцию). Исходным этапом является установка колонки для адсорбции образца.

Подготовка колонки производится с использованием буфера с определенным pH – для того, чтобы придать поверхностным структурам (или функциональным группам) сорбента необходимые свойства – только в таком случае ДНК или РНК будут «налипать» на носитель. Следующий шаг – образец, расщепленный с помощью лизирующего буфера, помещают на колонку.

Искомая нуклеиновая кислота адсорбируется на колонке за счет высокого pH и концентрации солей в связывающем растворе (binding solution). Прочие составляющие, такие как белки, также могут образовывать прочные специфические соединения с поверхностью колонки.

Эти нежелательные примеси можно удалить на стадии промывания, используя промывочный буфер (wash buffer), который содержит вещества, не дающие им адсорбироваться. Для того, чтобы высвободить нуклеиновую кислоту с колонки на стадии десорбции, используется ТЕ-буфер или MQ-вода.

Так называемые селективные носители (mixed-bed solid phases) представляют собой смесь по крайней мере двух различных сорбентов, которые могут быть твердыми или полутвердыми, пористыми или непористыми. Каждый из них способен связываться с целевой нуклеиновой кислотой при определенных условиях.

Силикатные носители (Силика, Silica Matrices)

Основой для большинства наборов для выделения и очистки нуклеиновых кислот, являются уникальные свойства силиконовых носителей для селективного связывания НК. К таким относятся стеклянные шарики и микроволокна, силикатные частицы, а также диатомовая земля (диатомит).

Сюда же можно отнести носители из гидроокиси кремния (hydrated silica matrix), которые изготовливают путем нагревания смеси из диоксида кремния и гидроксида натрия (либо гидроксида калия) в молярном соотношении от 2:1 до 10:1 в течение 48 часов. ДНК связывается с неорганическим носителем и высвобождается при элюции.

Принцип очистки нуклеиновых кислот с помощью силикатных носителей базируется на высокой афинности отрицательно заряженного остова ДНК к положительно заряженным силикатным частицам. Натрий играет роль катионного мостика, который притягивает отрицательно заряженный кислород в фосфатном «скелете» нуклеиновой кислоты.

В условиях высокой ионной силы (pH ≤ 7) катионы натрия разрушают водородные связи между водородом воды и отрицательно заряженными ионами кислорода в силикатном материале. В этих условиях ДНК тесно связывается с носителем, а интенсивное промывание позволяет удалить все нежелательные примеси.

Очищенные молекулы ДНК могут быть десорбированы позже, уже при низкой ионной силе раствора (pH ≥ 7), с использованием ТЕ-буфера или MQ-воды.Кроме силикатных носителей, связывать нуклеиновые кислоты способны также нитроцеллюлоза и полиамидные мембраны (polyamide membranes) (например, нейлоновые матрицы), однако они имеют меньшую специфичность.

Вышеперечисленные материалы используются в качестве транспортировочных и гибридизационных носителей для твердофазной экстракции НК. Полиамидные носители более долговечны, чем целлюлозные, и способны необратимо связывать нуклеиновые кислоты. Нуклеиновые кислоты могут быть иммобилизованы на полиамидных сорбентах при низкой ионной силе буферного раствора.

Стеклянные носители (Glass Particle)

Для очистки нуклеиновых кислот используются частицы стекла, стеклянный порошок и стеклянные шарики. Адсорбция нуклеиновых кислот на стеклянный субстрат базируется на тех же принципах, что адсорбционная хроматография.
Очистка нуклеиновых кислот также может осуществляться на силикагеле и стеклянной суспензии в присутствии раствора хаотропных солей.

Диатомит

Диатомовая земля, известная также как кизельгур или диатомит, содержит до 94% кремния. Применяемая для фильтрации и в хроматографии, она подходит и для очистки плазмидной и ядерной ДНК. Впоследствии ДНК, связанная с диатомитом, вымывается с помощью спиртосодержащего буфера. Потом буфер сливается, а ДНК элюируется.

Очистка нуклеиновых кислот с использованием магнитных микроносителей (Magnetic Bead Based Nucleic Acid Purification)

Магнитная сепарация – современный, простой и эффективный способ очистки нуклеиновых кислот. Удобство данного метода заключается в том, что, намагниченные частицы могут быть удалены с помощью постоянного магнита.

К стенке пробирки прикладывают магнит, благодаря чему происходит агрегация частиц вблизи него, после чего оставшуюся часть образца выливают. То есть не требуется ни органических растворителей, ни многократного центрифугирования, вакуумной фильтрации или осаждения на колонках.

Часто для процесса выделения используют магнитные носители с иммобилизованными аффинными лигандами или носители, полученные из биополимера с аффинностью к целевой нуклеиновой кислоте.

К таким относятся магнитные частицы, полученные из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или на основе неорганических магнитных материалов (например, поверхностно-модифицированный оксид железа).

Для более эффективного связывания нуклеиновых кислот предпочтительно использовать материалы с большой суммарной площадью поверхности. Магнитные материалы в виде шариков (beads) более предпочтительны из-за их большей связывающей способности, так как НК буквально «оборачиваются» вокруг круглых частиц.

Существует метод выделения НК с помощью инкапсулированных в полимер магнитных частиц. Чаще всего для этих целей используют целлюлозу, а в качестве магнитного компонента – оксиды железа или никеля. Особенность данного метода заключается в том, что нуклеиновые кислоты малого размера требуют более высоких концентраций солей для прочного связывания с модифицированными магнитными частицами. Следовательно, концентрацию соли можно избирательно изменять, чтобы высвободить связанную нуклеиновую кислоту нужного размера.

