ВЗЯТИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА: Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от

Микробиологические методы диагностики микозов

ВЗЯТИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА:  Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от

Каменск-Уральский филиал ГБОУ СПО СО «СОМК»

Реферат

на тему: «Методы микробиологической диагностики микозов»

Автор работы: студентка

101 группы ФО

Клементьева Л. И.

Преподаватель: Бичина Н. Ю.

2013

Введение…………………………………………………………………………3

1. Микозы………………………………………………………………………..4

2. Организация работы микробиологической лаборатории………………….5

3. Взятие и доставка патологического материала…………………………… 6

4. Методы микробиологической диагностики грибковых инфекций………..7

   4.1. Микроскопия…………………………………………………………..….7

          4.1.1. Неокрашенные препараты……………………………………..…7

          4.1.2. Окрашенные препараты……………………………………….….7

Список литературы………………………………………….…………………12

Введение

Микозы – широко распространенная и трудноизлечимая группа инфекций, вызванных большим числом видов различных патогенных и условно-патогенных грибов.

Клиническая картина грибковых заболеваний кожи весьма полиморфна, поэтому во всех случаях диагноз должен быть подтвержден лабораторными методами исследования. Для лабораторной диагностики микозов используют микроскопический, люминесцентный, культуральный, иммунологический (аллергологический и серологический) методы исследования, а также эксперименты на животных.

В своём реферате я хочу подробно рассказать об этих лабораторных методах диагностики микозов.

1. Микозы

Микозы – широкораспространённая группа инфекционных заболеваний, вызванных большим числом видов ( более 200) патогенных и условно- патогенных грибов.

Микоз развивается медленно, рецидивирует чаще, чем бактериальная инфекция, и не оставляет после себя длительного иммунитета.

Иногда грибковые инфекции сопровождаются лишь небольшим воспалением, но часто вызывают образование хронических абсцессов, язв или опухолеподобных гранулем, состоящих из соединительной ткани. Микозы могут иметь прогрессирующее течение и даже стать причиной смерти.

2. Организация работы микробиологической лаборатории

Устройство и режим работы микологической лаборатории должны обеспечивать предупреждение рассеивания патологического материала в окружающей среде, чтобы избежать заражения, аллергизации и распространения инфекции среди сотрудников и больных.

Лаборатория должна иметь определенный набор помещений, включая комнату (или специально оборудованное место) для приема и регистрации анализов, бокс-посевную для посева и работы с культурами, комнату с автоклавами для стерилизации и уничтожения патологического материала и культур, моечную, препараторскую, кладовую, гардероб для одежды, туалет. Пол и стены помещений, где проводится лабораторная диагностика микозов, должны выдерживать мытье дезинфицирующими растворами. Лаборатория укомплектовывается легко подвергающейся дезинфекции мебелью, включая шкафы для чистой лабораторной посуды, реактивов, питательных сред; соответствующим оборудованием и инструментами.

Для работы с патологическим материалом и культурами грибов лабораторные столы следует покрывать стеклами с частично окрашенной в черный цвет обратной стороной: на черном фоне лучше видны обычно светлые культуры грибов, а также мелкие частицы исследуемого материала. Часть стекла окрашивается в белый цвет, так как на белом фоне хорошо видны оттенки пигмента у исследуемых колоний. Иногда для этих целей под стекла подкладывают листы черной и белой бумаги.

Воздух в лаборатории стерилизуют дезинфицирующими аэрозолями или ультрафиолетовыми лучами.

Все посевы производят вблизи огня спиртовки или газовой горелки с обжиганием инструмента и краев пробирки. Засеянные пробирки и другие емкости должны иметь четкие надписи с указанием даты посева, номера анализа, вида и штамма возбудителя.

3. Взятие доставка патологического материала

Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала. Поскольку грибы способны поражать различные органы человека, при подозрении на микоз необходимо исследовать различный патологический материл.

В дерматологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат кожные чешуйки, волосы, ногти.

При подозрении на глубокие и системные микозы может возникнуть необходимость лабораторной диагностики на грибы мокроты, промывных вод, мочи, фекалий, гноя, отделяемого слизистых оболочек, крови, кусочков органов и биопсированной ткани.

Необходимо помнить, что любой изучаемый в лаборатории материал потенциально опасен. Взятие патологического материала следует производить в асептических условиях, в халатах и марлевых масках. Одежду больного при взятии материала защищают клеенчатой пелериной и салфеткой. Взятие материала с ног производят на специальной скамейке, покрытой клеенкой.

Пелерины, салфетки после каждого использования обеззараживают кипячением в течение 15 мин или погружением в дезраствор (5% раствор хлорамина на 3 ч или 5% осветленную хлорную известь –на 2 ч).

Патологический материал или культуры переносят в специальной таре (металлические или пластмассовые ящики с крышками, биксы), которую внутри и снаружи ежедневно обрабатывают дезрастворами.

4. Методы микробиологической диагностики грибковых инфекций

4.1. Микроскопия

Микроскопия — один из основных методов выявления возбудителей микозов.

Позволяет проводить экспресс-диагностику микозов и получать результат в течение 1-2 ч, тогда как для выделения культуры возбудителя необходимы недели.

Для экспресс – диагностики препараты часто необходимо окрашивать специальными красителями, так как простая окраска гематоксилином и эозином часто не позволяет выявить клетки грибов.

4.1.1.  Неокрашенные препараты

Микроскопия методом висячей или раздавленной капли. Метод позволяет выявить структуры грибов в клинических образцах без предварительного окрашивания.

Обработка 10% едким кали (КОН). Метод используют в первую очередь для визуализации структур возбудителей в фрагментах кожи и её придатках (ногти, волосы), отделяемом очагов поражения и влагалища. В указанных образцах содержится большое количество клеток, в которых КОН разрушает кератин, оставляя неизменёнными клетки грибов.

4.1.2.  Окрашенные препараты

•  Окраска по Граму. В мазках из клинического материала грибы представлены грамположительными клетками. Клетки Cryplococcus neoformans плохо воспринимают красители, что можно использовать как дифференциально-диагностический признак при микроскопии окрашенных мазков СМЖ.

•  Окраска нигрозином или тушью по Бурри мазков СМЖ позволяет выявить капсулированные клетки Cryptococcus neoformans. Для идентификации этого микроорганизма можно использовать муцикармин или конго красный.

•  Окраска по Романовскому – Гимзе или Райту мазков крови и костного мозга позволяет выявить дрожжевую форму Histoplasma capsulatum в цитоплазме фагоцитов.

•  Окраска метенаминовым серебряным по Гомори. Метод включает предварительную обработку гистологических препаратов хромовой кислотой с последующим нанесением красителя (клетки грибов тёмно-серые или чёрные).

•  Окраска по Гридли. Метод включает предварительную обработку препаратов хроматом лейкофуксина с последующим нанесением фуксинового альдегида и метанилового жёлтого (клетки грибов розово-пурпурные на жёлтом фоне).

•  Окрашивание перйодной кислотой и реактивом Шиффа (по Мак-Манусу). 1,2-Гликольные группировки полисахаридов клеточных стенок грибов сначала окисляются перйодной кислотой до альдегидов, реагирующих с сульфитом лейкофуксина реактива Шиффа; клетки окрашиваются в насыщенно розовый или красный цвет.

4.2. Культуральное исследование

Культуральное исследование является высокочувствительным и специфическим методом лабораторной диагностики микозов.

Его необходимо производить независимо от результатов микроскопии, так как культуральный метод позволяет иногда выявлять возбудителя при отрицательных данных микроскопии; он дает возможность определять род и вид возбудителя и, следовательно, проводить адекватную терапию и профилактику заболевания. Особенно полезен культуральный метод для диагностики латентных форм микозов, носительства дерматофитов здоровыми людьми.

Используют плотные и жидкие питательные среды (Сабуро, сусло-агар, Чапека и др.). Инкубация в термостате (22 – 28 .С) длительная (3 – 4 недели). Чистую культуру гриба идентифицируют по совокупности признаков: форме колоний, их цвету, консистенции, микроскопической картине (характер мицелия, расположение спор, конидиеносцев) и другим признакам.

4.3. Люминесцентное обследование

В 1925 г. Было обнаружено, что волосы, пораженные некоторыми дерматофитами, дают характерное свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Byда. Стекло Byда состоит из сульфата бария, содержит около 9% окиси никеля; оно пропускает лучи длиной 365 нм. В качестве источника ультрафиолетовых лучей можно использовать различные приборы.

Природа свечения точно не установлена. Волос продолжает светиться после гибели гриба и после попыток экстрагировать флюоресцирующий материал горячей водой или холодным раствором бромида натрия. Интенсивность и характер свечения зависят от рН раствора.

Полагают, что флюоресцирующая субстанция появляется в процессе взаимодействия гриба и растущего волоса.

Люминесцентный метод можно использовать как для диагностики и контроля над эффективностью лечения у отдельных больных, так и в эпидемиологических очагах. Компактные передвижные установки удобны для обследования контактных людей в школах, детских садах и т. п.

4.4. Иммунологическое исследование

Используют для выявления специфической перестройки организма и серологической диагностики грибковых заболеваний. Для обнаружения специфических антител в сыворотке пробы проводят следующие серологические реакции: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции с соответствующими антигенами.

Аллергическое состояние организма больного выявляют с помощью аллергических кожных проб. Аллергены наносят на скарифицированную кожу по Пирке или втиранием в кожу по Моро, внутрикожно по Манту, а также уколом в кожу. С помощью этих проб выявляют аллергические реакции как немедленного, так и замедленного типа, что позволяет оценить состояние гуморального и клеточного иммунитета.

Сопоставление результатов серологических и аллергических реакций оказывается полезным как для диагностики, так и для прогноза течения микозов.

Заключение 

Проблема микозов на сегодняшний день стоит достаточно остро. Во-первых, грибковые поражения обезображивают кожу больного, во-вторых, при заболевании происходит аллергизация организма, в-третьих, поражаются многие органы и ткани (системные микозы), происходит образование гранулем, нарушающих функции многих органов.

Современная медицина разработала средства, которые замедляют размножение грибков, но пока нет таких, которые бы полностью уничтожали их. Поэтому любая тема, касающаяся грибковых инфекций на сегодняшний день, будет важна.

В процессе работы с рефератом я изучила методы микробиологической диагностики микозов и убедилась, что данная тема актуальна на сегодняшний день, ведь от правильной постановки диагноза зависит точное лечение.

Список литературы

  1. Здоровье и медицина. «Общая характеристика грибов, грибковые заболевания кожи, вызываемые дерматофитами – Терапия и профилактика при онихомикозах» 2013 г.
  1. ООО “Медицинский центр «Авиценна». «Диагностика микозов с чувствительностью к патогенным грибковым препаратам (Candida, Trichosporon spp., Cryptococcus neoformans)» 2011 г.
  1. Copyright 2007-2012 Микробиология – в помощь микробиологу All Rights Reserved.

Источник: https://student.zoomru.ru/med/mikrobiologicheskie-metody-diagnostiki-mikozov/220197.1754999.s1.html

Взятие патологического материала

ВЗЯТИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА:  Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от

Успехлабораторного исследования микозов вомногом зависит от правильного взятияпатологического материала. Посколькугрибы способны поражать различныеорганы че­ловека, при подозрении намикоз необходимо исследовать различныйпатологический материл.

В дерматологическойпрактике чаще всего приходится иметьдело с микозами, при которых исследованиюна грибы подлежат кожные чешуйки, волосы,ногти.

При подозрении на глубокие исистемные микозы может возникнутьнеобходимость лабораторной диа­гностикина грибы мокроты, промывных вод, мочи,фекалий, гноя, отделяемого слизистыхоболочек, крови, кусочков орга­нов ибиопсированной ткани.

Вочагах поражения на коже, из которыхпредполагается брать патологическийматериал, за несколько дней или не­дельнеобходимо прекратить всякое лечение.Следует иметь в виду, что использованиеслабых дезинфицирующих раство­ровили даже индифферентных средств можетпомешать ис­следованию.

Непосредственноперед забором патологическо­гоматериала очаг поражения необходимообработать96% спиртомили раствором ксилола. Материал лучшевсего брать со свежих, но уже полностьюразвившихся очагов по­ражения. Кожныечешуйки необходимо соскабливать спе­риферии очагов, грибы здесьвстречаются чаще всего как в видемицелия, так и спор.

Кожные чешуйкиснимаются скальпелем, корочки -эпиляционным пинцетом. Наряду с чешуйкамижелательно забирать небольшую частьприлега­ющей к очагу поражения здоровойкожи, так как в этих на внешний виднормальных участках можно обнаружитьболь­шое количество элементов гриба.

При дисгидротических вы­сыпаниях дляанализа следует использовать покрышкипу­зырьков и крупные, с трудомотделяющиеся чешуйки на гра­ницеочагов поражения и здоровой кожи.Поверхностные корочки и чешуйки в центрекольцевидных высыпаний мало пригодныдля исследования, так как элементыгрибов здесь имеются непостоянно и ихбывает трудно отличить от фраг­ментовжирового распада тканей.

Скутулы прифавусе удоб­нее брать эпиляционнымпинцетом, они очень богаты гриба­миво всех своих частях. В случаях подозренияна грибко­вое поражение пушковыхволос, их необходимо извлекать эпиляционнымпинцетом по возможности вместе счешуй­кой. Грубые роговые массы сподошв срезают скальпелем или лезвиембезопасной бритвы.

Убольных микозами волосистой частиголовы поражен­ные волосы извлекаютэпиляционным пинцетом. Для исследованиянеобходимо брать короткие, перекрученные,изогну­тые в виде дуги или запятой, атакже длинные, но покрытые чехлом восновании, волосы. При подозрении нафавус необ­ходимо помнить о том, чтоволосы не обламываются, но ста­новятсятусклыми, безжизненными, седоватыми.

Там, где обломанные волосы плохо видныневооруженным глазом, нужно пользоватьсялупой и собирать с очагов поражениячешуйки, поскольку коротко обломанныеволосы могут иметь вид едва заметнойчерной точки, заложенной в толще роговойчешуйки. Если пораженные волосы имеютвид черных точек, то их извлекают наповерхность кожи или острым концомскальпеля, или препаровальной иглой.

Пораженныеволосы, взятые для микроскопическогоис­следования, желательно разложитьна предметном стекле на фоне чернойбумаги. В этом случае они резко отличаютсяот здоровых волос серым и тусклым цветом.

Привзятии материала необходимо исследоватькаждый, даже маленький очаг облысения,особенно у взрослых, так как грибковоепоражение на голове у них нередкосочетает­ся с мелкими участкамирубцовой алопеции.

Убольных с инфильтративно-нагноительнойформой ми­коза волосистой части головыи области роста бороды и усов (kerion,паразитный сикоз) очаги поражения частопокрыты массивными корками.

В этихслучаях отдельные поражен­ные волосывыявить трудно, они чаще встречаются всвежих высыпаниях, по краю очаговпоражения, в более глубоких от­делахкожи. Нередко они выталкиваются изволосяных фолликулов вместе с гноемпри надавливании на очаг пора­жения.

Волосы желательно брать вместе с гноем,затем по­местить на чашку Петри,часовое или предметное стекло, и отделитьволос от гноя.

Соскобыс поверхностных очагов пораженныхногтевых пластинок делают скальпелем,утолщенные ногтевые пластинки срезаютскальпелем или маникюрными кусачками;

подногтевойгиперкератоз можно получить с помощьюпре­паровальной иглы. Для взятияматериала из глубоких сло­ев через«окошечко» в ногтевой пластинке иногдапользуются бормашиной. При паронихияхнеобходимо брать гной из-под ногтевыхваликов; при отсутствии гноя—соскабливать материал с соприкасающихсяповерхностей ногтевой плас­тинки иваликов.