Анионообменные смолы

Анионообменные смолы – класс носителей, в которых используется принцип анионного обмена. Он основан на взаимодействии между положительно заряженными группами диэтиламиноэтилцеллюлозы (DEAE) на поверхности смолы и отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК-скелета. Анионообменная смола состоит из силикатных гранул с большим размером пор и гидрофильного поверхностного слоя.

Большая суммарная площадь поверхности смолы обеспечивает плотное соединение DEAE-групп с НК. Смола работает в широком диапазоне рН (рН=6-9) и/или концентрации солей (0,1-1,6 М).

Благодаря этому такие примеси, как белок и РНК вымываются из смолы с при использованием буферов со средней ионной силой, в то время как ДНК остается связанной с ней до этапа элюирования буфером с высокой ионной силой.

Подводя итог, можно заключить, что современный рынок материалов для выделения нуклеиновых кислот характеризуется большим разнообразием.

Все методики позволяют получать высококачественные образцы, пригодные для клинических исследований, однако следует учитывать условия работы лаборатории (вид анализов, количество образцов, цены на услуги лаборатории и т.д.

), и тогда практический и экономический эффект выбранного метода будет максимальным.

Источник: https://vmtechnology.ru/isolation-dna

Способ выделения коротких рнк из биологических жидкостей

Выделение РНК (задача 1): Качество выделения суммарной РНК является одним из ключевых

Изобретение относится к области молекулярной биологии и диагностической медицины и может быть использовано для выделения коротких рибонуклеиновых кислот (РНК) из биологических жидкостей.

Термин «короткие рибонуклеиновые кислоты (короткие РНК)» по данному описанию в контексте настоящего изобретения означает фрагменты РНК с длиной до 50 нуклеотидов, представленные такими известными молекулами РНК, как микроРНК (miRNA), малые интерферирующие РНК (siRNA) и piwi-взаимодействующие РНК (piRNA), а также, потенциально, фрагменты расщепления более длинных молекул РНК, такие как матричные РНК (mRNA), рибосомальные РНК (rRNA), транспортные РНК (tRNA), ядерные и ядрышковые РНК (snRNA и snoRNA), длинные некодирующие РНК (lncRNA) и др.

Наибольший интерес из коротких РНК для диагностической медицины представляют циркулирующие в крови и находящиеся в других биологических жидкостях микроРНК, которым посвящено огромное количество исследований (1). МикроРНК представляют собой короткие (18-24 нуклеотида), не кодирующие белок, молекулы РНК, регулирующие экспрессию множества генов на посттранскрипционном уровне.

МикроРНК участвуют практически во всех базовых процессах от момента возникновения организма: эмбриональном развитии, пролиферации, дифференцировке, старении, иммунном и стрессорном ответах, геномном импринтинге, в ключевых процессах метаболизма.

Исследования последних лет показали, что микроРНК сами могут выступать в роли онкогенов и супрессоров опухолевого роста, при развитии самых разнообразных опухолей.

Основным препятствием в выделении высококачественных препаратов коротких РНК из биологических жидкостей является высокое содержание в них биополимеров ненуклеотидной природы (белки, липопротеины, липиды и их комплексы), в том числе входящих в комплексы с микроРНК, присутствие в них ингибиторов ферментов, используемых в последующем анализе (например, ПЦР), а также высокое содержание ферментов, расщепляющих нуклеиновые кислоты.

Таким образом, получение высокоочищенных препаратов недеградированных коротких РНК, пригодных для последующего анализа (ОТ-ПЦР, микрочиповый анализ, полногеномное секвенирование), является актуальной проблемой в молекулярной биологии.

В настоящее время для получения коротких РНК из биологических жидкостей традиционно используются способы, основанные на фенольной экстракции. Эти способы отличаются трудоемкостью, многостадийностью, сложностью в постановке и использованием токсичных химических реагентов (фенол).

Известен, например, способ выделения коротких РНК, включающий смешивание образца, растворенного в 4М растворе гуанидин изотиоцианата с водонасыщенным фенолом в кислой среде, с последующим разделением фаз при помощи добавления хлороформа (2).

При центрифугировании такой смеси суммарная РНК остается в верхней водной фазе, белки образуют интерфазу, а ДНК переходит в органическую фазу.

Варианты последующей очистки включают переосаждение спиртами или дополнительную очистку РНК, например, на стекловолоконных сорбентах.

Недостатками данного способа являются трудоемкость, использование токсичных химических реагентов, а также получение на выходе препарата суммарной РНК, специально необогащенной по содержанию короткими РНК.

Для обогащения короткими РНК в ряде коммерческих наборов (miRVANA, miRNeasy и др.) используется дополнительная стадия очистки на стекловолоконных сорбентах.

Известен способ выделения коротких РНК из биологических жидкостей, основанный на предварительной очистке препарата от биополимеров ненуклеотидной природы при помощи их осаждения (miRCURY) с последующим выделением рибонуклеиновых кислот из супернатанта на стекловолоконном сорбенте (3).

Всем вышеперечисленным способам присущ общий недостаток, заключающийся в потере части РНК при отделении нецелевых фракций.

Наиболее близким к заявляемому способу прототипом является способ выделения коротких РНК, основанный на известном методе фенольной экстракции (4), заключающийся в следующем.