Жидкийпатологический материал собираютасептично в стерильную посуду, чешуйкикожи, ногтя и волосы – на листочкипростой или мягкой пергаментной бумаги.

Отделяемоесо слизистых оболочек для посева беруттампоном из гигроскопической ваты,который затем помеща­ют в сухуюстерильную пробирку или пробирку с2мл пи­тательной среды (сусло Сабуро).

Материал со слизистых оболочек рта изева берут вначале с внутреннейповерхнос­ти щек, неба, затем языка,тщательно протирая тампоном спинку икорень, а в заключение – круговымдвижением из зева.

Для микроскопиисоскобы налетов беловато-серовато­гоцвета со слизистых оболочек берутложечкой Фолькмана или предметнымстеклом. Материал из влагалища получаютиз заднего свода; с головки половогочлена – из области ве­нечной борозды.

Материализ наружного слухового прохода берутпетлей или тампоном, который помещаютв пробирку.

Принеобходимости полученный патологическиймате­риал доставляют в лабораториюв специальной таре или металлическихбиксах. Поступивший в лабораториюматериал исследуют в течение1ч после взятия при хранении в условияхкомнатной температуры или не более чемчерез3ч при хранении в холодильнике притемпературе4°С.

Взапаянных пробирках или пипетках жидкийпатологи­ческий материал сохраняетсядо высыхания довольно долго, грибы вволосах и чешуйках, завернутые в бумажныепакеты (типа аптечных порошков), могутсохраняться месяцы и да­же годы.

Кровьдля исследования на грибы берут излоктевой вены в количестве5 – 10мл и вносят сразу с колбочку с жидкойпитательной средой или равным количествомцитрата натрия.

Принеобходимости исследования на грибыбиопсийного материала его помещают встерильную чашечку Петри и используютдля микроскопии, посевов на питательныесреды и приготовления гистологическихпрепаратов.

Источник: https://studfile.net/preview/7240693/page:10/

Современная диагностика дерматофитозов в ветеринарии – статьи специалистов ИВЦ МВА им. К.И. Скрябина – ИВЦ МВА

ВЗЯТИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА:  Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от

Масимов Э.Н., к.б.н., ветеринарный врач ИВЦ МВА, г. Москва

В современном мире постоянно совершенствующихся высоких технологий и невиданных информационных потоков различные метаморфозы произошли не только с человеком, животными, но и с микробиотами, в том числе и относящимися к царству грибов – микромицетов.

К концу ХХ века лидирующее положение занял антропофильный дерматофитный гриб – красный трихофитон, вызывающий рубромикоз гладкой кожи и ногтей – онихомикоз.

Статистический анализ заболеваемости дерматомикозами за последнее десятилетие показал, что число больных во всем мпире, в том числе и в Росийской Федерации, ежегодно увеличивается. Распространенность этих заболеваний в популяции, по различным данным, приближается к 10%Б1.

В настоящее время дерматофитозы собак, кошек (микроспория, трихофития) широко распространены в нашей стране и других странах мира. Они занимают одно из ведущих мест (от 7 до 61%) в патологии кожи и ее производных.

Это связано с ростом численности бездомных животных, служащих основным источником возбудителя инфекции, высокой восприимчивостью собак к заражению, со способностью патогенных дерматофитов длительное время выдерживать неблагоприятные воздействия внешней среды, с отсутствием или несвоевременным проведением диагностических, лечебных и профилактических мероприятий5.

В последние годы подходы к диагностике грибковых заболеваний существенно изменились: если классический подход направлен только на обнаружение грибов-дерматофитов, то сейчас нам надо принимать во внимание резко возросшее видовое разнообразие потенциальных возбудителей (поэтому мы используем термин «дерматомикозы» вместо «дерматофитозы»)4.

Нередко, исходя из практики, к врачу специалисту в области ветеринарной дерматологии направляются пациенты, диагностика дерматофитозов у которых была проведена некорректно. В следствие чего назначено неправильное лечение, не имеющее соответственно положительной динамики. Владельцы уходят из клиники, появляются негативные отзывы, врач также недоволен собственной работой.

Клиническая картина дерматомикозов весьма полиморфна, поэтому во всех случаях диагноз должен быть подтвержден данными лабораторного исследования.

Для лабораторной диагностики дерматомикозов используют микроскопический, люминесцентный, культуральный, иммунологический методы исследования.

  Лабораторная диагностика дерматофитозов и дерматомикозов состоит из нескольких этапов.

В обычной клинической практике многие ветеринарные врачи ограничиваются микроскопическим и люминесцентным исследованием. При необходимости их дополняют культуральным исследованием.

Прежде, чем приступить к лабораторной диагностике дерматофитозов, ветеринарному врачу необходим тщательно собранный анамнез, список дифференциальных диагнозов.

Клинические симптомы дерматофитоза, вызванного например Microsporum canis у кошек могут варьировать от асимптоматического носительства до поражения кожи с образованием струпа.

Типичное проявление заболевания – единичные или множественные, быстро распространяющиеся кольцеобразные поражения округлой или неправильной формы, сопровождающиеся эритемой, чешуйками7.

  Дерматофитные мицетомы или псевдомицетомы являются подкожными узловыми или изьязвленными формами со свищевыми ходами, видимыми у персов и, иногда, у других длинношерстных пород2.  

Поскольку, клиническая картина может быть сильно вариабельна, дерматофитоз должен подозреваться почти у всех животных, но особенно кошек, которые имеют фокальную или мультифокальную алопецию, шелушение и корки; диффузную алопецию, себоррею и шелушение; узлы и свищевые ходы; воспаление, эритему, эрозии и язвы; и фолликулиты и фурункулезы2.

Самым частым патогеном у кошек является M.canis. У собак основными патогенами будут M.canis, M.gypseum и T.mentagrophytes. Стоит учитывать также географическую особенность для возникновения заболевания3.

Устройство и режим работы ветеринарной лаборатории являются важным, если не ключевым фактором в диагностике дерматофитии у животных. Лаборатория должна обеспечивать предупреждение рассеивания патологического материала в окружающей среде, чтобы избежать заражения и распространения инфекции.

Успех диагностики, в том числе и лабораторной, дерматофитозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала, а также выбранных методов диагностики. В ветеринарной дерматологии чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на патогены подлежат кожные чешуйки, волосы, когти.

За несколько дней или недель до исследования в очагах на коже, из которых предполагается брать патологический материал, необходимо прекратить всякое лечение1. 

Распространённая схема диагностики базируется на люминесцентном тесте и прямой микроскопии патологического материала.

Что касается первого метода, то он является ориентировочным и не может служить основанием для постановки диагноза, нередко даёт как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты, о чём большинство практикующих врачей осведомлены. В роли основного диагностического метода выступает микроскопия, главным достоинством которой является быстрота4.

Многие врачи пренебрегают предварительной обработкой участка, с которого будет набран материал. Непосредственно перед взятием патологического материала очаг поражения необходимо обработать 96% этанолом или раствором ксилитола. Материал лучше всего брать всего со свежих, но уже полностью развившихся очагов поражения.

В сравнительных исследованиях показано, что чувствительность микроскопического обнаружения артроспор дерматофитов не превышает 40%.

Ветеринарный врач, ориентируясь исключительно на грибы-дерматофиты, упускает из вида все остальные грибные элементы, которые могут присутствовать в патматериале – разнообразные споры и гифы недерматофитных «плесневых» грибов, клетки и псевдомицелий дрожжей, клеточные структуры актиномицетов4.

Микроскопическое исследование производят на обычном микроскопе без иммерсии. Препарат находят на стекле при малом увеличении х40, последующее исследование проводят на увеличении х100. Необходимо исследовать несколько препаратов, чтобы повысить надежность анализа и не получить ложноположительный результат.

Для более четкого выявления элемента гриба производят мацерацию материала с помощью щелочи КОН, NaOH. Гифы грибов набухают и можно заметить на волосяном стержне утолщенные участки с неровными контурами. Споры образуют “чехол” вокруг волоса и придают ему смутные очертания.

Рис.1 Микроскопия пораженного волоса

Рис.2 Микроскопия пораженного волоса

Культуральное исследование является высокочувствительным методом лабораторной диагностики дерматофитозов.

Данное исследование необходимо проводить независимо от результатов микроскопии, так как этот вариант диагностики позволяет выявлять возбудителя при отрицательных данных.

Данный вид исследования позволяет определить род, вид возбудителя. Особенно полезен данный метод для диагностики латентных форм заболевания, асимптоматического носительства.

Информативным является тест “Dermatophyte Test Medium” или DTM-агар, который содержит Сабуро-агар, циклогексимид, гентамицин и хлортетрациклин и индикатор рН-среды фенол-красный.

Рис.3 Среда DTM при проведении исследования.

Дерматофиты предпочитают поглощать протеины. Далее, образуют щелочные продукты обмена, которые изменяют цвет среды на красный.

Дерматофиты  продуцируют эти метаболиты в процессе роста колонии, и изменение окраски среды происходит через 2-7 дней после посева (иногда этот процесс занимает 14 дней).

Сапрофитные грибы метаболизируют углеводы, производя при этом нейтральные и кислые метаболиты, которые не меняют цвет среды. Правильно интерпретировать результат исследования можно только в случае ежедневного осмотра растущих колоний.

Следует учитывать, что чем больше фрагментов патматериала будет посеяно на среды, тем достовернее будут результаты. Данный вид исследования доступен как в специализированных лабораториях, так и в небольших ветеринарных лабораториях, при ветклиниках.

Иммунологические методы исследования используют для выявления специфической перестройки организма и серологической диагностики грибковых заболеваний.

Метод ПЦР, в котором выявляется геном возбудителя, поэтому ПЦР позволяет точно дифференцировать возбудителя.

Метод обладает высокой чувствительностью, поэтому даже минимальные количества возбудителя могут быть обнаружены в клиническом материале.

Сопоставление результатов серологических, культуральных и микроскопических исследований оказывается полезным для диагностики, и для прогнозирования течения дерматофитозов.

Следует уделить внимание и гистологическому исследованию. Патоморфологические изменения в очагах поражения обусловлены внедрением грибов в роговой слой эпидермиса, волосы и когти и ответной воспалительной реакцией кожи, которая может быть острой, подосторой или хронической.

Диагноз можно считать установленным только в том случае, если в гистологических препаратах обнаруживают элементы грибов. Собственно, грибы выявляются в небольшом количестве в виде нитей спор и мицелия.

Список литературы:

  • Разнатовский К.И., Родионов А.Н., Котрехова Л.П. Дерматомикозы. – СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2006
  • A color handbook of skin diseases of the dog and cat, Patrick J.McKeever, Rixhard G.Harvey. – Iowa State University press. 1999
  • Small animal dermatology, Karen Helton Rhodes, Alexander H.Werner. –  Wiley-blackwell, 2011
  • Журнал Vetpharma №4, 2012г.
  • Дерматофитозы собак в городах Сибири, Важенина Е.Г., автореферат, Барнаул 2007
  • Журнал Veterinary Focus №3, 2011
  • Материалы XVI Московского международного конгресса по болезням мелких домашних животных, Москва, 2008

Вернуться к списку

Источник: https://vetacademy.ru/obuchenie/stati/sovremennaya-diagnostika-dermatofitozov-v-veterinarii/

Взятие патологического материала: успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от

ВЗЯТИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА:  Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от

Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала. Поскольку грибы способны поражать различные органы человека, при подозрении на микоз необходимо исследовать различный патологический материл.

В дерматологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат кожные чешуйки, волосы, ногти.

При подозрении на глубокие и системные микозы может возникнуть необходимость лабораторной диагностики на грибы мокроты, промывных вод, мочи, фекалий, гноя, отделяемого слизистых оболочек, крови, кусочков органов и биопсированной ткани.

В очагах поражения на коже, из которых предполагается брать патологический материал, за несколько дней или недель необходимо прекратить всякое лечение. Следует иметь в виду, что использование слабых дезинфицирующих растворов или даже индифферентных средств может помешать исследованию.

Непосредственно перед забором патологического материала очаг поражения необходимо обработать 96% спиртом или раствором ксилола. Материал лучше всего брать со свежих, но уже полностью развившихся очагов поражения. Кожные чешуйки необходимо соскабливать с периферии очагов, грибы здесь встречаются чаще всего как в виде мицелия, так и спор.

Кожные чешуйки снимаются скальпелем, корочки – эпиляционным пинцетом. Наряду с чешуйками желательно забирать небольшую часть прилегающей к очагу поражения здоровой кожи, так как в этих на внешний вид нормальных участках можно обнаружить большое количество элементов гриба.

При дисгидротических высыпаниях для анализа следует использовать покрышки пузырьков и крупные, с трудом отделяющиеся чешуйки на границе очагов поражения и здоровой кожи.

Поверхностные корочки и чешуйки в центре кольцевидных высыпаний мало пригодны для исследования, так как элементы грибов здесь имеются непостоянно и их бывает трудно отличить от фрагментов жирового распада тканей. Скутулы при фавусе удобнее брать эпиляционным пинцетом, они очень богаты грибами во всех своих частях.

В случаях подозрения на грибковое поражение пушковых волос, их необходимо извлекать эпиляционным пинцетом по возможности вместе с чешуйкой. Грубые роговые массы с подошв срезают скальпелем или лезвием безопасной бритвы. У больных микозами волосистой части головы пораженные волосы извлекают эпиляционным пинцетом.

Для исследования необходимо брать короткие, перекрученные, изогнутые в виде дуги или запятой, а также длинные, но покрытые чехлом в основании, волосы. При подозрении на фавус необходимо помнить о том, что волосы не обламываются, но становятся тусклыми, безжизненными, седоватыми.

Там, где обломанные волосы плохо видны невооруженным глазом, нужно пользоваться лупой и собирать с очагов поражения чешуйки, поскольку коротко обломанные волосы могут иметь вид едва заметной черной точки, заложенной в толще роговой чешуйки. Если пораженные волосы имеют вид черных точек, то их извлекают на поверхность кожи или острым концом скальпеля, или препаровальной иглой. Пораженные волосы, взятые для микроскопического исследования, желательно разложить на предметном стекле на фоне черной бумаги. В этом случае они резко отличаются от здоровых волос серым и тусклым цветом. При взятии материала необходимо исследовать каждый, даже маленький очаг облысения, особенно у взрослых, так как грибковое поражение на голове у них нередко сочетается с мелкими участками рубцовой алопеции.

У больных с инфильтративно-нагноительной формой микоза волосистой части головы и области роста бороды и усов (kerion, паразитный сикоз) очаги поражения часто покрыты массивными корками. В этих случаях отдельные пораженные волосы выявить трудно, они чаще встречаются в свежих высыпаниях, по краю очагов поражения, в более глубоких отделах кожи.