Образец плазмы денатурируют в буфере, содержащем 4М гуанидин изотиоцианат, проводят кислую фенольную экстракцию и разделяют органическую и водную фазы при помощи хлороформа.

К верхней водной фазе прибавляют равный объем 96% этилового спирта (этанола) и наносят на колонку со стекловолоконным сорбентом, например производства Биосилика (BioSilica Ltd, Россия).

Колонку отмывают от несвязавшихся биополимеров и избытка химических агентов (гуанидин изотиоцианат, хлороформ) согласно рекомендациям производителя и элюируют короткие РНК раствором для элюции, содержащим 10 мМ бикарбонат натрия. В отдельных случаях для дополнительной очистки от присутствия солей в образце проводят переосаждение коротких РНК, например, спиртами.

Недостатками известного способа являются: трудоемкость, возрастающая пропорционально количеству образцов, многостадийность, использование токсичных химических реагентов (фенол) и недостаточный выход целевого продукта. Кроме этого способ невозможно автоматизировать.

Задачей изобретения является получение препарата высокоочищенных недеградированных коротких РНК, пригодных для последующего анализа при помощи высокоточных молекулярно биологических методов, таких как ОТ-ПЦР, микрочиповый анализ и полногеномное секвенирование.

Технический результат: упрощение способа, сокращение его длительности и повышение выхода коротких РНК.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Образец биологической жидкости подвергают двухстадийной денатурации при помощи буферного раствора, содержащего хаотропный агент (гуанидин изтиоцианат), и органических растворителей (спирт, хлороформ).

Для первичной денатурации белковых комплексов и инактивации ферментов, расщепляющих РНК, к образцу биологической жидкости добавляют два объема буферного раствора, содержащего 6,0-6,75 М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, и инкубируют в течение 5 минут.

Для полной денатурации белковых комплексов, а также растворения липопротеиновых комплексов и везикулярных структур к полученной смеси добавляют два объема 96% этанола и равный объем хлороформа, перемешивают и отделяют супернатант центрифугированием.

Затем супернатант (денатурированный образец биологической жидкости) наносят на стекловолоконный сорбент, например на колонку «Биосилика», (BioSilica Ltd, Россия), при помощи фильтрационной установки либо центрифуги.

Колонку дважды отмывают от несвязавшихся биополимеров буферным раствором, содержащим 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1% 2-меркаптоэтанол. Далее сорбент дважды промывают от избытка химических агентов буферным раствором, содержащим 10 мМ Tris-HCl, pH 7.

5, 0,1 М NaCl, 75% этанол, и элюируют короткие РНК с сорбента буферным раствором, содержащим 1-15 мМ бикарбонат натрия, 5-50 мМ раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1% 2-меркаптоэтанол или 0,5-50 мМ ЭДТА, предварительно нагретым до 85-95°C. В результате получают препарат коротких РНК, имеющих длину от 16 до 50 нуклеотидов.

В качестве биологических жидкостей могут выступать плазма крови, сыворотка крови, моча, молоко, спинномозговая жидкость, альвеолярные смывы и т.д.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1. Образец биологической жидкости подвергают двухстадийной денатурации, при этом на первой стадии к образцу добавляют два объема денатурирующего раствора, содержащего 6,0-6,75 М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, pH 6.

5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, а на второй стадии к полученной смеси добавляют два объема 96% этанола и равный объем хлороформа, что позволяет повысить выход коротких РНК и сократить длительность способа за счет исключения необходимости проведения фенольной экстракции.

2. Отмывку сорбента от несвязавшихся биополимеров осуществляют дважды буферным раствором, содержащим 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1% 2-меркаптоэтанол, повторяющим состав денатурирующих растворов, что позволяет дополнительно повысить эффективность выделения коротких РНК.

3. Элюцию коротких РНК с сорбента осуществляют буферным раствором, содержащим 1-15 мМ бикарбонат натрия, 5-50 мМ ЭДТА, 1% 2-меркаптоэтанол или 0,5-50 мМ раствором ЕДТА, предварительно нагретым до 85-95°C, что позволяет повысить выход и сократить время выделения коротких РНК.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:

– позволяет выделять короткие РНК без использования фенола с большей эффективностью (~110%) и воспроизводимостью (5% против 20% для фенольной экстракции) по сравнению с использованием традиционных методов фенольной экстракции;

– упрощает процедуру выделения коротких РНК, уменьшает количество стадий обработки образца и позволяет сократить время выделения коротких РНК в 2,7 раза (с 49 до 18 минут).

Сопоставительный анализ заявляемого способа по сравнению с прототипом представлен в таблице 1.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного использования метода

Пример 1.

К 100 мкл плазмы здорового донора прибавляют 200 мкл денатурирующего раствора, содержащего 6 М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, и инкубируют в течение 5 минут.

В смесь плазмы и денатурирующего буфера вносят 100 нг 32Р-меченого синтетического рибоолигонуклеотида длиной 22 нуклеотида.

К полученной смеси добавляют 600 мкл 96% этанола и 300 мкл хлороформа, перемешивают, инкубируют 5 мин и центрифугируют при 17000 g в течение 5 минут, при этом допускается образование небольшой опалесценции раствора.

Супернатант наносят на колонку со стекловолокнистым сорбентом Биосилика (BioSilica Ltd, Россия). Сорбент промывают дважды 300 мкл буфера, содержащего 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1% 2-меркаптоэтанол, при центрифугировании при 400 g в течение 1 минуты.