Нередко они выталкиваются из волосяных фолликулов вместе с гноем при надавливании на очаг поражения. Волосы желательно брать вместе с гноем, затем поместить на чашку Петри, часовое или предметное стекло, и отделить волос от гноя. Соскобы с поверхностных очагов пораженных ногтевых пластинок делают скальпелем, утолщенные ногтевые пластинки срезают скальпелем или маникюрными кусачками; подногтевой гиперкератоз можно получить с помощью препаровальной иглы. Для взятия материала из глубоких слоев через «окошечко» в ногтевой пластинке иногда пользуются бормашиной. При паронихиях необходимо брать гной из-под ногтевых валиков; при отсутствии гноя — соскабливать материал с соприкасающихся поверхностей ногтевой пластинки и валиков. Жидкий патологический материал собирают асептично в стерильную посуду, чешуйки кожи, ногтя и волосы – на листочки простой или мягкой пергаментной бумаги. Отделяемое со слизистых оболочек для посева берут тампоном из гигроскопической ваты, который затем помещают в сухую стерильную пробирку или пробирку с 2 мл питательной среды (сусло Сабуро). Материал со слизистых оболочек рта и зева берут вначале с внутренней поверхности щек, неба, затем языка, тщательно протирая тампоном спинку и корень, а в заключение – круговым движением из зева. Для микроскопии соскобы налетов беловато-сероватого цвета со слизистых оболочек берут ложечкой Фолькмана или предметным стеклом. Материал из влагалища получают из заднего свода; с головки полового члена – из области венечной борозды. Материал из наружного слухового прохода берут петлей или тампоном, который помещают в пробирку. При необходимости полученный патологический материал доставляют в лабораторию в специальной таре или металлических биксах. Поступивший в лабораторию материал исследуют в течение 1 ч после взятия при хранении в условиях комнатной температуры или не более чем через 3 ч при хранении в холодильнике при температуре 4 °С. В запаянных пробирках или пипетках жидкий патологический материал сохраняется до высыхания довольно долго, грибы в волосах и чешуйках, завернутые в бумажные пакеты (типа аптечных порошков), могут сохраняться месяцы и даже годы. Кровь для исследования на грибы берут из локтевой вены в количестве 5 – 10 мл и вносят сразу с колбочку с жидкой питательной средой или равным количеством цитрата натрия.

При необходимости исследования на грибы биопсийного материала его помещают в стерильную чашечку Петри и используют для микроскопии, посевов на питательные среды и приготовления гистологических препаратов.

Источник: Родионов А.Н.. Грибковые заболевания кожи. 2000

Источник: https://med-books.info/venericheskie-bolezni-kojnyie/vzyatie-patologicheskogo-materiala.html

Забор патологического материала для диагностики микозов и его микроскопическое исследование

ВЗЯТИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА:  Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от

Для исследования можно брать чешуйки, пораженные волосы, покрышки пузырьков, гной из открытых очагов поражения, ногтевые пластинки, мокроту, кал, мочу, рвотные массы, желчь, тканевую жидкость.

От правильного взятия материала во многом зависит успех микроскопического исследования при дерматомикозах. Элементов гриба бывает обычно больше на свежих нелеченных, но уже сформированных участках поражения.

При микозах гладкой кожи для исследования берут чешуйки периферических участков очага путем соскабливания скальпелем. У больных дисгидрозом стоп, кистей ножницами или лезвием безопасной бритвы срезают покрышки пузырьков или бахромки отслоенного эпителия.

При дерматомикозах с поражением длинных и пушистых волос материал берут эпиляционным пинцетом, иногда – острием скальпеля, если волосы обломаны на уровне кожи. При инфильтративно-нагноительных процессах в периферии очага отбирают волосы, которые плавают в гное.

Гной берут фолькмановской ложечкой и переносят в чашку Петри или на часовое стекло. Препаровочной иглой вылавливают пораженные волосы и размещают на предметное стекло. Таким же образом собирают гной из открытых очагов поражения, свищей, а из закрытых – путем пункции шприцом.

Соскобы с пораженной слизистой оболочки берут стерильным шпателем, петлей, ножницами, маникюрными щипцами, а из более глубоких слоев – бормашиной.

При глубоких микозах для исследования берут мокроту, желчь, мочу, тканевую жидкость и вносят в стерильные стеклянные банки с притертой пробкой.

Иногда используют биопсию кусочков ткани, внося их в стерильные чашки Петри или стеклянные банки.

Взятый материал пересылают в лабораторию вместе с сопроводительным направлением, где указывают фамилию, имя и отчество больного, возраст, предварительный диагноз, локализацию поражения, характер и дату взятия материала.

Для микроскопии применяют нативные и окрашенные препараты. Существует несколько методов приготовления препаратов, в зависимости от характера исследуемого материала и вида дерматомикоза.

Наиболее простой метод лабораторной диагностики грибковых заболеваний состоит в следующем.

Пораженные волосы, ногтевые пластинки, плотные роговые массы, чешуйки измельчают на предметном стекле нагретым скальпелем и наносят на них 2-3 капли 10-30% раствора щелочей (КОН или NaOH).

Препарат подогревают над пламенем спиртовки, не доводя до кипения, пока не появится белый ободок по периферии, а потом, надавливая, накрывают покровным стеклом.

В некоторых случаях пораженные ногтевые пластинки, плотные роговые массы, биопсированные кусочки ткани исследуют методом обогащения по Черногубову. Материал обрабатывают на протяжении 20-30 мин. 20-процентным раствором щелочи с двукратным кипячением.

Для микроскопии используют осадок после центрифугирования. Желчь, тканевую жидкость, мочу центрифугируют и проводят микроскопию раздавленной капли. Гной, комки мокроты, кала вносят в каплю раствора Люголя в глицерине.

Рассматривают под простым или фазово-контрастным микроскопом, сначала под малым, потом – под большим увеличением, используя вогнутое зеркало, с обязательно прикрытой диафрагмой или опущенным конденсором.

При исследовании чешуек, роговых масс ногтей врач-лаборант может лишь указать, найден или не найден мицелий, а врач-миколог по клинической картине ставит диагноз заболевания и дополнительно проводит культуральное исследование.

При микроскопии пораженных грибом волос можно определить родовую принадлежность дерматофитов. При микроскопии споры размещены внутри в виде цепочки, а кутикула волос сохранена. В этом случае вывод врача-лабо- ранта должен быть таким: «Найден трихофитон эндотрикс».

При микроспории споры располагаются на поверхности и внутри волос хаотически в виде мозаики. Споры возбудителей инфильтративно-нагноительной трихофитии располагаются цепочками снаружи пораженных волос, причем споры фавиформного трихофитона большие, очень близкие по величине к возбудителю микроспории. В этих случаях врач-лаборант дает вывод: «Найден трихофитон эктотрикс крупноспоровый».

При фавусе в препарате обнаруживается полиморфизм элементов: разной толщины и длины нити мицелия, который разделен на фрагменты, разнообразные по величине, форме, взаимному расположению спор.

Наряду с этим, в препарате имеются негрибковые элементы: пузырьки воздуха, капельки жира.

Для диагностики глубокого микоза, чаще всего, готовят и исследуют окрашенные препараты, используя в качестве материала гной, выделения свищей, язв, соскобов грануляций и т.д.

Материал наносят тонким слоем на предметное стекло, грануляционную ткань предварительно расщепляют препаровочной иглой.

Приготовленные мазки фиксируют смесью Никифорова, 5-процентным водным раствором хромовой кислоты или смесью Кармует (10 г ледяной уксусной кислоты, 60 мл этилового спирта и 30 мл хлороформа), потом сушат и красят.

Окраска зависит от цели исследования. Чаще всего красят по Граму, Граму- Вельшу, Циль-Нильсену, Романовскому-Гимзе, Сабуро, Адамсону и др.

Многообразие клинических проявлений наиболее распространенных дерматомикозов (трихофития, микроспория, эпидермофития, руброфития), их различия в связи с локализацией процесса (волосистая часть головы, гладкая кожа, складки, ногти) усложняют диагностику. Поэтому в ряде случаев необходимо культуральное подтверждение диагноза. Правильное установление диагноза облегчает лечение, а главное – позволяет целенаправленно проводить эпидемиологические и профилактические мероприятия.

Источник: http://medpuls.net/guide/dermatovenereology/zabor-patologicheskogo-materiala-dlya-diagnostiki-mikozov-i-ego-mikroskopicheskoe-issledovanie

Лабораторная диагностика микозов * my dermatology

ВЗЯТИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА:  Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА МИКОЗОВ

Взятие материала для лабораторного исследования на грибок.