Затем сорбент промывают дважды 300 мкл буфера, содержащего 10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0,1 М NaCl, 75% этанол, при 400 g в течение 1 минуты.

Короткие РНК элюируют буфером для элюции, содержащим 1 мМ бикарбонат натрия, 5 мМ ЭДТА, 1% 2-меркаптоэтанол, в течение 10 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 400 g одну минуту и затем при 17000 g одну минуту.

В результате получают препарат, представляющий смесь коротких РНК с длиной от 16 до 50 нуклеотидов, с выходом 54,9%.

Эффективность выделения целевого продукта определяют по удельной радиоактивности полученного препарата коротких РНК и аликвот из промежуточных стадий на счетчике бета-частиц по Черенкову.

Пример 2.

Короткие РНК выделяют из плазмы крови аналогично примеру 1 за исключением того, что используют денатурирующий буфер, содержащий 6,75 М гуанидин изотиоцианат, далее сорбент отмывают, как в примере 1, а для элюции коротких РНК используют 1 мМ раствор ЭДТА, предварительно нагретый до 95°C. В результате получают препарат, представляющий смесь коротких РНК с длиной от 16 до 50 нуклеотидов, с выходом 56,0%.

Пример 3.

Короткие РНК выделяли из мочи 20 здоровых доноров при помощи способа-прототипа и предлагаемого способа следующим образом: к 400 мкл мочи прибавляли 800 мкл денатурирующего раствора, содержащего 6,5 М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, 15 мМ ЭДТА, pH 6.

5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, и инкубировали в течение 5 минут. К полученной смеси добавляли 2400 мкл 96% этанола и 1200 мкл хлороформа, перемешивали, инкубировали 1 мин и центрифугировали при 17000 g в течение 5 минут, при этом допускается образование небольшой опалесценции раствора.

Супернатант наносили на колонку со стекловолокнистым сорбентом Биосилика (BioSilica Ltd, Россия). Сорбент дважды промывали 300 мкл буфера, содержащего 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.

5, 1% 2-меркаптоэтанол, при центрифугировании при 400 g в течение 1 минуты. Затем сорбент дважды промывали 300 мкл буфера, содержащего 10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 0,1 М NaCl, 75% этанол при 400 g в течение 1 минуты.

Короткие РНК элюировали буфером, содержащим 15 мМ бикарбонат натрия, 50 мМ ЭДТА, 1% 2-меркаптоэтанол, в течение 5 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 400 g 1 минуту, а затем при 13000 g 1 минуту.

Короткие РНК, выделенные способом-прототипом и предлагаемым способом, подвергали дополнительной очистке для последующего определения концентрации с помощью количественной ОТ-ПЦР.

Для этого к полученным элюатам добавляли 30 мкг гликогена, 1/10 объема 3 М ацетатного буфера (NaOAc), pH 7.4 и равный объем изопропанола, инкубировали 30 минут при -20°C и центрифугировали при 13000 g в течение 15 мин при 4°C.

Супернатант удаляли, осадок последовательно промывали 75% и 96% этанолом, центрифугируя при 13000 g 5 минут при 4°C. Осадок сушили на воздухе и растворяли в воде.

Выход коротких РНК определяли по концентрации шести микроРНК: miR-16, miR-21, miR-126, miR-125b, miR-183, miR-19b – при помощи количественной ОТ-ПЦР (5). Результаты выделения коротких РНК из мочи способом-прототипом и предлагаемым способом представлены в таблице 2.

Данный пример иллюстрирует, что препараты коротких РНК, выделенные из мочи с использованием предлагаемого способа, пригодны для исследования при помощи количественных молекулярно-биологических методов, например анализа микроРНК при помощи ОТ-ПЦР.

Пример 4.

Короткие РНК выделяли из плазмы крови 20 здоровых доноров при помощи способа-прототипа и предлагаемого способа.

Выделение коротких РНК из плазмы с помощью предлагаемого способа проводили следующим образом: к 100 мкл плазмы прибавляли 200 мкл денатурирующего раствора, содержащего 6М гуанидин изотиоцианат, 15 мМ Трис-ацетат, pH 6.5, 1,5% 2-меркаптоэтанол, и инкубировали в течение 5 минут.

К полученной смеси добавляли 600 мкл этанола и 300 мкл хлороформа, перемешивали, инкубировали 5 мин и центрифугировали при 17000 g в течение 5 минут, при этом допускается образование небольшой опалесценции раствора. Супернатант наносили на колонку Биосилика (BioSilica Ltd, Россия) под вакуумом.

Сорбент дважды промывали 300 мкл буфера, содержащего 50% этанол, 25% хлороформ, 1 М гуанидин изотиоцианат, 2,5 мМ Трис-ацетат, pH 6.5,1% 2-меркаптоэтанол, при 400 g в течение 1 минуты. Затем сорбент дважды промывали 300 мкл буфера, содержащего 10 mM Tris-HCl, pH 7.

5, 0,1 М NaCl, 75% этанол, при 400 g в течение 1 минуты. Короткие РНК элюировали 50 мМ раствором ЭДТА, предварительно нагретым до 85°C, в течение 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 400 g 1 минуту и затем при 17000 g 1 минуту.

Для осаждения коротких РНК к раствору коротких РНК добавляли 30 мкг гликогена, 12 мкл 3 М NaOAc, pH 7.

4 и 265 мкл изопропанола, инкубировали 30 минут при -20°C и осаждали короткие РНК центрифугированием при 13000 g в течение 15 мин при 4°C.