1.ОСТ 42-21-2-854: приказ № 222/80 от 27.06.002.Оснащение: пинцет, предметные стекла, ножницы, ложка фолькмана.4.Показания: грибковые заболевания.5.Осложнения: нет.Подготовка процедурного кабинета:Смена растворов.Приготовить:-1%р-р хлорамина для ветоши-3%р-р хлорамина – для дезинфекции перевязочного материала и пинцетов- моющий р-р (156 мл. перекиси водорода + 5 г. моющего порошка + 839 мл. дисцилированной воды) – для обработки пинцетов- 6% р-р перекиси водорода – для обработки перчаток.

Алгоритм выполнения манипуляции.

– нужно взять пинцет, предметное стекло, ложку фолькмана, ножницы;- пациента пригласить в перевязочную;- пациент сидит на стуле или кушетке;- м/с стоит.

Техника выполнения:

– из очага поражения пинцетом взять чешуйки кожи и волосы;- взятый материал положить на предметное стекло и закрыть другим предметным стеклом.- вымыть руки с мылом;- взятый материал отправить в лабораторию.

СБОР МАТЕРИАЛА

Взятие ногтей на исследование.– взять ножницы и предметные стекла;- ножницами отрезать кусочек от свободного края ногтя;

– взятый материал покрыть другим предметным стеклом;

– ножницы и пинцет замочить в 3% растворе формалина.

Правильный сбор материала из пораженных ногтей – залог успешного микробиологического исследования. Забирая материал, не всегда захватывают участки ногтя, содержащие жизнеспособные грибы. Нежизнеспособные грибы в культуре, естественно, не вырастут, и их вид установить не удастся.

Участок ногтя, который надо взять, определяется формой онихомикоза. Так, при поверхностной форме онихомикоза следует делать соскобы с поверхности ногтевой пластинки. При самой распространенной дистальной подногтевой форме наиболее жизнеспособные грибы располагаются под ногтевой пластинкой.

Материал, который направляют на исследование, должен включать не только обрезок ногтевой пластинки, но и соскоб с ногтевого ложа, из-под пластинки. Кроме того, следует захватывать и области неизмененного ногтя, поскольку на границе между ними и пораженными участками ногтя располагаются самые активные грибы.

При проксимальной подногтевой форме брать материал трудно. В этих случаях иногда, особенно если собираются проводить гистологическое исследование или дифференциальную диагностику, предпринимают биопсию ногтя, изредка используют бормашину. При паронихиях делают соскобы с проксимального валика и из-под него.

Во всех случаях, чтобы избежать бактериальной контаминации, перед взятием образца следует обработать ноготь этиловым спиртом.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Микроскопическое исследование патологического материала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах. Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала.

С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем самым делают грибы доступными для исследования.На размягченные чешуйки кожи или ногтя, которые помещают на середину предметного стекла, наносят 1-3 капли 20 – 30% раствора КОН (NaOH).

Исследуемый материал в каплях щелочи осторожно подогревают над пламенем спиртовки до появления нежного белого ободка из кристаллов щелочи по периферии капли. Подогревать до кипячения не следует. После подогревания каплю накрывают покровным стеклом, избегая попадания пузырьков воздуха. Р. А. Аравийский и Г. И.

Горшкова (1995) рекомендуют просветленные и накрытые покровным стеклом препараты кожных чешуек и волос оставлять на 5 – 10 мин, а ногтевых пластинок – на 30 – 40 мин до микроскопирования.

Просветление препаратов можно проводить без подогревания, для этого их оставляют в 20% растворе КОН на 30 – 60 мин или используют другие методы просветления патологического материала: хлораллактофенолом по Аману; лактофенолом; раствором, содержащим по 15% диметилсульфоксида и КОН в воде.

Хорошие результаты получают после просветления ногтевых пластинок, помещенных в 5% раствор КОН на 24 ч, подогревания в этом случае не требуется.Микроскопическое исследование производят на обычном лабораторном микроскопе без иммерсии.Конденсор микроскопа должен быть опущен, диафрагма сужена.

В начале препарат находят на стекле при малом увеличении (40х), последующее исследование производят при большем увеличении (100х); детально препарат изучают при увеличении 400х. Необходимо исследовать несколько препаратов с тем, чтобы увеличить надежность анализа и избежать ложноположительных результатов.

Ошибки в микроскопической диагностике грибов могут возникнуть в связи как с дефектами приготовления препарата, так и с недостаточной опытностью лаборанта.Дефекты изготовления прежде всего бывают связаны:с перегреванием препарата, что может привести к выпадению кристаллов щелочи, разрушению волоса и появлению мелкозернистого распада в патологическом материале.

Линейное расположение удлиненных ровных кристаллов щелочи весьма напоминает нити септированного мицелия даже на чистом стекле без патологического материала. Дифференциально-диагностическими признаками являются исключительное однообразие кристаллов, их стекловидная прозрачность, многогранность краев и отсутствие неразрывной связи одного элемента с другим. В сомнительных случаях рекомендуется добавить к препарату капельки слегка подогретой дистиллированной воды, которые быстро растворяют кристаллы щелочи.

За элементы гриба ошибочно могут быть приняты:

– капельки жира, – пузырьки воздуха, – хлопчатобумажные нити одежды – и так называемый «мозаичный грибок».Липиды кожных покровов, жировой распад клеток и зерна кератогиалина, особенно имеющие правильную форму, могут напоминать отдельные споры гриба.

Но разнообразие формы и, главное, размеров, отсутствие внутренней структуры образований (вакуоли, оболочки) говорят против грибковой природы данных элементов. Липиды также могут попасть в препарат при взятии патологического материала с недостаточно очищенного очага поражения.

Пузырьки воздуха могут напоминать споры дрожжеподобных клеток, но в отличие от последних они окружены плотной темной оболочкой, и даже самые маленькие пузырьки воздуха всегда больше клеток гриба.Нити от ткани носков, одежды и т. п. обычно лежат отдельно от патологического материала, они всегда больше гифов, грубее и не септированы.

«Мозаичный грибок» представляет собой артефакт, который возникает в процессе кристаллизации (возможно, за счет распада холестерина). Он имеет вид сеточки или петель, очертания которых соответствуют границам роговых чешуек, в отличие от нитей мицелия он никогда не пересекает стенки клеток эпидермиса.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 – 30% раствором КОН, в который добавляют 5 – 10% коммерческих темно-синих чернил фирмы Паркер (Parker's Superchrome Blue-Black Ink). При этой окраске гифы и споры окрашиваются в голубой цвет.

При микроскопии обнаруживают нитевидные гифы грибов или почкующиеся клетки (рис.1). Таким образом, микроскопия дает заключение только о грибковой природе инфекции, но не о виде гриба-возбудителя. Конечно, результативность микроскопического исследования зависит от квалификации сотрудника лаборатории.

Рис. 1. Микроскопия соскоба с ногтей, пораженных Т. rubrum. Видны гифы гриба.

КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Проводят посев материала на стандартную среду Сабуро, часто с добавками антибиотиков. В диагностике дерматофитных инфекций принято добавлять в среду Сабуро циклогексимид, подавляющий рост грибов-контаминантов, попадающих из воздуха. Существуют готовые коммерческие среды с добавками антибиотиков и циклогексимида.

Следует помнить, что многие плесневые грибы-недерматофиты и некоторые виды Candida не растут на среде с циклогексимидом, поэтому рекомендуется делать посев на среду Сабуро с циклогексимидом и на среду без него.

Идентификацию видов обычно проводят при микроскопическом исследовании выросшей культуры или путем пересева на селективные среды (рис. 2-15).

Рис. 2. Культура гриба Т. rubrum, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро (слева) и кукурузном агаре (справа).

Рис. 3. Культура гриба Т. mentagrophytes var. interdigitale, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 4. Культура гриба Candida albicans. Получена на среде Сабуро.

Рис. 5. Культура гриба Torulopsis glabrata, выделенного из пораженных ногтей. Получена на среде Сабуро.

Рис. 6. Культура гриба Ulocladium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 7. Микроморфология Acremonium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 8. Микроморфология Fusarium sp., вьщеленного из пораженных ногтей.

Рис. 9. Микроморфология Scopulariopsis sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 10. Микроморфология Candida albicans, выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 11. Микроморфология Altemaria sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 12. Микроморфология Aspergillus sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 13. Микроморфология Ulocladium sp , выделенного из пораженных ногтей.

Рис. 14. Микроморфология Chaetomium sp., выделенного из пораженных ногтей.

Рис 15.  Панель питательных фед для идентификации дерматофитов (слева – культура Т rubrum, справа – Т mentagrophytes var. mterdigitale).

Слева направо: среда Сабуро, среда Бакстера, среда Христенсена, кукурузный агар

Следует учесть, что некоторые плесневые грибы, в том числе дерматофиты, в культуре вырастают медленно, за 2-3 нед.

Даже при соблюдении всех правил сбора материала, при хорошем оборудовании лаборатории и высокой квалификации ее персонала число положительных результатов культурального исследования очень невелико.По данным зарубежной литературы, процент положительных исследований не превышает 50.

Процент положительных результатов в лучших отечественных лабораториях едва достигает 30.Таким образом, в 2 из каждых 3 случаев онихомикоза его этиологию установить не удается.

ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

В 1925 г. Margaret и Deveze обнаружили, что волосы, пораженные некоторыми дерматофитами, дают характерное свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Byда. Стекло Byда состоит из сульфата бария, содержит около 9% окиси никеля; оно пропускает лучи длиной 365 нм.

В качестве источника ультрафиолетовых лучей можно использовать различные приборы. Природа свечения точно не установлена. Волос продолжает светиться после гибели гриба и после попыток экстрагировать флюоресцирующий материал горячей водой или холодным раствором бромида натрия. Интенсивность и характер свечения зависят от рН раствора.

Полагают, что флюоресцирующая субстанция появляется в процессе взаимодействия гриба и растущего волоса.Свечение в ультрафиолетовых лучах, пропущенных через фильтр Вуда, характерно только для волос, пораженных грибами рода Microsporum (M. canis, M. audouinii, M. ferrugineum, M. distortium, изредка M. gypseum и M.

nanum), a также Trichophyton schonleinii. Волосы, пораженные микроспорумами, особенно M. canis и M. audouinii, дают наиболее яркое свечение; волосы, пораженные Т. schonleinii, имеют тусклую зеленоватую флюоресценцию.Свечение наблюдается только в полностью пораженных грибом волосах. Его может не быть в свежих очагах поражения.

В этих случаях следует эпилировать волосы из краевой, наиболее активной зоны, и свечение можно обнаружить в корневой части волос.Люминесцентный метод можно использовать как для диагностики и контроля за эффективностью лечения у отдельных больных, так и в эпидемиологических очагах.

Компактные передвижные установки удобны для обследования контактных людей в школах, детских садах и т. п.Люминесцентное обследование необходимо производить в затемненной комнате, очаги поражения должны быть предварительно очищены от корок, остатков мази и т. п.

Люминесцентный метод можно использовать для диагностики отрубевидного лишая, особенно при локализации очагов поражения на волосистой части головы. Очаги поражения при этом заболевании имеют красновато-желтое или бурое свечение.

Это свечение, однако, не является строго специфичным, так как может наблюдаться при наличии перхоти на волосистой части головы и даже у здоровых людей в области устьев волосяных фолликулов на лице и верхней части туловища. Выявленные с помощью люминесцентного метода пораженные волосы должны обязательно подвергаться микроскопическому исследованию.

ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ И БИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммунологические методы исследования используют для выявления специфической перестройки организма и серологической диагностики грибковых заболеваний.

Для обнаружения специфических антител в сыворотке пробы проводят следующие серологические реакции: агглютинации, преципитации, связывания комплемента, иммунофлюоресценции с соответствующими антигенами.Аллергическое состояние организма больного выявляют с помощью аллергических кожных проб.

Аллергены наносят на скарифицированную кожу по Пирке или втиранием в кожу по Моро, внутрикожно по Манту, а также уколом в кожу. С помощью этих проб выявляют аллергические реакции как немедленного, так и замедленного типа, что позволяет оценить состояние гуморального и клеточного иммунитета.

Для выявления специфической сенсибилизации лимфоцитов используют реакции дегрануляции базофилов, агломерации и альтерации, тест бластной трансформации, подавления миграции макрофагов и т. п.Сопоставление результатов серологических и аллергических реакций оказывается полезным как для диагностики, так и для прогноза течения микозов.

Биологический метод. Используется для лабораторной диагностики глубоких и особо опасных микозов. Основан на заражении животных патологическим материалом от больного или культурой исследуемого гриба. Осуществляется в специальных лабораториях.

ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Гистология микозов кожи, обусловленных дерматофитамиПатоморфологические изменения в очагах поражения обусловлены внедрением грибов в роговой слой эпидермиса, волосы и ногти и ответной воспалительной реакцией кожи, которая может быть острой, подострой или хронической.

Диагноз можно считать установленным только в том случае, если в гистологических препаратах обнаруживают элементы грибов.

Для этого используют различные гистологические окраски, наиболее информативной является периодическая кислотная реакция (PAS), позволяющая выявить полисахариды, имеющиеся в целлюлозе и хитине клеточной стенки большинства дерматофитов (окраска по Шифу и ее модификации). Можно также использовать реакции сульфатирования и импрегнацию гистологических срезов серебром [Хмельницкий О.

К., 1973; Lewer W. F. и Schaumburg-Lewerl.,1983].Грибы в роговом слое эпидермиса, даже при использовании специальных окрасок, выявляются в небольшом количестве в виде нитей мицелия и спор. В редких случаях, когда грибов в очагах поражения много, их можно обнаружить в срезах, окрашенных гемотоксилин-эозином, в виде нежных базофильных структур в роговом слое.

Воспалительные изменения в эпидермисе могут быть различными: от незначительного внутри- и внеклеточного отека шиповатых клеток до выраженного спонгиоза. Спонгиоз обычно развивается при дисгидротических вариантах микозов стоп и кистей, клинически в этих случаях отмечаются пузырьки. Причиной этой реакции обычно является Т. mentagrophytes var. interdigitale.

Иногда в эпидермисе отмечается выраженный гиперкератоз, что чаще всего наблюдается при микозе, обусловленном Т. rubrum.Гистологические изменения в дерме неспецифичны и соответствуют острому, подострому и хроническому воспалению.При микозе гладкой кожи, вызванном Т. rubrum, грибы иногда выявляются в пушковых волосах и волосяных фолликулах.

Вокруг фолликулов развивается воспалительная реакция, которая за счет попадания в дерму грибов может приобретать гранулематозный характер. Центральная часть инфильтрата в этих случаях может подвергаться нагноению и некрозу, а периферическая состоять из лимфоцитов, гистоцитов, эпителиоидных и многоядерных гигантских клеток, внутри которых иногда обнаруживаются споры гриба.

Размеры спор здесь достигают 6 мкм в диаметре, в волосе обычно не превышают 2 мкм.При инфильтративно-нагноительной форме микозов волосистой части головы и области роста бороды и усов элементы грибов обнаруживаются в волосяном фолликуле, внутри и вокруг волоса. В волосе они определяются чуть выше зоны начала кератинизации (примерно на уровне 30 мкм).

В дерме отмечают воспалительную реакцию различной интенсив­ности, наиболее выраженную при kerion Celsii. При острой гнойной реакции в составе инфильтрата отмечают большое количество нейтрофильных лейкоцитов, элементы грибов в этом случае могут полностью исчезать.

При хроническом те­чении процесса инфильтрат может приобретать гранулематозный характер, в нем появляются многоядерные гигантские клетки. Для подтверждения диагноза при отсутствии в инфильтрате грибов можно использовать иммунофлюоресцентные методы окраски. Для этих целей применяют меченную флюоресцином антисыворотку к Т.

mentagrophytes, которая позволяет обнаружить антигены гриба в волосе и в перифолликулярном инфильтрате.Формирование инфильтративно-нагноительной реакции кожи при микозе волосистой части головы (kerion Celsii) и области роста бороды и усов, обусловленных грибами М. саnis, Т. tonsurans и Т. verrucosum, представляет собой проявле­ние иммунологической реакции.