Супернатант убирали, а осадок последовательно промывали 75% и 96% этанолом, центрифугируя при 7500 g 5 минут при 4°C. Осадок сушили на воздухе и растворяли в воде.

Выход коротких РНК определяли по концентрации шести микроРНК: miR-16, miR-21, miR-126, miR-125b, miR-183, miR-19b – при помощи количественной ОТ-ПЦР. Результаты выделения коротких РНК из плазмы крови способом-прототипом и предлагаемым способом представлены в таблице 3.

Данный пример иллюстрирует, что препараты коротких РНК, полученные из плазмы крови с использованием предлагаемого способа, пригодны для исследования при помощи количественных молекулярно-биологических методов, например анализа микроРНК при помощи ОТ-ПЦР.

Использование предлагаемого способа позволит значительно упростить известные способы выделения коротких РНК, сократить его длительность и повысить выход целевого продукта.

Источники информации

1. de Planell-Saguer М., Rodicio М.С. Analytical aspects of microRNA in diagnostics: A review. // Analytica Chimica Acta. – 2011. – V. 699. – P. 134-52.

2. Peng J., Xia Z., Chen L., Shi M., Pu J., Guo J., Fan Z. Rapid and efficient isolation of high-quality small RNAs from recalcitrant plant species rich in polyphenols and polysaccharides. // PLoS One. – 2014. – V. 9. – P. e95687.

3. Sedlackova Т., Repiska G., Minarik G. Selection of an optimal method for coisolation of circulating DNA and miRNA from the plasma of pregnant women. // Clin. Chem. Lab. Med. – 2014.

4. Chomczynski P., Sacchi N. The single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. // Nature Protocols. – 2006. – V. 1. – P. 581-585.

5. Chen C., Ridzon D.A., Broomer A.J. et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. // Nucleic Acids Res. – 2005. – V. 33. – P. e179.

Источник: https://edrid.ru/rid/216.013.6873.html

Методы выделения и анализа РНК

Выделение РНК (задача 1): Качество выделения суммарной РНК является одним из ключевых

Методы выделения и анализа РНК Горбачев Алексей Фисунов Глеб НИИ ФХМ 2012

Теория

Для жизнедеятельности клетки нужно: • Программа развития (генетический код, копирование) • Энергия (потребление нужных веществ из среды и выведение ненужных, метаболизм) • Регуляция и подстройка под изменение условий (экспрессия разных генов в разное время, включение выключение) • Защита от стрессовых воздейсвий (поддержание постоянства)

Центральная догма молекулярной биологии ДНК (генетический код) Транскрипция РНК (декодировка) Трансляция Белок (функция) Регуляция Метаболизм Защита

Пуриновое или пиримидиновое основание Фосфат Пентоза Рибоза OH ribose H deoxyribose Дезоксирибоза Нуклеозид Нуклеотид

ПУРИНЫ Аденин Гуанин ПИРИМИДИНЫ РНК: АУГЦ ДНК: АТГЦ Цитозин Урацил Тимин

Отличия ДНК и РНК Характеристика ДНК РНК Сахар дезоксирибоза рибоза Азотистые основания тимин урацил Структура Двойная спираль Одноцепочечная, (только 2 -ая структура) может образовывать 2 – ые и 3 -ые структуры Функции Хранение и передача Реализация генетической информации (синтез белка), регуляция, ферментативная функция (рибозимы)

Транскрипция

Транскрипция ДНК. Общий принцип.

Транскрипция ДНК. Общий принцип.

Структура бактериального промотора • Промотор место, с которым связывается РНК-полимераза • ТАТА-бокс • -35 -регион

Транскрипция у эукариот • Три РНК-полимеразы • На каждый тип РНК своя полимераза – RNApoly I – синтез пре-р. РНК – RNApoly II – синтез пре-м. РНК – RNApoly. III – синтез пре-т. РНК • Каждая полимераза имеет свою структуру промотора

Промотор РНК-полимеразы II • Инициаторная последовательность вокруг точки старта • TATA – бокс – 25 регион • TATA+Инициатор = коровый промотор • A Транскрипционные факторы связываются с ТАТА боксом до РНК-полимеразы

м. РНК Бактериальная м. РНК ORF 1 Спейсер ORF 2 P P P 5’UTR 3’UTR Эукариотическая Экзон Интрон м. РНК CAP P -AAAAAAA Кодирующая область CAP P -AAAAAAA Кодирующая область

р. РНК 16 S 23 S 5 S

т. РНК

тм. РНК

7 SL RNA

Практика

Лизис клеток • 4 М Гуанидин тиоцианат • Trizol/Tri реагент (ГТЦ + фенол) • Циркониевые шарики

Выделение РНК Малые РНК Экстракция Сорбция Фенол/Trizol 2 М Гуанидин p. H~4. 0 тиоцианат +Хлороформ РНК Сорбент Белок на основе Si. O 2 ДНК ДНК (4 М ГТЦ)

Фракционирование РНК Выделение поли-А РНК Сэндвич-гибридизация Сорбент Адаптер TTTTT ||||| AAAAA Целевая РНК

Осаждение РНК • Изопропанол • 1 М Li. Cl >300 нуклеотидов • Промывка 70 -80% этанолом

Детекция нуклеиновых кислот • Радиоактивное мечение – Р 32 -αATP • Флуоресцентное мечение – FAM – HEX – TAMRA – Цианины • Спектрофотометрическая детекция – 260 нм / 280 нм (белок) • Интеркалирующие красители – Et. Br – SYBR Green – Eva. Green – SYTO-82 • Иммуноферментная детекция

Детекция нуклеиновых кислот Преимущества Недостатки Высокая трудоёмкость Низкая производительность Радиоактивное Высокая чувствительность Опасность для мечение пользователя Ограниченная доступность метки Простота Флуоресцентнная Дешевизна Низкая чувствительность детекция Большой набор красителей Высокая трудоёмкость Низкая Иммуноферментная Высокая чувствительность производительность детекция Ограниченная доступность антител

Дот-блот гибридизация Денатурация РНК Формамид Формальдегид Зонд УФ Нитроцеллюлозная Кросс-сшивка мембрана

Nothern-blot гибридизация Электрофорез в Перенос на денатурирующих мембрану и кросс- условиях сшивка р. РНК УФ м. РНК т. РНК Зонд

Nothern-blot гибридизация

Nothern-blot гибридизация • Позволяет определить • Недостатки – Наличие РНК – Ограниченная чувствительность (зависит от способа детекции) – Приблизительную массу РНК – Ограниченная специфичность – Приблизительное количество РНК – Нет количественных результатов – Низкая производительность – Высокая трудоёмкость

In situ гибридизация Транскрипция с ПЦР мечеными Ген Транскрипц ия нуклеотидами Плазмида DIG Зонд (меченая РНК) Ген Детекция Хромогенн Гибридизаци антителами ая реакция я DIG

In situ гибридизация

Трёхмерная реконструкция пространственно- временного профиля транскрипции

In situ гибридизация • Позволяет определить • Недостатки – Наличие РНК – Ограниченная чувствительность (зависит от способа детекции) – Пространственное распределение РНК – Ограниченная специфичность – Приблизительное количество РНК – Нет количественных результатов – Низкая производительность – Высокая трудоёмкость

Primer extension Секвенирование Обратная Праймер транскрипция Праймер ДНК РНК Метка Акриламидный электрофорез

Primer extension

Primer extension • Позволяет определить • Недостатки – Точку старта – Ограниченная транскрипции чувствительность (зависит от способа детекции) – Низкая производительность – Высокая трудоёмкость

RACE • 5’-RACE – Определение 5’-концов • 3’-RACE – Определение 3’-концов

3’-RACE к. ДНК Олиго д. Т праймер TTTTT Адаптор ||||| AAAAA Обратная РНК транскрипция Геноспецифичный праймер к. ДНК Синтез второй цепи Геноспецифичный праймер ПЦР к. ДНК Праймер на адаптор

5’-RACE м. РНК CAP P P P Продукт OH расщепления, р. РНК TAP кислая фосфатаза тобака 3’ 5’ OH P Адаптор Т 4 РНК-лигаза м. РНК OH

5’-RACE Геноспецифичный праймер Адаптор Обратная транскрипция м. РНК Праймер на адаптор ПЦР к. ДНК Геноспецифичный праймер

RACE • Позволяет • Недостатки определить – Низкая – Точку старта производительность транскрипции – Точку терминации транскрипции – Направление транскрипции

Библиотека двуцепочечной к. ДНК

Вычитающая гибридизация к. ДНК Расщепление на короткие фрагменты к. ДНК Тестер А Тестер В

Вычитающая гибридизация 3’ 5’ Тестер OH P Лигирование адаптеров OH 5’ 3’

Вычитающая гибридизация Драйвер (избыток) Тестер А Тестер В Гибридизация

Вычитающая гибридизация Тестер А – Тестер А ПЦР Суппрессия Тестер В – Тестер В Тестер – Драйвер Линейная амплификация Драйвер – Драйвер Нет амплификации Тестер А – Тестер В Экспоненциальная амплификация

Вычитающая гибридизация • Позволяет • Недостатки определить – Низкая – Отличия одного пула чувствительность РНК от другого – Низкая производительность – Высокая трудоёмкость

Real-time PCR (Q-PCR) Обратная транскрипция к. ДНК Праймер РНК Интеркалирующий краситель Праймер ДНК-полимераза Плавление Отжиг Достройка Детекция

Real-time PCR (Q-PCR) Увеличение специфичности – четвёртая стадия Температура детекции

Real-time PCR (Q-PCR) Увеличение специфичности – использование зондов FRET Флуорофор Тушитель Праймер Зонд ДНК-полимераза Флуоресценция

Real-time PCR (Q-PCR) Кривая плавления Ампликон Неспецифический продукт

Real-time PCR (Q-PCR) обработка результатов Линейный вид Логарифмический вид

Q-PCR для бедных или полуколичественная ПЦР

Real-time PCR (Q-PCR) эффективность реакции и количественные измерения

Real-time PCR (Q-PCR) обработка результатов • Простой метод – R = (эффективность)ΔCt – Эффективность должна быть одинаковой • Метод Пфаффла – R = (эффективность)ΔCt target(опыт-контроль) / (эффективность)ΔCt reference(опыт-контроль)

Real-time PCR (Q-PCR) • Позволяет • Недостатки определить – Низкая – Количество РНК в производительность относительном или абсолютном – Повышенные выражении требования к дизайну праймеров и реакции в целом по сравнению с обычной ПЦР

Гибридизация на чипах Экспрессионный чип Tiling array Олигонуклеотид Ген

Гибридизация на чипах ДНК 1 ДНК 2 Cy-3 Cy-5

Гибридизация на чипах • Позволяет определить • Недостатки – Количество РНК в относительном или – Низкая специфичность абсолютном выражении – Необходимость в мощном – Направление транскрипции компьютерном обеспечении (для – Точки старта полногеномных чипов) транскрипции – Точки терминации транскрипции