Об этом свидетельствуют:1. Склонность очагов поражения к спонтанному разрешению.2. Отсутствие элементов гриба при очень выраженной воспалительной реакции со стороны кожи при микозе, вызванном Т. verrucosum (faviforme) и Т. tonsurans.3.

Постоянная положительная реакция в ответ на внутрикожное введение трихофитина при инфильтративно-нагноительных формах микоза, вызванного зоофильными трихофитинами (например, Т. tonsurans), и отрицательная — при поверхностных микозах, обусловленных тем же Т. tonsurans.При фавусе в роговом слое эпидермиса обнаруживается большое количество нитей мицелия и единичные споры гриба.

Скутула представлена экссудатом, паракератотическими клетками эпидермиса, клетками воспалительного инфильтрата, а также нитями мицелия и спорами гриба, которые расположены преимущественно в периферической зоне скутулы.

В активной стадии болезни в дерме вокруг дегенеративных волосяных фолликулов отмечается выраженный воспалительный инфильтрат, содержащий многоядерные гигантские и плазматические клетки. В старых очагах поражения волосы и сальные железы отсутствуют, имеются явления фиброза.

Гистология микозов кожи и слизистых оболочек, обусловленных дрожжеподобными грибамиПри кандидозе кожи и слизистых оболочек грибы рода Candida обнаруживаются в роговом слое эпидермиса или в поверхностных слоях эпителия слизистой оболочки.

Элементов гриба обычно мало, они хорошо окрашиваются PAS-peакцией или по Граму; представлены в виде нитей септированного ветвящегося мицелия, размером 2-4 мкм в диаметре, или овоидными спорами, размером 3 – 5мкм в диаметре. Диагностическое значение имеет обнаружение мицелиальной формы гриба.

При гистологическом исследовании хронического гранулематозного кандидоза кожи и слизистых оболочек элементы гриба также преимущественно обнаруживают в роговом слое эпидермиса или в самых верхних отделах эпителия слизистой оболочки, но иногда в шиповатом слое, внутри волоса и в дерме.

Отмечается также выраженный гиперкератоз и папилломатоз; в дерме – густой воспалительный инфильтрат, состоящий из лимфоидных клеток, нейтрофилов, плазматических и многоядерных гигантских клеток. Инфильтрат может распространяться в подкожную жировую клетчатку.При отрубевидном лишае в роговом слое эпидермиса обнаруживают большое количество элементов гриба в виде нежных базофильных структур, которые хорошо видны даже при окраске препаратов гемотоксилин-эозином. Грибы представлены как нитями, так и спорами.При фолликулярной форме отрубевидного лишая отмечается скопление роговых масс и клеток воспалительного инфильтрата в расширенных устьях волосяных фолликулов. Вокруг фолликулов также отмечают воспалительный инфильтрат. При PAS-реакции сферические или овальные споры гриба, размером 2—4 мкм в диаметре, обнаруживают внутри устья волосяных фолликулов, а иногда в перифолликулярном инфильтрате. Мицелий никогда не выявляется.Нарушение пигментации кожи у больных отрубевидным лишаем обусловлено способностью гриба Pityrosporum вырабатывать субстанцию, которая угнетает процесс пигментообразования в эпидермисе. Электронно-микроскопическое изучение биоптатов кожи с гипопигментированных участков показало, что в меланоцитах образуются очень маленькие меланосомы, которые не способны проникать в кератиноциты. В гиперпигментированных участках кожи, наоборот, меланосомы крупные и содержат большое количество меланина.

Источник: https://dermatology.my1.ru/publ/diagnostika/mikrobiologija/23-1-0-628

Лабораторная диагностика микозов

ВЗЯТИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА:  Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от

Клиническая картина грибковых заболеваний кожи весь­ма полиморфна, поэтому во всех случаях диагноз должен быть подтвержден лабораторными методами исследования. Для лабораторной диагностики микозов используют микроскопический, люминесцентный, культуральный, иммунологический (аллергологический и серологический) методы иссле­дования, а также эксперименты на животных.

Лабораторная диагностика микозов складывается из не­скольких этапов. В обычной клинической практике обычно ограничиваются микроскопическим и культуральным иссле­дованием зараженного материала.

При необходимости эти методы дополняются иммунологическими, гистологическими исследованиями, заражением экспериментальных животных.

При некоторых микозах кожи важную вспомогательную роль в диагностике играет люминесцентный метод.

Взятие патологического материала.

Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала. Поскольку грибы способны поражать различные органы че­ловека, при подозрении на микоз необходимо исследовать различный патологический материл.

В дерматологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат кожные чешуйки, волосы, ногти.

При подозрении на глубокие и системные микозы может возникнуть необходимость лабораторной диа­гностики на грибы мокроты, промывных вод, мочи, фекалий, гноя, отделяемого слизистых оболочек, крови, кусочков орга­нов и биопсированной ткани.

В очагах поражения на коже, из которых предполагается брать патологический материал, за несколько дней или не­дель необходимо прекратить всякое лечение. Следует иметь в виду, что использование слабых дезинфицирующих раство­ров или даже индифферентных средств может помешать ис­следованию.

Непосредственно перед забором патологическо­го материала очаг поражения необходимо обработать 96% спиртом или раствором ксилола. Материал лучше всего брать со свежих, но уже полностью развившихся очагов по­ражения. Кожные чешуйки необходимо соскабливать с пе­риферии очагов, грибы здесь встречаются чаще всего как в виде мицелия, так и спор.

Кожные чешуйки снимаются скальпелем, корочки – эпиляционным пинцетом.

У больных микозами волосистой части головы поражен­ные волосы извлекают эпиляционным пинцетом. Для исследования необходимо брать короткие, перекрученные, изогну­тые в виде дуги или запятой, а также длинные, но покрытые чехлом в основании, волосы. При подозрении на фавус необ­ходимо помнить о том, что волосы не обламываются, но ста­новятся тусклыми, безжизненными, седоватыми.

Соскобы с поверхностных очагов пораженных ногтевых пластинок делают скальпелем, утолщенные ногтевые пластинки срезают скальпелем или маникюрными кусачками.

Жидкий патологический материал собирают асептично в стерильную посуду, чешуйки кожи, ногтя и волосы – на листочки простой или мягкой пергаментной бумаги.

Отделяемое со слизистых оболочек для посева берут тампоном из гигроскопической ваты, который затем помеща­ют в сухую стерильную пробирку или пробирку с 2 мл пи­тательной среды (сусло Сабуро). Материал из влагалища получают из заднего свода; с головки полового члена – из области ве­нечной борозды.

Материал из наружного слухового прохода берут петлей или тампоном, который помещают в пробирку.

Поступивший в лабораторию материал исследуют в течение 1 ч после взятия при хранении в условиях комнатной температуры или не более чем через 3 ч при хранении в холодильнике при температуре 4 °С.

Кровь для исследования на грибы берут из локтевой вены в количестве 5 – 10 мл и вносят сразу с колбочку с жидкой питательной средой или равным количеством цитрата натрия.

При необходимости исследования на грибы биопсийного материала его помещают в стерильную чашечку Петри и используют для микроскопии, посевов на питательные среды и приготовления гистологических препаратов.

Микроскопическое исследование.

Микроскопическое исследование патологического мате­риала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах. Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла.

Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала.

С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем са­мым делают грибы доступными для исследования.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 – 30% раство­ром КОН, в который добавляют 5 – 10% коммерческих тем­но-синих чернил фирмы Паркер (Parker”sSuperchromeBlue-BlackInk). При этой окраске гифы и споры окрашива­ются в голубой цвет.

Источник: https://megaobuchalka.ru/4/16957.html

Medic-studio
Добавить комментарий