Next-generation sequencing • Миллиарды реакций секвенирования за один прогон • Подсчёт встречаемости данной последовательности Встречаемость прочтений Геном

Next-generation sequencing

Next-generation sequencing • Позволяет определить • Недостатки – Количество РНК в относительном или – Высокая трудоёмкость абсолютном выражении – Необходимость в мощном – Направление транскрипции компьютерном обеспечении – Точки старта транскрипции – Точки терминации транскрипции

Tiling array RNA-Seq Точность Точность Покрытие

Источник: https://present5.com/metody-vydeleniya-i-analiza-rnk/

Топ-5 современных методик выделения нуклеиновых кислот

Выделение РНК (задача 1): Качество выделения суммарной РНК является одним из ключевых

Впервые нуклеиновые кислоты пытались выделить в середине XIX века, когда ещё практически ничего не было известно об этих молекулах. Однако с момента открытия структуры и свойств ДНК технологии её выделения непрерывно модифицируются и совершенствуются. В данной статье рассматриваются самые распространенные и прогрессивные методики, используемые для экстракции нуклеиновых кислот.

Выделение фенол-хлороформом

Рис.1. Схема протокола выделения фенол-хлороформным методом.

Первое упоминание об использовании этого метода встречается в статье 1967 года 1, и с тех пор эта технология является одним из самых распространённых способов выделения нуклеиновых кислот.

Суть методики заключается в смешивании клеточного лизата с фенолом, хлороформом и изоамиловым спиртом в пропорции 25:24:1 и последующем перемешивании и центрифугировании смеси.

После проведения этих манипуляций получается раствор с двумя фазами: водной и органической, причем все липиды и жиры находятся в органической (нижней) фазе, белки — на границе фаз, а нуклеиновые кислоты — в водной (верхней) фазе 2 (Рис.1). Для повышения чистоты экстракта эти действия повторяют несколько раз.

Если раствор будет иметь низкий pH, то ДНК перейдёт в органическую фазу, а РНК останется в водной фазе, что позволяет выделять РНК отдельно от ДНК.

Данный метод используется повсеместно, поскольку он не требует дополнительного сложного оборудования и имеет невысокую стоимость. Однако нуклеиновые кислоты, полученные таким образом, обладают невысоким качеством и зачастую требуют дополнительной очистки. Также эта технология имеет существенно меньший выход нуклеиновых кислот в сравнении с другими методиками.

Помимо качества экстракта, этот метод обладает ещё несколькими недостатками: он требует сложных манипуляций, которые могут привести к контаминации и потере образца, а сам процесс трудно автоматизировать. Также весь протокол занимает достаточно много времени 3. 

Выделение на спин-колонках

 

Рис.2. Схема протокола выделения на спин-колонках.

Технология выделения на спин-колонках — это усовершенствованный метод экстракции на частичках силики, предложенный американскими учёными в 1979 году 4.

Они продемонстрировали, что в щелочных условиях и при повышенных концентрациях соли ДНК связывается с силикатами, и это позволяет отделить все остальные компоненты клетки от частиц силики со связанной ДНК.

Спин-колонки сконструированы таким образом, что при нанесении клеточного лизата на колонку и последующем центрифугировании ДНК остаётся на колонке, а всё лишнее проходит сквозь неё (Рис.2). Затем ДНК промывают несколько раз и элюируют в пробирку для сбора образца.

Преимущества такого метода заключаются в повышенной чистоте и хорошем качестве выделенных нуклеиновых кислот, высокой воспроизводимости и простоте по сравнению с выделением фенол-хлороформом. Однако также большое количество манипуляций может привести к контаминации, а выделение коротких фрагментов ДНК на спин-колонках может быть затруднено 5.

Экстракция на спин-колонках может занять от 20 минут в зависимости от биоматериала и сложности его лизиса. 

На рынке этот метод представлен большим разнообразием наборов от таких производителей, как Qiagen, Analytik Jena, NEB, ThermoFisher и других. Стоимость одного выделения здесь значительно выше, чем у предыдущего метода, поскольку на каждую реакцию необходима своя колонка, несколько пробирок для сбора фильтрата и элюата и, конечно, реагенты.

Выделение на магнитных частицах

 

Рис.3. Схема протокола выделения на магнитных частицах.

Спустя 20 лет после появления метода выделения на спин-колонках начинает набирать популярность более быстрый способ выделения на магнитных частицах 6.

Технология этого способа выделения основана на связывании нуклеиновой кислоты с веществом, покрывающим магнитные частицы (целлюлоза, сефадекс, сефакрил, dT-олигонуклеотиды, специфичные олигонуклеотиды и др.). К клеточному лизату добавляют такие магнитные частицы и перемешивают для связывания ДНК с ними.

После этого пробирку ставят в магнитный штатив или подносят к магниту, фиксируя таким образом твердую фазу. После отбора супернатанта нуклеиновые кислоты на частицах промывают и элюируют 7 (Рис.3).

Этот метод имеет те же преимущества, что и выделение на спин-колонках, но для экстракции на магнитных частицах не требуется сложное лабораторное оборудование (например, центрифуга).

Более того, процесс выделения на магнитных частицах легко автоматизировать, и многие автоматические станции выделения основаны именно на этой методике 3.

Однако здесь также присутствует риск контаминации и потерь образца.

Данный протокол выделения займет немного меньше времени благодаря отсутствию этапов центрифугирования, но количество манипуляций будет примерно таким же. Также стоимость одной реакции обычно выше, чем при выделении на колонках, а панели наборов предоставляют Qiagen, Analytik Jena,  ThermoFisher и другие.

Умное выделение (Smart Extraction)

Рис.4. Схема протокола умного выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании Analytik Jena.

Методики выделения нуклеиновых кислот не перестают совершенствоваться: в 2005 году специалисты из компании Analytik Jena доказали, что для связывания нуклеиновых кислот с неорганической твёрдой фазой можно использовать не только хаотропные соли, но и смесь из хаотропных и нехаотропных солей с низкой ионной силой, эту технологию они назвали Dual Chemistry 8.

Позднее они усовершенствовали технологию Dual Chemistry при помощи немагнитных частиц с «умной» поверхностью 9. Для выделения используются специальные наконечники с этими частицами, которые надеваются на дозатор.

При заборе клеточного лизата в наконечник нуклеиновая кислота из раствора связывается с частицами, затем следуют этапы промывки и элюции, в результате чего получается очищенная нуклеиновая кислота высокого качества (Рис.

4).

Эта технология значительно ускоряет процесс выделения, а благодаря особенностям «умной» поверхности выход и качество нуклеиновых кислот значительно превосходит все предыдущие методы.

Данный способ экстракции очень легко автоматизировать, ведь носики со связывающими частицами подходят как для обычных лабораторных дозаторов, так и для различных автоматических станций выделения нуклеиновых кислот.

Ферментативное температурно-зависимое выделение

 

Рис.5. Схема протокола ферментативного температурно-зависимого выделения. Протокол основан на принципе работы наборов для выделения компании MicroGEM. * — несмотря на невысокую степень очистки, образец отлично подходит для дальнейшего использования в ПЦР, секвенировании и STR.

Все вышеперечисленные методики имеют общую лимитирующую стадию — этап лизиса. Во всех технологиях используется SDS и протеиназа K для разрушения клеточных стенок и высвобождения нуклеиновых кислот.

SDS является ингибитором ПЦР, именно поэтому необходимы множественные стадии промывки, которые повышают риск контаминации и приводят к потерям образца.

Также более сложные для лизиса образцы могут требовать дополнительную долгую и трудозатратную пробоподготовку.

Специалисты из новозеландской компании MicroGEM ликвидировали проблемы, связанные с длительным и сложным лизисом и использованием вредных химикатов, благодаря применению очень эффективной термофильной протеиназы EA1 вместе с мезофильными гидролазами 10.

Процесс ферментативного температурно-зависимого выделения начинается со смешивания буфера и ферментов с образцом. При последующей инкубации при комнатной температуре гидролазы деградируют клеточные стенки.

После этого пробирку нагревают до 75°C, что активирует работу протеиназы EA1, которая разрушает все белки и высвобождает нуклеиновые кислоты. Последующее нагревание до 95°C дезактивирует EA1, и после этого образец готов для дальнейшего исследования (Рис.5).

Для особо загрязненных образцов вроде почвы или растений можно добавить этап очистки на колонке для избавления от ингибиторов.

Данная технология оптимальна для работы с малым количеством биоматериала, поскольку нет потерь нуклеиновых кислот. Также эту методику легко автоматизировать, она самая быстрая среди всех упомянутых способов выделения (от 7 минут) и включает меньше всего манипуляций. Стоимость одной реакции невысока, поскольку кроме реагентов не требуется никаких специальных расходных материалов.

Обзор подготовлен при поддержке компании SkyGen — официального дистирибьютора продукции Analytik Jena, MicroGEM, Qiagen, NEB и других производителей.

Источники

1. Rae, P. M. M., Barnett, T. R. & Babbitt, D. G. Factors influencing the yield of satellite DNA in extractions from Drosophila virilis and Drosophila melanogaster adults and embryos. BBA Sect. Nucleic Acids Protein Synth. (1976) doi:10.1016/0005-2787(76)90157-X.

2. Patrinos, G. P., Danielson, P. B. & Ansorge, W. J. Molecular Diagnostics: Past, Present, and Future. in Molecular Diagnostics: Third Edition (2016). doi:10.1016/B978-0-12-802971-8.00001-8.

3. Ali, N., Rampazzo, R. D. C. P., Costa, A. Di. T. & Krieger, M. A. Current Nucleic Acid Extraction Methods and Their Implications to Point-of-Care Diagnostics. BioMed Research International (2017) doi:10.1155/2017/9306564.

4. Vogelstein, B. & Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. (1979) doi:10.1073/pnas.76.2.615.

5. Green, M. R. & Sambrook, J. Molecular Cloning, 3-Volume Set : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press (2012).

6. Trevor Hawkins. DNA PURIFICATION AND ISOLATION USNG MAGNETIC PARTICLES. United States Pat. (#5,705,628 )9, 2989–2997 (1998).

7. Tan, S. C. & Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: The past and the present. Journal of Biomedicine and Biotechnology (2009) doi:10.1155/2009/574398.

8. http://www.dual-chemistry.com/

9. https://www.analytik-jena.com/products/kits-assays-reagents/extraction-technology/

10. https://microgembio.com/pdqex/

Источник: https://pcr.news/stati/top-5-sovremennykh-metodik-vydeleniya-nukleinovykh-kislot/

Medic-studio
Добавить комментарий